Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
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इस काम का समर्थन किया है, भाग में, R01HL139796 और R01HL128847 CKB और RO1DE028297 और CBET1608058 DWM के लिए अनुदान ।

इस अध्ययन में जानवरों का उपयोग राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल संस्थागत पशु देखभाल और प्रोटोकॉल AR13-00030 के तहत उपयोग समिति के अनुसार किया गया ।
1. पल्मोनरी वाल्व एक्ससेशन
<ol><li>माउस विच्छेदन के ल...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

वेंट्रिकल्स को हटाने के दो प्रयोजनों में कार्य करता है। सबसे पहले, वायुमंडलीय दबाव के लिए वेंट्रिकल पक्ष को उजागर करना, जिससे केवल फेफड़े के वाल्व के धमनी पक्ष से एक ट्रांसवैलर दबाव को बंद करने की आवश्?...

पल्मोनरी वाल्व (पीवी) सही वेंट्रिकल और पल्मोनरी धमनी के बीच एकदिशात्मक रक्त प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए कार्य करता है। पल्मोनरी वाल्व विकृतियां जन्मजात हृदय रोग के कई रूपों से जुड़ी होती हैं। जन्मजात हृदय वाल्व रोग (एचवीडी) के लिए वर्तमान उपचार वाल्वुलर मरम्मत या वाल्व प्रतिस्थापन है, जो एक मरीज के जीवनकाल1में कई आक्रामक सर्जरी की आवश्यकता कर सकता है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि दिल के वाल्व का कार्य इसकी संरचना से प्राप्त होता है, जिसे अक्सर संरचना-कार्य सहसंबंधित के रूप में जाना जाता है। अधिक विशेष रूप से, दिल के ज्यामितीय और जैव यांत्रिक गुण इसके कार्य को निर्देशित करते हैं। यांत्रिक गुण, बदले में, ईसीएम की संरचना और संगठन द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। मुरीन हार्ट वाल्व के बायोमैकेनिकल गुणों का निर्धारण करने के लिए एक विधि विकसित करके, ट्रांसजेनिक पशु मॉडल का उपयोग हृदय वाल्व समारोह और शिथिलता2,3,4,5पर ईसीएम की भूमिका से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है।
मुरीन पशु मॉडल लंबे समय से आणविक अध्ययन के लिए मानक के रूप में माना जाता है क्योंकि ट्रांसजेनिक मॉडल अन्य प्रजातियों की तुलना में चूहों में अधिक आसानी से उपलब्ध हैं । मुरीन ट्रांसजेनिक मॉडल दिल वाल्व से संबंधित रोगों पर शोध के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करते हैं6। हालांकि, ज्यामिति और ईसीएम संगठन दोनों की विशेषता के लिए सर्जिकल विशेषज्ञता और इंस्ट्रूमेंटेशन आवश्यकताएं एचवीडी अनुसंधान की प्रगति में एक बड़ी बाधा रही हैं। साहित्य में हस्टोलॉजिकल डेटा मुरीन हार्ट वाल्व एक्सपेरिलिएलर मैट्रिक्स सामग्री में एक तस्वीर प्रदान करता है, लेकिन केवल 2डी छवियों के रूप में, और इसकी 3 डी वास्तुकला7,8का वर्णन करने में असमर्थ हैं। इसके अतिरिक्त, दिल वाल्व दोनों स्थानिक और अस्थायी विषम है, यह मुश्किल ECM संगठन के बारे में प्रयोगों में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए अगर नमूना और संरचना तय नहीं कर रहे हैं । पारंपरिक 3डी लक्षण वर्णन विधियां, जैसे एमआरआई या 3 डी इकोकार्डियोग्राफी, ईसीएम घटकों को हल करने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान नहीं करते हैं9,10।
यह काम पूरी तरह से सहसंबद्ध कार्यप्रवाह का विवरण देता है जहां कार्डियक चक्र के कारण अस्थायी विषमता को हाइड्रोस्टैटिक ट्रांसवैलर दबाव के साथ मुरीन पीवी की संरचना को ठीक करके संबोधित किया गया था। स्थानिक विषमता को विभिन्न लंबाई के तराजू में, विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों, विशेष रूप से माइक्रोन और सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से डेटा सेट दर्ज करके रुचि के क्षेत्रों का नमूनाकरण और डेटा सेट दर्ज करके ठीक से नियंत्रित किया गया था। डाउनस्ट्रीम नमूने के मार्गदर्शन के लिए μCT के साथ स्काउटिंग की यह विधि पहले प्रस्तावित की गई है, लेकिन क्योंकि फेफड़े के वाल्व लौकिक भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, सर्जिकल स्तर11पर नियंत्रण के एक अतिरिक्त स्तर की आवश्यकता थी।
वीवो अध्ययनों में मुरीन हार्ट वाल्व बायोमैकेनिक्स का वर्णन विरल हैं और इसके बजाय, विरूपण व्यवहार का वर्णन करते समय कम्प्यूटेशनल मॉडल पर भरोसा करते हैं। यह महत्वपूर्ण महत्व का है कि नैनोमीटर लंबाई पैमाने पर स्थानीय बाहुलर डेटा ज्यामिति और हृदय वाल्व के स्थान से संबंधित हो । यह, बदले में, यांत्रिक रूप से योगदान करने वाले ईसीएम प्रोटीन के मात्रात्मक, स्थानिक रूप से मैप किए गए वितरण प्रदान करता है, जिसका उपयोग मौजूदा बायोमैकेनिकलहार्ट वाल्व मॉडल12, 13,14को मजबूत करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

हृदय वाल्व संबंधित रोग (एचवीडी) के अंतर्निहित कारण मायावी हैं। मुरीन पशु मॉडल एचवीडी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं, हालांकि, कई लंबाई के तराजू में संरचना और संगठन को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए आवश्यक सर्जिकल और वाद्य विशेषज्ञता ने इसकी उन्नति को अवरुद्ध कर दिया है। यह काम विभिन्न लंबाई तराजू पर दिल के वाल्व को चित्रित करने के लिए मुरीन विच्छेदन, एन ब्लॉक धुंधला, नमूना प्रसंस्करण और सहसंबद्ध इमेजिंग प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। हाइड्रोस्टैटिक ट्रांसवैलिवुलर दबाव का उपयोग हृदय वाल्व संरचना को रासायनिक रूप से ठीक करके लौकिक विषमता को नियंत्रित करने के लिए किया जाता था। माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) का उपयोग हृदय वाल्व की ज्यामिति की पुष्टि करने और सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) के लिए आवश्यक डाउनस्ट्रीम नमूना प्रसंस्करण के लिए एक संदर्भ प्रदान करने के लिए किया गया था। एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीरियल एसईएम छवियों को अपने संगठन का स्थानीय 3 डी प्रतिनिधित्व प्रदान करने के लिए लिया गया और खंगाला गया। μCT और SBF-SEM इमेजिंग विधियों तो फेफड़े के वाल्व भर में स्थानिक भिन्नता को दूर करने के लिए सहसंबद्ध थे । हालांकि प्रस्तुत काम फेफड़े के वाल्व पर विशेष रूप से है, इस पद्धति जैविक प्रणालियों में पदानुक्रमित संगठन का वर्णन करने के लिए अपनाया जा सकता है और कई लंबाई तराजू में संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए निर्णायक है ।

दबाव टयूबिंग के लिए पल्मोनरी धमनी का एनास्टोमोसिस चित्रा 1 एमें दिखाया गया है । हाइड्रोस्टैटिक दबाव के आवेदन के बाद, फेफड़े के ट्रंक मूल रूप से(चित्रा 1B)को डिस्टर्ब करता है जो यह द?...

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Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

यहां, हम सकल संरचना और स्थानीय बाह्य मैट्रिक्स संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए मुरीन पल्मोनरी वाल्व की उत्तेजना, दबाव, निर्धारण और इमेजिंग के लिए एक सहसंबद्ध कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं।

मुरीन पल्मोनरी वाल्व के सहर्पेलेटिव इमेजिंग के लिए सर्जरी और नमूना प्रसंस्करण

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह संरचना कार्य के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो आम तौर पर अपनी अंतर्निहित विषमता के कारण मुश्किल है। नियंत्रित निर्धारण और सहसंबद्ध इमेजिंग का उपयोग कई लंबाई तराजू पर संरचना को पकड़ने के लिए किया जाता था। स्थानीय उच्च संकल्प छवियों तो फेफड़े वाल्व पर सटीक शारीरिक स्थान पर वापस मैप किया जा सकता है ।प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ ताई यी, राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में पुनर्योजी चिकित्सा के केंद्र में माइक्रोसर्जरी के निदेशक होंगे । माउस विच्छेदन के लिए आवश्यक उपकरणों को ऑटोक्लेव करके शुरू करें, जिसमें ठीक कैंची, माइक्रोफोर्स्प, माइक्रोवैस्कुलर क्लैंप, क्लैंप लगाने वाले संदंश, माइक्रोनीडल धारक, स्प्रिंग कैंची और रिट्रैक्टर्स शामिल हैं। एक वयस्क C57BL/6 माउस इच्छामृत्यु के बाद, यह एक ट्रे पर एक पृष्ठीय भारहीन स्थिति में जगह है, टेप के साथ अपने अंगों को सुरक्षित और थोराकोटॉमी प्रदर्शन करते हैं ।किसी भी अतिरिक्त एडीपोज ऊतक और प्रावरणी को हटाकर दिल का पर्दाफाश करें, फिर सही एट्रियम को हटा दें और कमरे के तापमान खारे समाधान के साथ बाएं वेंट्रिकल को छिद्रित करें। बेहतर वेना कावा, अवर वेना कावा, फेफड़े की धमनी, और महाधमनी को तोड़कर पूरे दिल को हटा दें, और वेंट्रिकलियल जंक्शन के ऊपर लगभग दो मिलीमीटर काटें, जो दबाव के लिए नाली के रूप में काम करेगा। वायुमंडलीय दबाव के लिए कक्षों का पर्दाफाश करने के लिए बाएं और दाएं वेंट्रिकल को हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि फेफड़े के ट्रंक संरचना वेंट्रिकल्स को हटाकर अप्रभावित है।पल्मोनरी धमनी के साथ एनास्टोमोज़ दबाव टयूबिंग, सिनोटुब्युबुलर जंक्शन और टयूबिंग के अंत के बीच लगभग एक मिलीमीटर की दूरी को छोड़कर पत्रक और फेफड़े के ट्रंक के बड़े आंदोलनों के लिए समायोजित किया जाता है। जलाशय को एक अनुरूप शारीरिक दबाव में ऊंचा करें और इसे खारे समाधान से भरें। यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लो-थ्रिक सिस्टम का परीक्षण करें कि कोई रुकावट या हवा के बुलबुले नहीं हैं।एनास्टोमोस्ड पल्मोनरी वाल्व में स्टॉपकॉक संलग्न करें और बहिर्वाह पथ को स्विच करके टयूबिंग के माध्यम से पर्याप्त प्रवाह सुनिश्चित करें। एक बार प्रवाह पर्याप्त होने के बाद, बहिर्वाह को एनास्टोमोस्ड पल्मोनरी वाल्व पर स्विच करें और ट्रंक डिस्टेंशन द्वारा पहचाने गए पल्मोनरी ट्रंक का दबाव सुनिश्चित करें। पल्मोनरी ट्रंक के दबाव की पुष्टि करने के बाद, धीरे-धीरे प्राथमिक स्थिर समाधान को शामिल करें जब तक कि खारे समाधान की जलाशय क्षमता का 25% शुद्ध न हो जाए।सुखाने को रोकने के लिए ऊतक के नमूने पर एक फिक्स्ड-लथपथ धुंध रखें। तीन घंटे के लिए फिक्सेटिव को दूर करें, लगातार दबाव बनाए रखने के लिए जलाशय को फिर से भरें। परफ्यूजन के बाद, एक सप्ताह तक उपयोग होने तक चार डिग्री सेल्सियस पर फिक्सेटिव समाधान में दिल के वाल्व को स्टोर करें।धुंधला करने के लिए, पांच मिनट के लिए ठंड 0.15 मोलर कैकोडाइल बफर के साथ तीन बार फिक्स्ड हार्ट वाल्व नमूना धोएं और 1.5 पोटेशियम फेरोसाइनाइड, 0.15 मोलर कैकोडिल, दो मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड, और एक घंटे के लिए बर्फ पर 2% ऑस्मियम टेट्रोषाइड के समाधान में दिल के वाल्व को पूरी तरह से जलमग्न कर दें। नमूनों को मामूली आंदोलन के साथ पांच मिनट के लिए एक ट्यूब में रखकर कमरे के तापमान डबल आसुत पानी के साथ धोएं। तीन और वॉश के बाद, नमूना को कमरे के तापमान पर फ़िल्टर किए गए थिओकार्बोहाइड्रेजाइड समाधान में रखें।20 मिनट के बाद, नमूना तीन बार पानी के साथ धोने के रूप में पहले प्रदर्शन किया । इसके बाद, नमूना को कमरे के तापमान पर 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में रखें। 30 मिनट के बाद, इसे पांच मिनट के लिए तीन बार पानी से धोएं और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1% यूरेसिल एसीटेट में नमूने को इनक्यूबेट करें।इस बीच, लीड नाइट्रेट का समाधान तैयार करें। अगले दिन, पहले प्रदर्शन के रूप में तीन बार धोने के कदम प्रदर्शन, तो 30 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर सीसा aspartate समाधान में दिल वाल्व ऊतक इनक्यूबेट । नमूनों को तीन बार और धोएं, फिर दिल के वाल्व ऊतकों पर एक धारावाहिक निर्जलीकरण उपचार करें, जिसमें पांच मिनट के लिए बर्फ पर ताजा तैयार 20, 50, 70 और 90% इथेनॉल के साथ एक धारावाहिक निर्जलीकरण उपचार किया जाता है, जिसके बाद 100% इथेनॉल के साथ दो बाद के उपचार होते हैं।निर्जलीकरण के बाद, ऊतकों को बर्फ के ठंडे एसीटोन में ले जाएं, फिर इसे 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ताजा एसीटोन में रखें। एम्बेडिंग के लिए, निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार राल मिश्रण बनाएं। ऊतकों को 25 से 75, 50 से 50 और 75 से 25 राल के बाद के उपचारों में दो घंटे के लिए एसीटोन मिश्रण रखें।अंत में, ऊतकों को रात भर 100% राल में रखें। अगले दिन, ऊतकों को ताजा 100% राल में रखें। दो घंटे के बाद, ऊतकों को एक एम्बेडिंग कैप्सूल में स्थानांतरित करें, ताजा 100% राल जोड़ें और इसे इलाज के लिए 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।हाइड्रोस्टैटिक प्रेशर के आवेदन से पहले और बाद में उत्पादित एनास्टोमोस्ड पल्मोनरी धमनी यहां दिखाई जाती है । पल्मोनरी ट्रंक विकिरण रूप से यह दर्शाता है कि फेफड़े के वाल्व पत्रक एक बंद विन्यास में हैं। माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी ने पल्मोनरी वाल्व की पुष्टि की।पत्रक बंद कर दिए गए थे और annulus परिपत्र था, जबकि अपर्याप्त फेफड़े वाल्व दबाव की डिग्री या तो निर्धारण या धमनी पतन से बदलती मनाया गया । माइक्रो सीटी वॉल्यूम प्रतिपादन आभासी क्रॉस-सेक्शन को टुकड़ा करने की दिशा और स्थान की पुष्टि करने के लिए ऑप्टिकल छवियों के साथ सहसंबद्ध किया गया था। उच्च संकल्प SBF SEM छवियों को एक पत्रक के भीतर एक स्थानीय क्षेत्र में लिया गया था जब नमूना ब्लॉक वांछित स्थान और अभिविन्यास पर था ।माइक्रो सीटी वॉल्यूम के बीच सहसंबद्ध छवियां वर्चुअल स्लाइस, कम-रिज़ॉल्यूशन और हाई-रेजोल्यूशन एसबीएफ एसईएम छवियों को यहां दिखाए गए हैं। पल्मोनरी वाल्व के एक खंडित क्षेत्र के 3 डी प्रतिनिधित्व में, एंडोथेलियल कोशिकाओं, वाल्वुलर इंटरस्टिटियल कोशिकाओं और बाह्य फाइबर जैसे बाह्य घटकों की पहचान की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, कृपया ध्यान रखें कि दबाव का प्रदर्शन महत्वपूर्ण है और उपज यथासंभव अधिक हो सुनिश्चित करेगी।

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JoVE Journal

Engineering

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