Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
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Questo lavoro è supportato, in parte, dalle sovvenzioni R01HL139796 e R01HL128847 a CKB e RO1DE028297 e CBET1608058 per DWM.

L'uso di animali in questo studio era in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Nationwide Children's Hospital ai sensi del protocollo AR13-00030.
1. Escissione della valvola polmonare
<ol><li>Autoclave gli strumenti necessari per la dissezione del mouse. Ciò include forbici fini, micro pinza, micro morsetti vascolari, pinza per l'applicazione di morsetti, portaasele, forbici a molla e riavvolgitori.</li>
	<li>Acclimatare tutti i topi per un minimo d...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

La rimozione dei ventricoli serve a due scopi. In primo luogo, esponendo il lato del ventricolo alla pressione atmosferica, quindi è sufficiente applicare una pressione transvalvolare dal lato arterioso della valvola polmonare per chiudere, e in secondo luogo, fornendo una base stabile per prevenire la torsione del tronco polmonare. Durante la pressurizzazione, il tronco polmonare si distende radialmente e inferiormente, rendendolo incline alla torsione, causando il collasso del tronco polmonare. Il precaricamento della...

La valvola polmonare (PV) serve a garantire il flusso sanguigno unidirezionale tra il ventricolo destro e l'arteria polmonare. Le malformazioni della valvola polmonare sono associate a diverse forme di cardiopatia congenita. L'attuale trattamento per la cardiopatia congenita delle valvole cardiache (HVD) è la riparazione valvolare o la sostituzione della valvola, che può richiedere più interventi chirurgici invasivi per tutta la vita di un paziente1. È stato ampiamente accettato che la funzione della valvola cardiaca deriva dalla sua struttura, spesso indicata come il correlato struttura-funzione. Più specificamente, le proprietà geometriche e biomeccaniche del cuore ne dettano la funzione. Le proprietà meccaniche, a loro volta, sono determinate dalla composizione e dall'organizzazione dell'ECM. Sviluppando un metodo per determinare le proprietà biomeccaniche delle valvole cardiache murine, i modelli animali transgenici possono essere utilizzati per interrogare il ruolo dell'ECM sulla funzione e la disfunzione della valvola cardiaca2,3,4,5.
Il modello animale murino è stato a lungo considerato lo standard per gli studi molecolari perché i modelli transgenici sono più facilmente disponibili nei topi rispetto ad altre specie. I modelli transgenici murini forniscono una piattaforma versatile per la ricerca di malattie correlate alle valvole cardiache6. Tuttavia, le competenze chirurgiche e i requisiti di strumentazione per caratterizzare sia la geometria che l'organizzazione ECM sono stati un grosso ostacolo nel progresso della ricerca HVD. I dati istologici in letteratura forniscono un'immagine nel contenuto della matrice extracellulare della valvola cardiaca murina, ma solo sotto forma di immagini 2D e non sono in grado di descrivere la sua architettura 3D7,8. Inoltre, la valvola cardiaca è sia spazialmente che temporalmente eterogenea, rendendo difficile trarre conclusioni tra gli esperimenti riguardanti l'organizzazione ECM se il campionamento e la conformazione non sono fissi. I metodi di caratterizzazione 3D convenzionali, come la risonanza magnetica o l'ecocardiografia 3D, non forniscono la risoluzione necessaria per risolvere i componenti ECM9,10.
Questo lavoro descrive un flusso di lavoro completamente correlato in cui l'eterogeneità temporale dovuta al ciclo cardiaco è stata affrontata fissando la conformazione del PV murino con la pressione idrostatica transvalvolare. L'eterogeneità spaziale è stata controllata con precisione campionando le regioni di interesse e registrando set di dati da diverse modalità di imaging, in particolare μCT e microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali, su diverse scale di lunghezza. Questo metodo di scouting con μCT per guidare il campionamento a valle è stato proposto in precedenza, ma poiché la valvola polmonare presenta variazioni temporali, è stato necessario un ulteriore livello di controllo sul livello chirurgico11.
Gli studi in vivo che descrivono la biomeccanica della valvola cardiaca murina sono scarsi e, invece, si basano su modelli computazionali quando descrivono il comportamento di deformazione. È di fondamentale importanza che i dati extracellulari locali sulla scala di lunghezza nanometrica siano correlati alla geometria e alla posizione della valvola cardiaca. Questo, a sua volta, fornisce distribuzioni quantificabili e mappate spazialmente di proteine ECM che contribuiscono meccanicamente, che possono essere utilizzate per rafforzare i modelli di valvole cardiache biomeccaniche esistenti12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

Le cause alla base della malattia correlata alle valvole cardiache (HVD) sono sfuggenti. I modelli animali murini forniscono uno strumento eccellente per studiare l'HVD, tuttavia, le competenze chirurgiche e strumentali necessarie per quantificare con precisione la struttura e l'organizzazione su più scale di lunghezza hanno stentato il suo avanzamento. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della dissezione murina, della colorazione in blocco, dell'elaborazione del campione e delle procedure di imaging correlative per rappresentare la valvola cardiaca a diverse scale di lunghezza. La pressione idrostatica transvalvolare è stata utilizzata per controllare l'eterogeneità temporale fissando chimicamente la conformazione della valvola cardiaca. La tomografia microcinesca (μCT) è stata utilizzata per confermare la geometria della valvola cardiaca e fornire un riferimento per l'elaborazione del campione a valle necessaria per la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM). Le immagini SEM seriali ad alta risoluzione della matrice extracellulare (ECM) sono state prese e ricostruite per fornire una rappresentazione 3D locale della sua organizzazione. I metodi di imaging μCT e SBF-SEM sono stati quindi correlati per superare la variazione spaziale attraverso la valvola polmonare. Sebbene il lavoro presentato sia esclusivamente sulla valvola polmonare, questa metodologia potrebbe essere adottata per descrivere l'organizzazione gerarchica nei sistemi biologici ed è fondamentale per la caratterizzazione strutturale su più scale di lunghezza.

L'anastomosi dell'arteria polmonare al tubo di pressurizzazione è mostrata in Figura 1A. Dopo l'applicazione della pressione idrostatica, il tronco polmonare si distende radialmente (Figura 1B) indicando che i lembi della valvola polmonare sono in configurazione chiusa. La conformazione della valvola polmonare è stata confermata da μCT. In questo caso, i volantini erano coapt (chiusi) e l'anulus era circolare (Figura 2A). <strong...

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Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Qui, descriviamo un flusso di lavoro correlativo per l'escissione, la pressurizzazione, la fissazione e l'imaging della valvola polmonare murina per determinare la conformazione grossolana e le strutture locali della matrice extracellulare.

Chirurgia ed elaborazione dei campioni per l'imaging correlativo della valvola polmonare murina

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Questo protocollo è significativo perché è progettato per rispondere a domande sulla struttura correlata alla funzione della valvola polmonare murina, che è generalmente complicata a causa della sua eterogeneità intrinseca. La fissazione controllata e l'imaging correlativo sono stati utilizzati per catturare la struttura su più scale di lunghezza. Le immagini locali ad alta risoluzione possono quindi essere mappate nella posizione anatomica precisa sulla valvola polmonare.A dimostrare la procedura sarà il Dr.Tai Yi, direttore della microchirurgia presso il Centro di Medicina Rigenerativa del Nationwide Children's Hospital. Inizia con l'autoclave degli strumenti necessari per la dissezione del mouse, tra cui forbici fini, microforze, morsetti microvascolari, pinze per l'applicazione di morsetti, portaasele, forbici a molla e riavvolgitori. Dopo l'eutanasia di un topo adulto C57BL/6, metterlo in una posizione reclinata dorsale su un vassoio, fissare gli arti con del nastro adesivo ed eseguire la toracotomia.Esporre il cuore rimuovendo il tessuto adiposo e la fascia in eccesso, quindi rimuovere l'atrio destro e perfondere il ventricolo sinistro con soluzione salina a temperatura ambiente. Rimuovere l'intero cuore tagliando la vena cava superiore, la vena cava inferiore, l'arteria polmonare e l'aorta e tagliare circa due millimetri sopra la giunzione ventricoloatriale, che fungerà da condotto per la pressurizzazione. Rimuovere i ventricoli sinistro e destro per esporre le camere alla pressione atmosferica, assicurando che la struttura del tronco polmonare non sia influenzata rimuovendo i ventricoli.Tubo di pressurizzazione dell'anastomosi con l'arteria polmonare, lasciando circa un millimetro di distanza tra la giunzione sinotubulare e l'estremità del tubo per accogliere grandi movimenti delle foglioline e del tronco polmonare. Elevare il serbatoio a una pressione fisiologica analoga e riempirlo con la soluzione salina. Testare il sistema di flusso per assicurarsi che non vi siano blocchi o bolle d'aria.Collegare un rubinetto alla valvola polmonare anastomosizzata e garantire un flusso adeguato attraverso il tubo commutando il tratto di deflusso. Una volta che il flusso è sufficiente, spostare il deflusso verso la valvola polmonare anastomosizzata e garantire la pressurizzazione del tronco polmonare identificato dalla distensione del tronco. Dopo aver confermato la pressurizzazione del tronco polmonare, incorporare gradualmente la soluzione fissativa primaria fino a quando il 25% della capacità del serbatoio della soluzione salina viene spurgato.Posizionare una garza imbevuta di fissativo sul campione di tessuto per evitare l'essiccazione. Perfondere il fissativo per tre ore, riempiendo il serbatoio per mantenere una pressione costante. Dopo la perfusione, conservare la valvola cardiaca nella soluzione fissativa a quattro gradi Celsius fino all'uso per un massimo di una settimana.Per la colorazione, lavare il campione di valvola cardiaca fissa tre volte con tampone di cacodilato molare freddo da 0,15 molari per cinque minuti e immergere completamente la valvola cardiaca in una soluzione di 1,5 ferrocianuro di potassio, 0,15 cacodilato molare, due cloruro di calcio millimolare e tetroxuro di osmio al 2% su ghiaccio per un'ora. Lavare i campioni con acqua doppia distillata a temperatura ambiente mettendoli in un tubo per cinque minuti con leggera agitazione. Dopo altri tre lavaggi, posizionare il campione in soluzione filtrata di tiocarboidrazide a temperatura ambiente.Dopo 20 minuti, lavare il campione tre volte con acqua come dimostrato in precedenza. Quindi, posizionare il campione in teossido di osmio al 2% a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavarlo con acqua tre volte per cinque minuti ciascuno e incubare il campione in acetato di uranile all'1% durante la notte a quattro gradi Celsius.Nel frattempo, preparare una soluzione di nitrato di piombo. Il giorno seguente, eseguire la fase di lavaggio tre volte come dimostrato in precedenza, quindi incubare il tessuto della valvola cardiaca in soluzione di aspartato di piombo a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Lavare i campioni altre tre volte, quindi eseguire un trattamento di disidratazione seriale sui tessuti della valvola cardiaca con etanolo al 20, 50, 70 e 90% appena preparato su ghiaccio per cinque minuti ciascuno, seguito da due trattamenti successivi con etanolo al 100%.Dopo la disidratazione, spostare i tessuti in acetone ghiacciato, quindi metterlo in acetone fresco a temperatura ambiente per 10 minuti. Per l'incorporamento, realizzare la miscela di resina secondo le specifiche del produttore. Posizionare i tessuti nei successivi trattamenti da 25 a 75, da 50 a 50 e da 75 a 25 resina a miscela di acetone per due ore ciascuno.Infine, posizionare i tessuti in resina al 100% durante la notte. Il giorno seguente, mettere i tessuti in resina fresca al 100%. Dopo due ore, trasferire i tessuti in una capsula incorporante, aggiungere resina fresca al 100% e metterla in un forno a 60 gradi Celsius per 48 ore per polimerizzare.L'arteria polmonare anastomosa asportata prima e dopo l'applicazione della pressione idrostatica è mostrata qui. Il tronco polmonare si distende radialmente indicando che i lembi della valvola polmonare sono in una configurazione chiusa. La tomografia microinciuta ha confermato la conferma della valvola polmonare.I foglietti sono stati chiusi e l'anulus era circolare, mentre sono stati osservati vari gradi di pressurizzazione inadeguata della valvola polmonare mediante fissazione o collasso arterioso. Il volume micro CT che rende le sezioni trasversali virtuali è stato correlato con immagini ottiche per confermare la direzione e la posizione di slicing. Le immagini SBF SEM ad alta risoluzione sono state scattate in una regione locale all'interno di un volantino quando il blocco del campione si trovava nella posizione e nell'orientamento desiderati.Le immagini correlate tra il volume micro CT che esegue il rendering di immagini virtuali slice, a bassa risoluzione e SBF SEM ad alta risoluzione sono mostrate qui. Nella rappresentazione 3D di una regione segmentata della valvola polmonare, possono essere identificati componenti extracellulari come cellule endoteliali, cellule interstiziali valvolari e fibre extracellulari. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'esecuzione della pressurizzazione è fondamentale e garantirà che la resa sia la più alta possibile.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

A stato solido innesto elettroliti Copolimero per Batterie di litio Applicazioni

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Ricerca

Ingegneria

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Separazione spaziale di conformatori molecolari e cluster

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

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