Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Dette arbeidet støttes blant annet av R01HL139796 og R01HL128847 tilskudd til CKB og RO1DE028297 og CBET1608058 for DWM.

Bruken av dyr i denne studien var i samsvar med Landsdekkende Barnesykehus institusjonelt dyrepleie- og bruksutvalg i henhold til protokoll AR13-00030.
1. Pulmonal ventil eksisjon
<ol><li>Autoklaver de nødvendige verktøyene som trengs for museredhandlingen. Dette inkluderer fin saks, mikro tang, mikrovaskulære klemmer, klemme påføring tang, mikroneedle holdere, vår saks og retraktorer.</li>
	<li>Akklimatisere alle mus i minst 2 uker før operasjonen. Fjern C57BL/6 mus, ca. 1 år, fra b...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

Fjerning av ventriklene tjener to formål. For det første, utsette ventrikelen side til atmosfærisk trykk, og dermed bare trenger å bruke et transvalvulært trykk fra arteriell side av lungeventilen for å lukke, og for det andre, gir en stabil base for å forhindre vridning av lungestammen. Under trykksetting distendene lungestammen radialt og dårligere, noe som gjør den utsatt for vridning, noe som forårsaker sammenbruddet av lungestammen. Forhåndslasting av lungeventilen med en saltløsning gir en ekstra kvalit...

Lungeventilen (PV) tjener til å sikre enveis blodstrøm mellom høyre ventrikel og lungearterien. Lungeklaff misdannelser er forbundet med flere former for medfødt hjertesykdom. Den nåværende behandlingen for medfødt hjerteklaffsykdom (HVD) er valvulær reparasjon eller ventilutskifting, noe som kan nødvendiggjøre flere invasive operasjoner gjennom pasientens levetid1. Det har blitt allment akseptert at hjerteklaffens funksjon er avledet fra strukturen, ofte referert til som strukturfunksjonen korrelerer. Mer spesifikt dikterer hjertets geometriske og biomekaniske egenskaper sin funksjon. De mekaniske egenskapene bestemmes i sin tur av sammensetningen og organiseringen av ECM. Ved å utvikle en metode for å bestemme de biomekaniske egenskapene til murine hjerteklaffer, kan transgene dyremodeller brukes til å forhøre ECM-rollen på hjerteklafffunksjon og dysfunksjon2,3,4,5.
Murindyrmodellen har lenge vært ansett som standarden for molekylære studier fordi transgene modeller er lettere tilgjengelige hos mus sammenlignet med andre arter. Murine transgene modeller gir en allsidig plattform for forskning av hjerteklaffrelaterte sykdommer6. Imidlertid har de kirurgiske kompetanse- og instrumenteringskravene for å karakterisere både geometrien og ECM-organisasjonen vært et stort hinder for å utvikle HVD-forskning. Hstologiske data i litteraturen gir et bilde i murin hjerteklaff ekstracellulært matriseinnhold, men bare i form av 2D-bilder, og kan ikke beskrive sin 3D-arkitektur7,8. I tillegg er hjerteklaffen både romlig og tidsmessig heterogen, noe som gjør det vanskelig å trekke konklusjoner på tvers av eksperimenter angående ECM-organisering hvis prøvetaking og konformasjon ikke er løst. Konvensjonelle 3D-karakteriseringsmetoder, for eksempel MR- eller 3D-ekkokardiografi, gir ikke den nødvendige oppløsningen for å løse ECM-komponenter9,10.
Dette arbeidet beskriver en fullstendig korrelativ arbeidsflyt der den tidsmessige heterogeniteten på grunn av hjertesyklusen ble adressert ved å fikse konformasjonen av murin PV med hydrostatisk transvalvulært trykk. Den romlige heterogeniteten ble kontrollert nettopp av prøvetakingsregioner av interesse og registrering av datasett fra forskjellige bildemodaliteter, spesielt μCT og seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi, på tvers av forskjellige lengdeskalaer. Denne metoden for speiding med μCT for å lede nedstrøms prøvetaking er foreslått tidligere, men fordi lungeventilen viser tidsvariasjon, var det nødvendig med et ekstra kontrollnivå på kirurgisk nivå11.
In vivo-studier som beskriver murin hjerteklaffbiomekanikk er sparsommelige og er i stedet avhengige av beregningsmodeller når de beskriver deformasjonsatferden. Det er av avgjørende betydning at lokale ekstracellulære data på nanometerlengdeskalaen er relatert til geometrien og plasseringen av hjerteklaffen. Dette gir i sin tur kvantifiserbare, romlig kartlagte distribusjoner av mekanisk medvirkende ECM-proteiner, som kan brukes til å forsterke eksisterende biomekaniske hjerteklaffmodeller12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

De underliggende årsakene til hjerteklaffrelatert sykdom (HVD) er unnvikende. Murine dyremodeller gir et utmerket verktøy for å studere HVD, men den kirurgiske og instrumentelle ekspertisen som kreves for å nøyaktig kvantifisere strukturen og organisasjonen på tvers av flere lengdeskalaer, har hindret utviklingen. Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av murin disseksjon, en blokkfarging, prøvebehandling og korrelative bildebehandlingsprosedyrer for fremstilling av hjerteklaffen i forskjellige lengdeskalaer. Hydrostatisk transvalvulært trykk ble brukt til å kontrollere den tidsmessige heterogeniteten ved kjemisk å fikse hjerteklaffkonformasjonen. Mikro-beregnet tomografi (μCT) ble brukt til å bekrefte geometrien til hjerteklaffen og gi en referanse for nedstrøms prøvebehandling som trengs for seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM). Høyoppløselige serielle SEM-bilder av den ekstracellulære matrisen (ECM) ble tatt og rekonstruert for å gi en lokal 3D-representasjon av organisasjonen. μCT- og SBF-SEM-avbildningsmetoder ble deretter korrelert for å overvinne den romlige variasjonen på tvers av lungeventilen. Selv om arbeidet som presenteres utelukkende er på lungeventilen, kan denne metoden vedtas for å beskrive den hierarkiske organisasjonen i biologiske systemer og er avgjørende for strukturell karakterisering på tvers av flere lengdeskalaer.

Anastomose i lungearterien til trykkslangen er vist i figur 1A. Etter påføring av hydrostatisk trykk distends lungestammen radialt (Figur 1B) som indikerer at lungeventilbrosjyrene er i lukket konfigurasjon. Pulmonal ventilkonformasjon ble bekreftet av μCT. I dette tilfellet var brosjyrene coapt (lukket) og annulus var sirkulær (Figur 2A). Figur 2B,C viser varierende grad av utilstr...

Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Her beskriver vi en korrelativ arbeidsflyt for eksisjon, trykk, fiksering og avbildning av murinpulmonalventilen for å bestemme bruttokonformasjonen og lokale ekstracellulære matrisestrukturer.

Kirurgi og prøvebehandling for korrelativ avbildning av murin lungeventilen

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Denne protokollen er viktig fordi den er designet for å svare på spørsmål om strukturfunksjonen korrelerer med murinpulmonalventilen, noe som generelt er vanskelig på grunn av dens iboende heterogenitet. Den kontrollerte fikseringen og korrelasjonsavbildningen ble brukt til å fange strukturen på flere lengdeskalaer. Lokale høyoppløselige bilder kan deretter kartlegges tilbake til den nøyaktige anatomiske plasseringen på lungeventilen.Demonstrere prosedyren vil være Dr.Tai Yi, direktør for mikrokirurgi i Center of Regenerative Medicine ved Nationwide Children's Hospital. Begynn med å autoklavere verktøyene som trengs for museredseksjonen, inkludert fin saks, mikroforceps, mikrovaskulære klemmer, klemme påføring av tang, mikroneedleholdere, vårsaks og retraktorer. Etter å ha euthanizing en voksen C57BL / 6 mus, plasser den i en dorsal recumbent posisjon på et brett, fest lemmer med tape og utfør thoracotomy.Utsett hjertet ved å fjerne overflødig fettvev og fascia, fjern deretter høyre atrium og perfuse venstre ventrikel med romtemperatur saltløsning. Fjern hele hjertet ved å kutte den overlegne vena cava, dårligere vena cava, lungearterie og aorta, og kutt omtrent to millimeter over ventriculoatrial krysset, som vil tjene som kanal for trykksetting. Fjern venstre og høyre ventrikler for å utsette kamrene for atmosfærisk trykk, og sørg for at lungestammestrukturen ikke påvirkes ved å fjerne ventriklene.Anastomose trykkslange med lungearterien, og etterlater omtrent en millimeter avstand mellom det sinotubulære krysset og enden av slangen for å imøtekomme store bevegelser av brosjyrer og lungestamme. Løft reservoaret til et analogt fysiologisk trykk og fyll det med saltoppløsningen. Test gjennomstrømningssystemet for å sikre at det ikke er blokkeringer eller luftbobler.Fest en stoppekran til den anastomoserte lungeventilen og sørg for tilstrekkelig strømning gjennom slangen ved å bytte utløpskanalen. Når strømmen er tilstrekkelig, bytt utløpet til den anastomosed lungeventilen og sørg for trykksetting av lungestammen identifisert av trunk distensjon. Etter å ha bekreftet trykksettingen av lungestammen, inkorporerer gradvis primær fikseringsløsning til 25% av reservoarkapasiteten til saltoppløsningen er renset.Plasser en fixative-gjennomvåt gasbind over vevsprøven for å forhindre tørking. Perfuse fixative i tre timer, påfylling av reservoaret for å opprettholde et konstant trykk. Etter perfusjon, lagre hjerteklaffen i fikseringsløsningen ved fire grader Celsius til bruk i opptil en uke.For farging, vask den faste hjerteklaffprøven tre ganger med kaldt 0,15 molar kaktocylatbuffer i fem minutter og senk hjerteklaffen helt ned i en løsning på 1,5 kaliumferrosyanid, 0,15 molar kaktocylat, to millimolar kalsiumklorid og 2% osmium tetroxide på is i en time. Vask prøvene med romtemperatur dobbelt destillert vann ved å plassere dem i et rør i fem minutter med liten agitasjon. Etter tre vasker, plasser prøven i filtrert tiokarbohydrazidoppløsning ved romtemperatur.Etter 20 minutter, vask prøven tre ganger med vann som vist tidligere. Deretter plasserer du prøven i 2% osmium tetroxide ved romtemperatur. Etter 30 minutter, vask den med vann tre ganger i fem minutter hver og inkuber prøven i 1% uranylacetat over natten ved fire grader Celsius.I mellomtiden, lag en løsning av blynitrat. Påfølgende dag, utfør vasketrinnet tre ganger som demonstrert tidligere, og inkuber deretter hjerteklaffvevet i bly aspartatoppløsning ved 60 grader Celsius i 30 minutter. Vask prøvene tre ganger til, utfør deretter en seriell dehydreringsbehandling på hjerteklaffvevet med nytilberedt 20, 50, 70 og 90% etanol på is i fem minutter hver, etterfulgt av to etterfølgende behandlinger med 100% etanol.Etter dehydrering, flytt vevet til iskald aceton, og legg det deretter i frisk aceton ved romtemperatur i 10 minutter. For innebygging, lag harpiksblandingen i henhold til produsentens spesifikasjoner. Plasser vev i etterfølgende behandlinger på 25 til 75, 50 til 50 og 75 til 25 harpiks til acetonblanding i to timer hver.Til slutt, plasser vevet i 100% harpiks over natten. Påfølgende dag, plasser vev i frisk 100% harpiks. Etter to timer, overfør vevet til en innebygd kapsel, tilsett frisk 100% harpiks og legg den i en 60 grader Celsius-ovn i 48 timer for å kurere.Den utskilte anastomosed lungearterien før og etter påføring av hydrostatisk trykk er vist her. Lungestammen distends radialt indikerer at lungeventilbrosjyrene er i en lukket konfigurasjon. Mikrocomputert tomografi bekreftet lungeventilbekreftelsen.Brosjyrene ble lukket og annulusene var sirkulære, mens varierende grad av utilstrekkelig lungeventiltrykk ved enten fiksering eller arteriell kollaps ble observert. Mikro-CT-volumgjengivelse av virtuelle tverrsnitt ble korrelert med optiske bilder for å bekrefte kutteretningen og plasseringen. Høyoppløselige SBF SEM-bilder ble tatt i en lokal region i et brosjyre da prøveblokken var på ønsket sted og retning.Korrelerte bilder mellom mikro-CT-volumgjengivelse av virtuelle stykker, lav oppløsning og SBF SEM-bilder med høy oppløsning vises her. I 3D-representasjon av et segmentert område av lungeventilen kan ekstracellulære komponenter som endotelceller, valvulære interstitialceller og ekstracellulære fibre identifiseres. Når du prøver denne protokollen, må du huske på at det å utføre trykksettingen er kritisk og vil sikre at utbyttet blir så høyt som mulig.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Solid-state podingskopolymeren Elektrolytter for litium batteri Applications

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Romlig separasjon av molekylære konforme og klynger

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Rask Imaging teknikken til å studere Drop Impact Dynamics of Non-Newtonske væsker

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

Electron Kanalisering Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Karakterisering

Misfit dislocations in heteroepitaxial layers of GaP grown on Si(001) substrates are characterized through use of electron channeling contrast imaging ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Bruk av en Multi-kupé Dynamic enkelt enzym Phantom for studier av Hyperpolariserte magnetisk resonans Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Wicking Tests for Unidirectional Fabrics: Measurements of Capillary Parameters to Evaluate Capillary Pressure in Liquid Composite Molding Processes

Transporterende tester for Enveisen Stoffer: Målinger av Capillary Parametere for å evaluere kapillartrykkdata i flytende kompositt støpeprosesser

During impregnation of a fibrous reinforcement in liquid composite molding (LCM) processes, capillary effects have to be understood in order to identify ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

Behandling av Bulk Nanocrystalline metaller ved US Army Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer (IBEX) for Radiomics

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer IBEX for Radiomics

Retningslinjer og erfaring med Imaging biomarkør Explorer (IBEX) for Radiomics

Imaging Biomarker Explorer (IBEX) is an open-source tool for medical imaging radiomics work. The purpose of this paper is to describe how to use IBEX's ...

Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

Fused Filament Fabrication FFF of Metal-Ceramic Components

Smeltet Filament fabrikasjon (FFF) av metall keramisk komponenter

Technical ceramics are widely used for industrial and research applications, as well as for consumer goods. Today, the demand for complex geometries with ...

Fabrication of Nanoheight Channels Incorporating Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate for Acoustic Nanofluidics

Fabrikasjon av nanohøydekanaler som omfatter overflateakustisk bølgeaktivering via litiumniobat for akustisk nanofluidikk

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...