Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Este trabalho é apoiado, em parte, pelas subvenções R01HL139796 e R01HL128847 para as bolsas CKB e RO1DE028297 e CBET1608058 para DWM.

O uso de animais neste estudo foi de acordo com o Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil Nacional sob o protocolo AR13-00030.
1. Excisão da válvula pulmonar
<ol><li>Autoclave as ferramentas necessárias para a dissecção do mouse. Isso inclui tesouras finas, micro fórceps, grampos micro vasculares, fórceps de fixação, suportes de microaclese, tesoura de mola e retratores.</li>
	<li>Aclimatar todos os ratos por um mínimo de 2 semanas antes da operaçã...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

A remoção dos ventrículos serve a dois propósitos. Primeiro, expondo o lado ventrículo à pressão atmosférica, precisando, assim, apenas aplicar uma pressão transvalvular do lado arterial da válvula pulmonar para fechar, e segundo, fornecendo uma base estável para evitar a torção do tronco pulmonar. Durante a pressurização, o tronco pulmonar distendida radialmente e inferiormente, tornando-o propenso a torção, causando o colapso do tronco pulmonar. A pré-carga da válvula pulmonar com uma solução salin...

A válvula pulmonar (PV) serve para garantir o fluxo sanguíneo unidirecional entre o ventrículo direito e a artéria pulmonar. Malformações da válvula pulmonar estão associadas a várias formas de doença cardíaca congênita. O tratamento atual para doença da válvula cardíaca congênita (HVD) é o reparo valvular ou substituição da válvula, que pode exigir múltiplas cirurgias invasivas ao longo da vida1do paciente . Tem sido amplamente aceito que a função da válvula cardíaca é derivada de sua estrutura, muitas vezes referida como a correlação estrutura-função. Mais especificamente, as propriedades geométricas e biomecânicas do coração ditam sua função. As propriedades mecânicas, por sua vez, são determinadas pela composição e organização do ECM. Ao desenvolver um método para determinar as propriedades biomecânicas das válvulas cardíacas murinas, modelos animais transgênicos podem ser usados para interrogar o papel do ECM na função da válvula cardíaca e disfunção2,3,4,5.
O modelo animal murino tem sido considerado como o padrão para estudos moleculares porque modelos transgênicos estão mais facilmente disponíveis em camundongos em comparação com outras espécies. Os modelos transgênicos de Murine fornecem uma plataforma versátil para pesquisar doenças relacionadas à válvula cardíaca6. No entanto, os requisitos de perícia cirúrgica e instrumentação para caracterizar tanto a geometria quanto a organização do ECM têm sido um grande obstáculo no progresso da pesquisa de HVD. Os dados hstológicos na literatura fornecem uma imagem no conteúdo de matriz extracelular da válvula cardíaca murina, mas apenas na forma de imagens 2D, e são incapazes de descrever sua arquitetura 3D7,8. Além disso, a válvula cardíaca é espacial e temporalmente heterogênea, dificultando a tiração de conclusões entre experimentos relativos à organização do ECM se a amostragem e a conformação não forem corrigidas. Métodos convencionais de caracterização 3D, como ressonância magnética ou ecocardiografia 3D, não fornecem a resolução necessária para resolver os componentes ECM9,10.
Este trabalho detalha um fluxo de trabalho totalmente correlativo onde a heterogeneidade temporal devido ao ciclo cardíaco foi abordada pela fixação da conformação do Pv murina com pressão transvalvular hidrostática. A heterogeneidade espacial foi controlada precisamente por regiões de amostragem de interesse e registro de conjuntos de dados de diferentes modalidades de imagem, especificamente μCT e microscopia eletrônica de varredura facial de blocos seriais, em diferentes escalas de comprimento. Este método de exploração com μCT para orientação da amostragem a jusante foi proposto anteriormente, mas como a válvula pulmonar apresenta variação temporal, foi necessário um nível adicional de controle no nível cirúrgico11.
Estudos in vivo descrevendo a biomecânica da válvula cardíaca murina são esparsas e, em vez disso, dependem de modelos computacionais ao descrever o comportamento de deformação. É de fundamental importância que os dados extracelulares locais sobre a escala de comprimento do nanômetro estejam relacionados com a geometria e localização da válvula cardíaca. Isso, por sua vez, fornece distribuições quantificáveis e espacialmente mapeadas de proteínas ECM que contribuem mecanicamente, que podem ser utilizadas para reforçar os modelos de válvula cardíaca biomecânica existentes12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

As causas subjacentes da doença relacionada à válvula cardíaca (HVD) são evasivas. Os modelos animais murinos fornecem uma excelente ferramenta para estudar HVD, no entanto, a perícia cirúrgica e instrumental necessária para quantificar com precisão a estrutura e a organização em múltiplas escalas de comprimento têm prejudicado seu avanço. Este trabalho fornece uma descrição detalhada da dissecção de murina, coloração em bloco, processamento de amostras e procedimentos de imagem correlativo para a representação da válvula cardíaca em diferentes escalas de comprimento. A pressão transvalvular hidrostática foi usada para controlar a heterogeneidade temporal fixando quimicamente a conformação da válvula cardíaca. A tomografia microcomputada (μCT) foi usada para confirmar a geometria da válvula cardíaca e fornecer uma referência para o processamento da amostra a jusante necessária para a microscopia eletrônica de varredura facial do bloco serial (SBF-SEM). Imagens sem em série de alta resolução da matriz extracelular (ECM) foram tiradas e reconstruídas para fornecer uma representação 3D local de sua organização. Os métodos de imagem μCT e SBF-SEM foram então correlacionados para superar a variação espacial através da válvula pulmonar. Embora o trabalho apresentado seja exclusivamente sobre a válvula pulmonar, essa metodologia poderia ser adotada para descrever a organização hierárquica em sistemas biológicos e é fundamental para a caracterização estrutural em múltiplas escalas de comprimento.

A anastomose da artéria pulmonar à tubulação de pressurização é mostrada na Figura 1A. Após a aplicação da pressão hidrostática, o tronco pulmonar distends radialmente(Figura 1B) indicando que os folhetos da válvula pulmonar estão em uma configuração fechada. A conformação da válvula pulmonar foi confirmada por μCT. Neste caso, os folhetos foram coapt (fechado) e o anulo foi circular(Figura 2A). <strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho correlativo para a excisão, pressurização, fixação e imagem da válvula pulmonar murina para determinar a conformação bruta e as estruturas da matriz extracelular local.

Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagem Correlativa da Válvula Pulmonar Murina

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Este protocolo é significativo porque é projetado para responder perguntas sobre a função estrutural correlaciona da válvula pulmonar murina, o que é geralmente complicado devido à sua heterogeneidade inerente. A fixação controlada e a imagem correlativa foram utilizadas para capturar a estrutura em múltiplas escalas de comprimento. Imagens locais de alta resolução podem então ser mapeadas de volta para o local anatômico preciso na válvula pulmonar.O médico que demonstrará o procedimento será o Dr. Tai Yi, diretor de Microcirurgia do Centro de Medicina Regenerativa do Hospital Infantil Nacional. Comece autoclavando as ferramentas necessárias para a dissecção do mouse, incluindo tesoura fina, microforceps, grampos microvasculares, fórceps de fixação, suportes de microavalente, tesoura de mola e retrações. Depois de eutanásia de um rato C57BL/6 adulto, coloque-o em uma posição dorsal recumbent em uma bandeja, fixe seus membros com fita e realize a toracotomia.Exponha o coração removendo qualquer excesso de tecido adiposo e fáscia, em seguida, remova o átrio direito e persutilize o ventrículo esquerdo com solução salina de temperatura ambiente. Remova todo o coração cortando a veia cava superior, veia cava inferior, artéria pulmonar e aorta, e corte aproximadamente dois milímetros acima da junção ventriculoatrial, que servirá como o conduíte para pressurização. Remova os ventrículos esquerdo e direito para expor as câmaras à pressão atmosférica, garantindo que a estrutura pulmonar do tronco não seja afetada pela remoção dos ventrículos.Tubo de pressurização anastomose com a artéria pulmonar, deixando uma distância de aproximadamente um milímetro entre a junção sinotubular e a extremidade da tubulação para acomodar grandes movimentos dos folhetos e tronco pulmonar. Eleve o reservatório a uma pressão fisiológica análoga e preencha-o com a solução salina. Teste o sistema de fluxo para garantir que não haja bloqueios ou bolhas de ar.Conecte uma torneira à válvula pulmonar anastomosa e garanta o fluxo adequado através da tubulação, comutando o trato de saída. Uma vez que o fluxo seja suficiente, troque a vazão para a válvula pulmonar anastomosa e garanta a pressurização do tronco pulmonar identificado pela distensão do tronco. Após a confirmação da pressurização do tronco pulmonar, incorpore gradualmente a solução fixativa primária até que 25% da capacidade do reservatório da solução salina seja expurgada.Coloque uma gaze fixada sobre a amostra de tecido para evitar a secagem. Perfunda o fixador por três horas, reabastecendo o reservatório para manter uma pressão constante. Após a perfusão, armazene a válvula cardíaca na solução fixativa a quatro graus Celsius até usar por até uma semana.Para coloração, lave a amostra fixa da válvula cardíaca três vezes com tampão de cacodilato molar frio de 0,15 por cinco minutos e submerse completamente a válvula cardíaca em uma solução de ferrocineto de potássio de 1,5 potássio, 0,15 cacodilato molar, dois cloreto de cálcio milimolar e 2% de tetroxida de ódio no gelo por uma hora. Lave as amostras com água destilada dupla à temperatura ambiente colocando-as em um tubo por cinco minutos com leve agitação. Depois de mais três lavagens, coloque a amostra em solução de tiocarbohydrazida filtrada à temperatura ambiente.Após 20 minutos, lave a amostra três vezes com água como demonstrado anteriormente. Em seguida, coloque a amostra em 2% de tetroxida de ósmio à temperatura ambiente. Após 30 minutos, lave-a com água três vezes por cinco minutos cada e incubar a amostra em acetato de 1%uranyl durante a noite a quatro graus Celsius.Enquanto isso, prepare uma solução de nitrato de chumbo. No dia seguinte, realize a etapa de lavagem três vezes como demonstrado anteriormente, em seguida, incubar o tecido da válvula cardíaca na solução de aspartato de chumbo a 60 graus Celsius por 30 minutos. Lave as amostras mais três vezes, depois realize um tratamento de desidratação em série nos tecidos da válvula cardíaca com 20, 50, 70 e 90% de etanol no gelo por cinco minutos cada, seguido por dois tratamentos subsequentes com 100% de etanol.Após a desidratação, mova os tecidos para acetona gelada e coloque-o em acetona fresca à temperatura ambiente por 10 minutos. Para incorporar, faça a mistura de resina de acordo com as especificações do fabricante. Coloque tecidos em tratamentos subsequentes de 25 a 75, 50 a 50 e 75 a 25 resina à mistura de acetona por duas horas cada.Por fim, coloque os tecidos em 100% de resina durante a noite. No dia seguinte, coloque tecidos em resina fresca de 100%. Após duas horas, transfira os tecidos para uma cápsula de incorporação, adicione resina fresca de 100% e coloque-a em um forno Celsius de 60 graus por 48 horas para curar.A artéria pulmonar anastomosada excizada antes e seguindo a aplicação da pressão hidrostática é mostrada aqui. O tronco pulmonar distends radialmente indicando que os folhetos da válvula pulmonar estão em uma configuração fechada. A tomografia microcomputada confirmou a confirmação da válvula pulmonar.Os folhetos foram fechados e o anulô foi circular enquanto foram observados graus variados de pressurização inadequada da válvula pulmonar por fixação ou colapso arterial. O volume micro CT que renderiza seções transversais virtuais foi correlacionado com imagens ópticas para confirmar a direção e localização do corte. Imagens SBF SEM de alta resolução foram tiradas em uma região local dentro de um folheto quando o bloco de espécimes estava no local e orientação desejados.Imagens correlacionadas entre o volume micro CT que renderiza fatia virtual, imagens SBF SEM de baixa resolução e alta resolução são mostradas aqui. Na representação 3D de uma região segmentada da válvula pulmonar, podem ser identificados componentes extracelulares como células endoteliais, células intersticiciais valvulares e fibras extracelulares. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que realizar a pressurização é fundamental e garantirá que o rendimento seja o mais alto possível.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Eletrólitos copolímero de enxerto de estado sólido para Aplicações da bateria de lítio

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Engenharia

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Separação Espacial de Conformadores Moleculares e Clusters

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Técnica rápida de imagens para o Estudo de Impacto Dynamics Gota de fluidos não-newtonianos

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

Electron Canalização Contraste de imagem para Rápido III-V heteroepitaxiais Caracterização

Misfit dislocations in heteroepitaxial layers of GaP grown on Si(001) substrates are characterized through use of electron channeling contrast imaging ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

O uso de um compartimento Multi-dinâmica única enzima Fantasma de Estudos de hyperpolarized agentes Ressonância Magnética

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Wicking Tests for Unidirectional Fabrics: Measurements of Capillary Parameters to Evaluate Capillary Pressure in Liquid Composite Molding Processes

Wicking testes para unidirecionais Tecidos: Medidas de capilar parâmetros para avaliar a pressão capilar em Processos Líquido Composite Moldagem

During impregnation of a fibrous reinforcement in liquid composite molding (LCM) processes, capillary effects have to be understood in order to identify ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

Processamento de metais de nanocristalina em massa no exército E.U. Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer (IBEX) for Radiomics

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer IBEX for Radiomics

Orientações e experiência usando a imagem latente biomarcador Explorer (IBEX) para Radiomics

Imaging Biomarker Explorer (IBEX) is an open-source tool for medical imaging radiomics work. The purpose of this paper is to describe how to use IBEX's ...

Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

Fused Filament Fabrication FFF of Metal-Ceramic Components

Fabricação de fundidos de filamento (FFF) de componentes de Metal-cerâmica

Technical ceramics are widely used for industrial and research applications, as well as for consumer goods. Today, the demand for complex geometries with ...

Fabrication of Nanoheight Channels Incorporating Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate for Acoustic Nanofluidics

Fabricação de canais de nanoaltura incorporando atuação de onda acústica superficial via Niobate de lítio para nanofluidos acústicos

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...