Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
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Este trabajo está respaldado, en parte, por las subvenciones R01HL139796 y R01HL128847 a CKB y RO1DE028297 y CBET1608058 para DWM.

El uso de animales en este estudio fue de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales del Nationwide Children's Hospital bajo el protocolo AR13-00030.
1. Escisión de la válvula pulmonar
<ol><li>Autoclave las herramientas necesarias para la disección del ratón. Esto incluye tijeras finas, micro pinzas, pinzas micro vasculares, pinzas de aplicación de pinzas, soportes para microagujas, tijeras de resorte y retractores.</li>
	<li>Aclimata a todos los ratones durante u...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

La extirpación de los ventrículos sirve para dos propósitos. Primero, exponer el lado del ventrículo a la presión atmosférica, por lo que solo necesita aplicar una presión transvalvular desde el lado arterial de la válvula pulmonar para cerrar, y segundo, proporcionar una base estable para evitar la torsión del tronco pulmonar. Durante la presurización, el tronco pulmonar se distiende radial e inferiormente, haciéndolo propenso a torcerse, causando el colapso del tronco pulmonar. La precarga de la válvula pul...

La válvula pulmonar (PV) sirve para asegurar el flujo sanguíneo unidireccional entre el ventrículo derecho y la arteria pulmonar. Las malformaciones de la válvula pulmonar se asocian con varias formas de cardiopatía congénita. El tratamiento actual para la enfermedad congénita de la válvula cardíaca (HVD) es la reparación valvular o el reemplazo de la válvula, que puede requerir múltiples cirugías invasivas a lo largo de la vida de un paciente1. Se ha aceptado ampliamente que la función de la válvula cardíaca se deriva de su estructura, a menudo conocida como el correlato estructura-función. Más específicamente, las propiedades geométricas y biomecánicas del corazón dictan su función. Las propiedades mecánicas, a su vez, están determinadas por la composición y organización del ECM. Mediante el desarrollo de un método para determinar las propiedades biomecánicas de las válvulas cardíacas murinas, se pueden utilizar modelos animales transgénicos para interrogar el papel de la ECM en la función y disfunción de las válvulas cardíacas2,3,4,5.
El modelo animal murino ha sido considerado durante mucho tiempo como el estándar para los estudios moleculares porque los modelos transgénicos están más fácilmente disponibles en ratones en comparación con otras especies. Los modelos transgénicos murinos proporcionan una plataforma versátil para la investigación de enfermedades relacionadas con las válvulas cardíacas6. Sin embargo, la experiencia quirúrgica y los requisitos de instrumentación para caracterizar tanto la geometría como la organización de ECM han sido un obstáculo importante en el progreso de la investigación de HVD. Los datos hstológicos en la literatura proporcionan una imagen del contenido de la matriz extracelular de la válvula cardíaca murina, pero solo en forma de imágenes 2D, y no pueden describir su arquitectura 3D7,8. Además, la válvula cardíaca es heterogénea tanto espacial como temporalmente, lo que dificulta sacar conclusiones a través de los experimentos con respecto a la organización de la ECM si el muestreo y la conformación no son fijos. Los métodos convencionales de caracterización 3D, como la resonancia magnética o la ecocardiografía 3D, no proporcionan la resolución necesaria para resolver los componentes de ecm9,10.
Este trabajo detalla un flujo de trabajo totalmente correlativo donde se abordó la heterogeneidad temporal debida al ciclo cardíaco fijando la conformación de la PV murina con presión transvalvular hidrostática. La heterogeneidad espacial se controló con precisión mediante el muestreo de regiones de interés y el registro de conjuntos de datos de diferentes modalidades de imagen, específicamente μCT y microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie, a través de diferentes escalas de longitud. Este método de exploración con μCT para guiar el muestreo aguas abajo se ha propuesto anteriormente, pero debido a que la válvula pulmonar exhibe variación temporal, se necesitaba un nivel adicional de control en el nivel quirúrgico11.
Los estudios in vivo que describen la biomecánica de la válvula cardíaca murina son escasos y, en cambio, se basan en modelos computacionales al describir el comportamiento de deformación. Es de vital importancia que los datos extracelulares locales en la escala de longitud nanométrica estén relacionados con la geometría y la ubicación de la válvula cardíaca. Esto, a su vez, proporciona distribuciones cuantificables y mapeadas espacialmente de proteínas ECM que contribuyen mecánicamente, que se pueden utilizar para reforzar los modelos biomecánicos existentes de válvulas cardíacas12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

Las causas subyacentes de la enfermedad relacionada con las válvulas cardíacas (HVD) son esquivas. Los modelos animales murinos proporcionan una excelente herramienta para estudiar la HVD, sin embargo, la experiencia quirúrgica e instrumental requerida para cuantificar con precisión la estructura y la organización en múltiples escalas de longitud han atrofiado su avance. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la disección murina, la tinción en bloque, el procesamiento de muestras y los procedimientos de imágenes correlativas para representar la válvula cardíaca en diferentes escalas de longitud. Se utilizó presión transvalvular hidrostática para controlar la heterogeneidad temporal mediante la fijación química de la conformación de la válvula cardíaca. Se utilizó la tomografía micro computarizada (μCT) para confirmar la geometría de la válvula cardíaca y proporcionar una referencia para el procesamiento de muestras aguas abajo necesario para la microscopía electrónica de barrido facial en bloque serie (SBF-SEM). Se tomaron y reconstruyeron imágenes SEM en serie de alta resolución de la matriz extracelular (ECM) para proporcionar una representación 3D local de su organización. Los métodos de imagen μCT y SBF-SEM se correlacionaron para superar la variación espacial a través de la válvula pulmonar. Aunque el trabajo presentado es exclusivamente sobre la válvula pulmonar, esta metodología podría adoptarse para describir la organización jerárquica en sistemas biológicos y es fundamental para la caracterización estructural a través de múltiples escalas de longitud.

La anastomosis de la arteria pulmonar al tubo de presurización se muestra en la Figura 1A. Después de la aplicación de presión hidrostática, el tronco pulmonar se distiende radialmente (Figura 1B) lo que indica que las valvas de la válvula pulmonar están en una configuración cerrada. La conformación de la válvula pulmonar se confirmó mediante μCT. En este caso, las valvas fueron coaptas (cerradas) y el anillo fue circular(Figura ...

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Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Aquí, describimos un flujo de trabajo correlativo para la escisión, presurización, fijación e imágenes de la válvula pulmonar murina para determinar la conformación macróstica y las estructuras locales de la matriz extracelular.

Cirugía y procesamiento de muestras para imágenes correlativas de la válvula pulmonar murina

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Este protocolo es significativo porque está diseñado para responder preguntas sobre el correlato de la función de la estructura de la válvula pulmonar murina, que generalmente es complicado debido a su heterogeneidad inherente. La fijación controlada y la imagen correlativa se utilizaron para capturar la estructura en múltiples escalas de longitud. Las imágenes locales de alta resolución se pueden mapear de nuevo a la ubicación anatómica precisa en la válvula pulmonar.Tai Yi, Director de Microcirugía en el Centro de Medicina Regenerativa del Nationwide Children's Hospital. Comience por autoclave las herramientas necesarias para la disección del ratón, incluidas tijeras finas, microfuerzas, abrazaderas microvasculares, pinzas de aplicación de pinzas, soportes para microagujas, tijeras de resorte y retractores. Después de sacrificar a un ratón adulto C57BL/6, colóquelo en una posición dorsal recosta en una bandeja, asegure sus extremidades con cinta adhesiva y realice la toracotomía.Exponga el corazón eliminando cualquier exceso de tejido adiposo y fascia, luego retire la aurícula derecha y perfunda el ventrículo izquierdo con solución salina a temperatura ambiente. Retire todo el corazón cortando la vena cava superior, la vena cava inferior, la arteria pulmonar y la aorta, y corte aproximadamente dos milímetros por encima de la unión ventriculoatrial, que servirá como conducto para la presurización. Retire los ventrículos izquierdo y derecho para exponer las cámaras a la presión atmosférica, asegurándose de que la estructura del tronco pulmonar no se vea afectada por la eliminación de los ventrículos.Tubo de presurización anastomosa con la arteria pulmonar, dejando aproximadamente una distancia milimétrica entre la unión sinotubular y el extremo del tubo para acomodar grandes movimientos de las valvas y el tronco pulmonar. Eleve el depósito a una presión fisiológica análoga y llénelo con la solución salina. Pruebe el sistema de flujo a través para asegurarse de que no haya obstrucciones o burbujas de aire.Conecte una llave de paso a la válvula pulmonar anastomosada y asegure un flujo adecuado a través de la tubería cambiando el tracto de salida. Una vez que el flujo sea suficiente, cambie el flujo de salida a la válvula pulmonar anastomosada y asegure la presurización del tronco pulmonar identificado por distensión del tronco. Después de confirmar la presurización del tronco pulmonar, incorporar gradualmente la solución fijadora primaria hasta purgar el 25% de la capacidad reservorio de la solución salina.Coloque una gasa empapada en fijador sobre la muestra de tejido para evitar que se seque. Perfundir el fijador durante tres horas, rellenando el depósito para mantener una presión constante. Después de la perfusión, guarde la válvula cardíaca en la solución fijadora a cuatro grados centígrados hasta que se use hasta por una semana.Para la tinción, lave la muestra fija de la válvula cardíaca tres veces con tampón de cacodilato molar frío de 0,15 durante cinco minutos y sumerja completamente la válvula cardíaca en una solución de 1,5 ferrocianuro de potasio, cacodilato molar de 0,15, cloruro de calcio milimolar y tetróxido de osmio al 2% en hielo durante una hora. Lave las muestras con agua destilada doble a temperatura ambiente colocándolas en un tubo durante cinco minutos con una ligera agitación. Después de tres lavados más, coloque la muestra en una solución de tiocarbohidrazida filtrada a temperatura ambiente.Después de 20 minutos, lave la muestra tres veces con agua como se demostró anteriormente. A continuación, coloque la muestra en tetróxido de osmio al 2% a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lávelo con agua tres veces durante cinco minutos cada una e incube la muestra en acetato de uranilo al 1% durante la noche a cuatro grados centígrados.Mientras tanto, prepare una solución de nitrato de plomo. Al día siguiente, realice el paso de lavado tres veces como se demostró anteriormente, luego incube el tejido de la válvula cardíaca en solución de aspartato de plomo a 60 grados Celsius durante 30 minutos. Lave las muestras tres veces más, luego realice un tratamiento de deshidratación en serie en los tejidos de las válvulas cardíacas con etanol 20, 50, 70 y 90% recién preparado en hielo durante cinco minutos cada uno, seguido de dos tratamientos posteriores con 100% etanol.Después de la deshidratación, mueva los tejidos a acetona helada, luego colóquela en acetona fresca a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para incrustar, haga la mezcla de resina de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Coloque los tejidos en tratamientos posteriores de 25 a 75, 50 a 50 y 75 a 25 mezcla de resina a acetona durante dos horas cada uno.Finalmente, coloque los tejidos en resina 100% durante la noche. Al día siguiente, coloque los pañuelos en resina fresca 100%. Después de dos horas, transfiera los tejidos a una cápsula de incrustación, agregue resina fresca 100% y colóquela en un horno de 60 grados Celsius durante 48 horas para curar.Aquí se muestra la arteria pulmonar anastomosada extirpada antes y después de la aplicación de presión hidrostática. El tronco pulmonar se distiende radialmente, lo que indica que las valvas de la válvula pulmonar están en una configuración cerrada. La tomografía microcomputada confirmó la confirmación de la válvula pulmonar.Las valvas se cerraron y el anillo fue circular, mientras que se observaron diversos grados de presurización inadecuada de la válvula pulmonar por fijación o colapso arterial. El volumen micro CT que renderiza secciones transversales virtuales se correlacionó con imágenes ópticas para confirmar la dirección y ubicación de corte. Las imágenes SBF SEM de alta resolución se tomaron en una región local dentro de un folleto cuando el bloque de muestra estaba en la ubicación y orientación deseadas.Aquí se muestran imágenes correlacionadas entre el segmento virtual de renderizado de volumen micro CT, imágenes SBF SEM de baja resolución y SBF de alta resolución. En la representación 3D de una región segmentada de la válvula pulmonar, se pueden identificar componentes extracelulares como células endoteliales, células intersticiales valvulares y fibras extracelulares. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que realizar la presurización es fundamental y garantizará que el rendimiento sea lo más alto posible.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Los electrolitos copolímero de injerto de estado sólido para aplicaciones de batería de litio

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Investigación

Ingeniería

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

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Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Técnica de escaneo rápido para el Estudio de impacto por caída de la Dinámica de Fluidos no newtonianos

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Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

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Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

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Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

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Fabricación de canales de nanoaltura que incorporan la actuación de onda acústica superficial a través de niobato de litio para nanofluídicos acústicos

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...