Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis av R01HL139796 och R01HL128847 bidrag till CKB och RO1DE028297 och CBET1608058 för DWM.

Användningen av djur i denna studie var i enlighet med Rikstäckande barnsjukhus institutionella djurvårds- och användningskommitté enligt protokoll AR13-00030.
1. Lungventil excision
<ol><li>Spara automatiskt de nödvändiga verktygen som behövs för musav dissekeringen. Detta inkluderar fin sax, mikrotång, mikrovaskulära klämmor, klämpliceringstångar, mikroneedlehållare, fjädersax och upprullningsdon.</li>
	<li>Acklimatisera alla möss i minst 2 veckor före operationen. Ta bor...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

Avlägsnande av ventriklarna tjänar två syften. Först exponera ventrikelsidan för atmosfärstrycket och behöver därmed bara applicera ett transvalvulärt tryck från lungventilens kranskärlssida för att stänga och för det andra, vilket ger en stabil bas för att förhindra vridning av lungstammen. Under trycksattisering distends lungstammen radiellt och sämre, vilket gör den benägen att vrida, vilket orsakar kollapsen av lungstammen. Förladdning av lungventilen med en saltlösning ger en extra kvalitetskont...

Lungventilen (PV) tjänar till att säkerställa enkelriktat blodflöde mellan rätt ventrikel och lungartären. Lungventil missbildningar är associerade med flera former av medfödd hjärtsjukdom. Den nuvarande behandlingen för medfödd hjärtklaffsjukdom (HVD) är valvulär reparation eller ventilbyte, vilket kan kräva flera invasiva operationer under patientens livstid1. Det har allmänt accepterats att hjärtklaffens funktion härrör från dess struktur, ofta kallad strukturfunktionen korrelerar. Mer specifikt dikterar hjärtats geometriska och biomekaniska egenskaper dess funktion. De mekaniska egenskaperna bestäms i sin tur av ECM: s sammansättning och organisation. Genom att utveckla en metod för att bestämma de biomekaniska egenskaperna hos murinhjärtaventiler kan transgena djurmodeller användas för att förhöra ECM: s roll på hjärtklaffens funktion och dysfunktion2,3,4,5.
Murindjursmodellen har länge betraktats som standard för molekylära studier eftersom transgena modeller är mer lättillgängliga hos möss jämfört med andra arter. Murin transgena modeller ger en mångsidig plattform för forskning av hjärtklaffrelaterade sjukdomar6. Men de kirurgiska kraven på expertis och instrumentering för att karakterisera både geometrin och ECM-organisationen har varit ett stort hinder för att gå vidare med HVD-forskningen. Hstologiska data i litteraturen ger en bild i murin hjärtklaff extracellulär matrisinnehåll, men endast i form av 2D-bilder, och kan inte beskriva dess 3D-arkitektur7,8. Dessutom är hjärtklaffen både rumsligt och tidsmässigt heterogen, vilket gör det svårt att dra slutsatser över experiment om ECM-organisation om provtagningen och konformationen inte är fixad. Konventionella 3D-karakteriseringsmetoder, såsom MRI eller 3D-ekokardiografi, ger inte den upplösning som krävs för att lösa ECM-komponenterna9,10.
Detta arbete beskriver ett helt korrelativt arbetsflöde där tidsmässiga heterogenitet på grund av hjärt cykeln åtgärdades genom att fastställa konformationen av murin PV med hydrostatiska transvalvular tryck. Den rumsliga heterogeniteten kontrollerades exakt av provtagningsregioner av intresse och registrering av datauppsättningar från olika bildframställningsmetoder, särskilt μCT och seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi, över olika längdskalor. Denna metod för scouting med μCT för styrning nedströms provtagning har föreslagits tidigare, men eftersom lungventilen uppvisar tidsvariation, behövdes en ytterligare kontrollnivå på kirurgisk nivå11.
In vivo-studier som beskriver murin hjärtklaff biomekanik är glesa och förlitar sig istället på beräkningsmodeller när man beskriver deformationsbeteendet. Det är av avgörande betydelse att lokala extracellulära data på nanometerlängdsskalan är relaterade till hjärtklaffens geometri och placering. Detta ger i sin tur kvantifierbara, rumsligt kartlagda fördelningar av mekaniskt bidragande ECM-proteiner, som kan användas för att förstärka befintliga biomekaniska hjärtklaffmodeller12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

De underliggande orsakerna till hjärtklaff relaterade-sjukdom (HVD) är svårfångade. Murine djurmodeller är ett utmärkt verktyg för att studera HVD, men den kirurgiska och instrumentella expertis som krävs för att exakt kvantifiera strukturen och organisationen över flera längdskalor har hämmat dess framsteg. Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av murin dissekering, en block färgning, prov bearbetning och korrelativa bildframställning förfaranden för att avbilda hjärtklaffen i olika längdskalor. Hydrostatiskt transvalvulärt tryck användes för att kontrollera temporal heterogenitet genom att kemiskt fixa hjärtklaffen konformation. Mikrotomografi (μCT) användes för att bekräfta hjärtklaffens geometri och ge en referens för den nedströms provbehandling som behövs för seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM). Högupplösta seriella SEM-bilder av den extracellulära matrisen (ECM) togs och rekonstruerades för att ge en lokal 3D-representation av sin organisation. μCT och SBF-SEM bildframställning metoder var sedan korrelerade för att övervinna rumsliga variationen över pulmonell ventilen. Även om det arbete som presenteras uteslutande är på lungventilen, kan denna metodik antas för att beskriva den hierarkiska organisationen i biologiska system och är avgörande för den strukturella karakteriseringen över flera längdskalor.

Lungartärens anastomos till tryckslangen visas i figur 1A. Efter applicering av hydrostatiskt tryck strålar lungstammen radiellt (figur 1B) vilket indikerar att lungventilbroschyrerna är i en sluten konfiguration. Pulmonell ventil konformation bekräftades av μCT. I detta fall var bipacksedlarna coapt (slutna) och annulusen var cirkulär (figur 2A). Figur 2B, C visar varierande grad...

Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Här beskriver vi ett korrelativt arbetsflöde för excision, trycksättning, fixering och avbildning av murinpulmonell ventilen för att bestämma bruttokonformationen och lokala extracellulära matrisstrukturer.

Kirurgi och provbehandling för korrelativ avbildning av murinpulmonellventilen

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det är utformat för att svara på frågor om strukturfunktionen korrelera av murinpulmonell ventilen, vilket i allmänhet är svårt på grund av dess inneboende heterogenitet. Den kontrollerade fixeringen och korrelativ avbildning användes för att fånga strukturen på flera längdskalor. Lokala högupplösta bilder kan sedan mappas tillbaka till den exakta anatomiska platsen på lungventilen.Visar förfarandet kommer att vara Dr.Tai Yi, chef för mikrokirurgi i Centrum för regenerativ medicin vid Rikstäckande barnsjukhus. Börja med att autoklavera de verktyg som behövs för musav dissekering, inklusive fin sax, mikroforceps, mikrovaskulära klämmor, kläm applicera tång, mikroneedlehållare, fjädersax och upprullningsdon. Efter att ha avlivat en vuxen C57BL/ 6-mus, placera den i en dorsal liggande position på en bricka, säkra benen med tejp och utför thoracotomin.Exponera hjärtat genom att ta bort överflödig fettvävnad och fascia, ta sedan bort rätt atrium och granska den vänstra ventrikeln med lösning för rumstemperatur saltlösning. Ta bort hela hjärtat genom att skära av den överlägsna vena cava, sämre vena cava, lungartären och aortan och skär ungefär två millimeter ovanför ventriculoatrial korsningen, som kommer att fungera som kanalen för trycksatthet. Ta bort vänster och höger ventriklarna för att utsätta kamrarna för atmosfärstryck, vilket säkerställer att lungstammens struktur inte påverkas genom att ta bort ventriklarna.Anastomos tryckslangar med lungartären, lämnar ungefär en millimeter avstånd mellan sinotubular korsningen och slutet av slangen för att rymma för stora rörelser i broschyrerna och lungstammen. Lyft behållaren till ett analogt fysiologiskt tryck och fyll den med saltlösningen. Testa genomflödessystemet för att säkerställa att det inte finns några blockeringar eller luftbubblor.Fäst en kran på den anastomoserade lungventilen och se till att det rinner ut genom slangen genom att byta utflödeskanal. När flödet är tillräckligt, byt utflödet till anastomosed lungventilen och säkerställa trycksattisering av lungstammen identifieras av båldistension. Efter att ha bekräftat trycksattentning av lungstammen, införliva gradvis primära fixativ lösning tills 25% av reservoarkapaciteten hos saltlösningen rensas.Placera en fixativt blötblöt gasväv över vävnadsprovet för att förhindra torkning. Granska fixeringen i tre timmar och fyll på behållaren för att upprätthålla ett konstant tryck. Efter perfusion, förvara hjärtklaffen i fixeringslösningen vid fyra grader Celsius tills den används i upp till en vecka.För färgning, tvätta det fasta hjärtklaffprovet tre gånger med kall 0,15 molar kakodylatbuffert i fem minuter och helt nedsänkt hjärtklaffen i en lösning av 1,5 kaliumferrocyanid, 0,15 molar kakodylat, två millimolar kalciumklorid och 2% osmium tetroxid på is i en timme. Tvätta proverna med dubbeldestillerat vatten i rumstemperatur genom att placera dem i ett rör i fem minuter med liten omrörning. Efter ytterligare tre tvättar, placera provet i filtrerad tioocarbohydrazidlösning vid rumstemperatur.Efter 20 minuter, tvätta provet tre gånger med vatten som visats tidigare. Placera sedan provet i 2%osmium tetroxid vid rumstemperatur. Efter 30 minuter, tvätta det med vatten tre gånger i fem minuter vardera och inkubera provet i 1%uranylacetat över natten vid fyra grader Celsius.Under tiden, förbered en lösning av blynitrat. Följande dag utför du tvättsteget tre gånger som visats tidigare och inkuberar sedan hjärtklaffvävnaden i bly aspartatelösning vid 60 grader Celsius i 30 minuter. Tvätta proverna ytterligare tre gånger och utför sedan en seriell uttorkningsbehandling på hjärtklaffvävnaderna med nyberedda 20, 50, 70 och 90% etanol på is i fem minuter vardera, följt av två efterföljande behandlingar med 100% etanol.Efter uttorkning, flytta vävnaderna till iskallt aceton och placera det sedan i färskt aceton vid rumstemperatur i 10 minuter. För inbäddning, gör hartsblandningen enligt tillverkarens specifikationer. Placera vävnader i efterföljande behandlingar av 25 till 75, 50 till 50 och 75 till 25 harts till acetonblandning i två timmar vardera.Slutligen placera vävnaderna i 100% harts över natten. Nästa dag, placera vävnader i färskt 100% harts. Efter två timmar, överför vävnaderna till en inbäddningskapsel, tillsätt färskt 100% harts och placera det i en 60 grader Celsius ugn i 48 timmar för att bota.Den strukna anastomosed pulmonell gatan före och efter tillämpningen av hydrostatiskt tryck visas här. Lungstammen distends radiellt anger att pulmonell ventil broschyrer är i en sluten konfiguration. Microdator datortomografi bekräftade pulmonell ventil bekräftelse.Broschyrerna stängdes och annulus var cirkulär medan varierande grader av otillräckliga pulmonell ventil trycksättning av antingen fixering eller kranskärlens kollaps observerades. Mikro-CT-volymen som återger virtuella tvärsnitt var korrelerade med optiska bilder för att bekräfta skivriktningen och platsen. Högupplösta SBF SEM-bilder togs i en lokal region i en broschyr när provblocket var på önskad plats och orientering.Korrelerade bilder mellan den virtuella mikro-CT-volymåtergivningen, lågupplösta och högupplösta SBF SEM-bilder visas här. I 3D representation av en segmenterad region av pulmonell ventil, extracellulära komponenter som endotelceller, valvular interstitiella celler och extracellulära fibrer kan identifieras. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att utföra tryck på trycksatten är avgörande och kommer att säkerställa att avkastningen är så hög som möjligt.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Solid-state ympsampolymer elektrolyter för applikationer litiumbatteri

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Rumslig separation av molekylära konformatorer och kluster

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Snabb bildteknik för att studera Drop Impact Dynamics av ​​icke-newtonska vätskor

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

Electron Kana Contrast Imaging för Rapid III-V heteroepitaxiell karakterisering

Misfit dislocations in heteroepitaxial layers of GaP grown on Si(001) substrates are characterized through use of electron channeling contrast imaging ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Användning av en flerfacks Dynamic enda enzym Phantom för studier av hyper Magnetic Resonance ombud

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Wicking Tests for Unidirectional Fabrics: Measurements of Capillary Parameters to Evaluate Capillary Pressure in Liquid Composite Molding Processes

Wicking Test för Enkelriktade Tyger: Mätning av Kapillär parametrar att utvärdera kapillärtrycket i Liquid Composite formningsprocesser

During impregnation of a fibrous reinforcement in liquid composite molding (LCM) processes, capillary effects have to be understood in order to identify ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

Bearbetning av Bulk nanokristallin metaller vid US Army Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer (IBEX) for Radiomics

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer IBEX for Radiomics

Riktlinjer och erfarenhet av att använda Imaging biomarkör Explorer (IBEX) för Radiomics

Imaging Biomarker Explorer (IBEX) is an open-source tool for medical imaging radiomics work. The purpose of this paper is to describe how to use IBEX's ...

Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

Fused Filament Fabrication FFF of Metal-Ceramic Components

Smält glödtråden Fabrication (FFF) av metall-keramiska komponenter

Technical ceramics are widely used for industrial and research applications, as well as for consumer goods. Today, the demand for complex geometries with ...

Fabrication of Nanoheight Channels Incorporating Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate for Acoustic Nanofluidics

Tillverkning av Nanoheight kanaler införliva Surface Acoustic Wave Actuation via Litium Niobat för akustisk nanofluidik

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...