Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Bu çalışma kısmen R01HL139796 ve R01HL128847 tarafından CKB ve RO1DE028297 ve DWM için CBET1608058 hibeleri tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışmada hayvanların kullanımı AR13-00030 protokolü kapsamında Nationwide Çocuk Hastanesi kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesine uygun olarak yapıldı.
1. Pulmoner kapak eksizyonu
<ol><li>Fare diseksiyonu için gereken gerekli araçları otoklavlav. Buna ince makas, mikro tokalar, mikro vasküler kelepçeler, toka uygulanan kelepçe, mikroneedle tutucular, yay makası ve retraktörler dahildir.</li>
	<li>Operasyondan önce tüm fareleri en az 2 hafta boyunca alıştır?...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

Ventriküllerin çıkarılması iki amaca hizmet eder. Birincisi, ventrikül tarafını atmosferik basınca maruz bırakmak, böylece sadece akciğer kapakçığının arteryal tarafından kapanmak için bir transvalvüler basınç uygulamak gerekir ve ikincisi, pulmoner gövdenin bükülmesini önlemek için kararlı bir taban sağlar. Basınçlandırma sırasında, pulmoner gövde radyal ve alt yönden dağılır, bükülmeye eğilimli hale getirir ve pulmoner gövdenin çökmesine neden olur. Pulmoner vananın tuzlu s...

Pulmoner kapak (PV), sağ ventrikül ile pulmoner arter arasında tek yönlü kan akışını sağlamaya yarar. Pulmoner kapak malformasyonları doğumsal kalp hastalığının çeşitli formları ile ilişkilidir. Konjenital kalp kapak hastalığının (HVD) mevcut tedavisi, bir hastanın ömrü boyunca birden fazla invaziv ameliyat gerektirebilen valvüler onarım veya kapak değişimidir1. Kalp kapakçığının işlevinin, genellikle yapı-fonksiyon korelasyon olarak adlandırılan yapısından türetildiği yaygın olarak kabul edilmiştir. Daha spesifik olarak, kalbin geometrik ve biyomekanik özellikleri işlevini belirler. Mekanik özellikler, sırayla, ECM'nin bileşimi ve organizasyonu tarafından belirlenir. Murine kalp kapakçıklarının biyomekanik özelliklerini belirlemek için bir yöntem geliştirerek, transgenik hayvan modelleri ECM'nin kalp kapak fonksiyonu ve disfonksiyonu üzerindeki rolünü sorgulamak için kullanılabilir2,3,4,5.
Murine hayvan modeli uzun zamandır moleküler çalışmalar için standart olarak kabul edilmektedir, çünkü transgenik modeller farelerde diğer türlere kıyasla daha hazırdır. Murine transgenik modeller kalp kapakçığı ile ilgili hastalıkları araştırmak için çok yönlü bir platform sağlar6. Bununla birlikte, hem geometriyi hem de ECM organizasyonunu karakterize etmek için cerrahi uzmanlık ve enstrümantasyon gereksinimleri, HVD araştırmalarının ilerlemesinde önemli bir engel olmuştur. Literatürdeki Hstolojik veriler, murine kalp kapakçığı hücre dışı matris içeriğine bir resim sağlar, ancak yalnızca 2B görüntüler şeklindedir ve 3D mimarisini tarif edemez7,8. Ek olarak, kalp kapakçığı hem mekansal hem de zamansal heterojendir, bu da örnekleme ve uygunluk düzeltilmezse ECM organizasyonu ile ilgili deneylerde sonuç çıkarmayı zorlaştırır. MRI veya 3D ekokardiyografi gibi geleneksel 3D karakterizasyon yöntemleri, ECM bileşenleri9,10'unçözümlenmesi için gerekli çözünürlüğü sağlamaz.
Bu çalışma, murine PV'nin hidrostatik transvalvüler basınçla uyumluluğunun sabitlenmesiyle kardiyak döngüye bağlı zamansal heterojenliğin ele alındığı tamamen korelatif bir iş akışını detaylandırmaktadır. Mekansal heterojenlik, ilgi çekici bölgeleri örneklemek ve farklı görüntüleme yöntemlerinden, özellikle μCT ve seri blok yüz tarama elektron mikroskopisinden farklı uzunluk ölçeklerinde veri setlerinin kaydedilmesiyle tam olarak kontrol edildi. Aşağı akış örneklemesine rehberlik etmek için μCT ile bu keşif yöntemi daha önce önerilmiştir, ancak pulmoner kapak zamansal varyasyon sergilediğinden, cerrahi seviye11'deek bir kontrol seviyesine ihtiyaç duyulmuştu.
Murine kalp kapak biyomekaniği tanımlayan in vivo çalışmalar seyrektir ve bunun yerine deformasyon davranışını tanımlarken hesaplamalı modellere dayanır. Nanometre uzunluğu ölçeğindeki yerel hücre dışı verilerin kalp kapakçığının geometrisi ve konumu ile ilgili olması kritik öneme sahiptir. Bu da, mevcut biyomekanik kalp kapak modellerini12, 13,14güçlendirmek için kullanılabilecek mekanik olarak katkıda bulunan ECM proteinlerinin ölçülebilir, mekansal olarak eşlenmiş dağılımlarını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

Kalp kapakçığı ile ilgili hastalığın (HVD) altında kalan nedenler zor bulunur. Murine hayvan modelleri HVD'yi incelemek için mükemmel bir araç sağlar, ancak yapıyı ve organizasyonu birden fazla uzunluk ölçeğinde doğru bir şekilde ölçmek için gereken cerrahi ve enstrümantal uzmanlık ilerlemesini engellemıştır. Bu çalışma, kalp kapakçığını farklı uzunluk ölçeklerinde tasvir etmek için murine diseksiyonu, en blok boyama, örnek işleme ve korelatif görüntüleme prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktadır. Hidrostatik transvalvüler basınç, kalp kapak konformasyonunu kimyasal olarak sabitlenerek zamansal heterojenliği kontrol etmek için kullanıldı. Kalp kapakçığının geometrisini doğrulamak ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM) için gereken aşağı akış numune işleme için referans sağlamak için mikro bilgisayarlı tomografi (μCT) kullanılmıştır. Hücre dışı matrisin (ECM) yüksek çözünürlüklü seri SEM görüntüleri alındı ve kuruluşunun yerel bir 3D gösterimini sağlamak için yeniden inşa edildi. Daha sonra pulmoner kapak boyunca mekansal varyasyonun üstesinden gelmek için μCT ve SBF-SEM görüntüleme yöntemleri korelasyona uğramıştır. Sunulan çalışma sadece pulmoner kapak üzerinde olmasına rağmen, bu metodoloji biyolojik sistemlerdeki hiyerarşik organizasyonu tanımlamak için benimsenebilir ve birden fazla uzunluk ölçeğinde yapısal karakterizasyon için çok önemlidir.

Pulmoner arterin basınç tüpüne anastomozu Şekil 1A'dagösterilmiştir. Hidrostatik basınç uygulamasını takiben, pulmoner gövde, pulmoner valf broşürlerinin kapalı bir konfigürasyonda olduğunu gösteren radyal olarak(Şekil 1B)dağılır. Pulmoner kapak uyumu μCT ile doğrulandı. Bu durumda, broşürler coapt (kapalı) ve annulus dairesel (Şekil 2A). Şekil 2B,C, fiksas...

Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Burada, brüt uygunluğu ve lokal hücre dışı matris yapılarını belirlemek için murine pulmoner valfin eksizyon, basınçlandırma, fiksasyon ve görüntüleme için korelatif bir iş akışı açıklıyoruz.

Murine Pulmoner Kapakçığın Korelatif Görüntülemesi için Cerrahi ve Örnek İşleme

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Bu protokol önemlidir, çünkü murin pulmoner valfin yapı fonksiyonu ile ilgili soruları yanıtlamak için tasarlanmıştır, bu da doğasında bulunan heterojenliği nedeniyle genellikle zordur. Yapıyı birden fazla uzunluk ölçeğinde yakalamak için kontrollü fiksasyon ve korelatif görüntüleme kullanılmıştır. Yerel yüksek çözünürlüklü görüntüler daha sonra pulmoner kapakçık üzerindeki hassas anatomik konuma geri eşlenebilir.Prosedürü gösteren, Nationwide Çocuk Hastanesi Rejeneratif Tıp Merkezi Mikrocerrahi Direktörü Dr.Tai Yi olacak. İnce makas, mikrokaplar, mikrovasküler kelepçeler, forseps uygulayan kelepçe, mikroneedle tutucular, yay makası ve retraktörler dahil olmak üzere fare diseksiyonu için gerekli aletleri otomatik olarak kapatarak başlayın. Yetişkin bir C57BL/6 fareyi ötenazi yaptıktan sonra, bir tepsiye dorsal bir recumbent pozisyonuna yerleştirin, uzuvlarını bantla sabitleyin ve torakotomiyi gerçekleştirin.Fazla yağ dokusunu ve fasyayı çıkararak kalbi açığa çıkarın, ardından sağ kulakçık çıkarın ve sol ventrikülü oda sıcaklığında salin çözeltisi ile perfuse edin. Üstün vena kava, alt vena kava, pulmoner arter ve aort keserek tüm kalbi çıkarın ve basınçlandırma kanalı görevi görecek ventriküloatriyal kavşaktan yaklaşık iki milimetre yukarıda kesin. Odaları atmosferik basınca maruz bırakmak için sol ve sağ ventrikülleri çıkarın, ventrikülleri çıkararak pulmoner gövde yapısının etkilenmemesini sağlayın.Pulmoner arter ile anastomoz basınçlandırma tüpü, broşürlerin ve pulmoner gövdenin büyük hareketlerini karşılamak için sinotubular kavşak ile borunun ucu arasında yaklaşık bir milimetre mesafe bırakır. Rezervuarı benzer bir fizyolojik basınca yükseltin ve tuzlu su çözeltisi ile doldurun. Tıkanıklık veya hava kabarcığı olmadığından emin olmak için akış sistemini test edin.Anastomosed pulmoner valf içine bir stopcock takın ve çıkış yolunu değiştirerek borudan yeterli akışı sağlayın. Akış yeterli olduğunda, çıkışı anastomosed pulmoner valfe geçirin ve gövde distansiyonu ile tanımlanan pulmoner gövdenin basınçlandırılmasını sağlayın. Pulmoner gövdenin basınçlandırılmasını onayladıktan sonra, tuzlu çözeltinin rezervuar kapasitesinin% 25'i temizlenene kadar birincil fiksatif çözeltiyi kademeli olarak dahil edin.Kurumasını önlemek için doku örneğinin üzerine fiksatif ıslatılmış bir gazlı bez yerleştirin. Sabitleyiciyi üç saat boyunca perfuse, sabit bir basınç sağlamak için rezervuarı yeniden doldurun. Perfüzyondan sonra, kalp kapakçığını bir haftaya kadar kullanıma kadar dört santigrat derecede sabitleyici çözeltide saklayın.Boyama için, sabit kalp kapak örneğini üç kez soğuk 0.15 molar kakadot tamponu ile beş dakika yıkayın ve kalp kapakçığını 1.5 potasyum ferrosiyanür, 0.15 molar kakadot, iki milimoler kalsiyum klorür ve% 2 osmiyum tetroksit çözeltisine bir saat boyunca tamamen batırın. Numuneleri oda sıcaklığında çift damıtılmış su ile hafif ajitasyon ile beş dakika boyunca bir tüpe yerleştirerek yıkayın. Üç yıkamadan sonra, numuneyi oda sıcaklığında filtrelenmiş tiyokarbohidrazid çözeltisine yerleştirin.20 dakika sonra, numuneyi daha önce gösterildiği gibi suyla üç kez yıkayın. Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında% 2 osmiyum tetroksit içine yerleştirin. 30 dakika sonra, her biri beş dakika boyunca üç kez suyla yıkayın ve numuneyi dört santigrat derecede gece boyunca% 1 uranil asetat halinde kuluçkaya bırakın.Bu arada, kurşun nitrat çözeltisi hazırlayın. Ertesi gün, daha önce gösterildiği gibi yıkama adımını üç kez gerçekleştirin, ardından kalp kapak dokusunu 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede kurşun aspartat çözeltisinde kuluçkaya yatırın. Örnekleri üç kez daha yıkayın, ardından kalp kapak dokularında her biri beş dakika boyunca buz üzerinde taze hazırlanmış 20, 50, 70 ve% 90 etanol ile seri bir dehidrasyon tedavisi yapın ve ardından% 100 etanol ile iki sonraki tedavi.Dehidrasyondan sonra, dokuları buz gibi asetona taşıyın, ardından 10 dakika boyunca oda sıcaklığında taze aseton içine yerleştirin. Gömme için reçine karışımını üreticinin özelliklerine göre yapın. Dokuları sonraki tedavilerde 25 ila 75, 50 ila 50 ve 75 ila 25 reçineyi aseton karışımına iki saat boyunca yerleştirin.Son olarak, dokuları bir gecede% 100 reçineye yerleştirin. Ertesi gün, dokuları taze% 100 reçineye yerleştirin. İki saat sonra, dokuları gömme bir kapsüle aktarın, taze% 100 reçine ekleyin ve tedavi etmek için 48 saat boyunca 60 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin.Hidrostatik basıncın uygulanmasından önce ve sonra eksize edilmiş anastomozlu pulmoner arter burada gösterilmiştir. Pulmoner gövde, pulmoner valf broşürlerinin kapalı bir konfigürasyonda olduğunu gösteren radyal olarak distends. Mikro bilgisayarlı tomografi pulmoner kapak onayını doğruladı.Broşürler kapatıldı ve annulus dairesel iken, fiksasyon veya arteriyel çökme ile çeşitli derecelerde yetersiz pulmoner kapak basınçlandırması gözlendi. Mikro CT ses işleme sanal kesitleri, dilimleme yönünü ve konumunu doğrulamak için optik görüntülerle ilişkilendirildi. Numune bloğu istenen yerde ve yöndeyken bir broşür içinde yerel bir bölgede yüksek çözünürlüklü SBF SEM görüntüleri çekildi.Mikro CT ses düzeyi işleme sanal dilimi, düşük çözünürlüklü ve yüksek çözünürlüklü SBF SEM görüntüleri arasındaki ilişkili görüntüler burada gösterilmiştir. Pulmoner kapakçığın parçalı bir bölgesinin 3D gösteriminde endotel hücreleri, valvüler interstisyel hücreler ve hücre dışı lifler gibi hücre dışı bileşenler tanımlanabilir. Bu protokolü denerken, lütfen basınçlandırmanın gerçekleştirilmesinin kritik olduğunu ve verimin mümkün olduğunca yüksek olmasını sağlayacağını unutmayın.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Lityum Pil Uygulamaları için solid-state Greft Kopolimer Elektrolit

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Moleküler Konformatörlerin ve Kümelerin Mekansal Ayrımı

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Non-Newtonian Akışkanlar Bırak Etkisi Dynamics Eğitim Hızlı Görüntüleme Tekniği

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

Rapid III-V Heteroepitaxial Karakterizasyonu için Elektron Channeling Kontrast Görüntüleme

Misfit dislocations in heteroepitaxial layers of GaP grown on Si(001) substrates are characterized through use of electron channeling contrast imaging ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Hiperpolarize Manyetik Rezonans Ajanlar Araştırmaları bir Multi-bölmesi Dinamik Tek Enzim Phantom Kullanımı

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Wicking Tests for Unidirectional Fabrics: Measurements of Capillary Parameters to Evaluate Capillary Pressure in Liquid Composite Molding Processes

Tek yönlü Kumaşlar Testleri esneklik: Kılcal Parametrelerinin Ölçümleri Sıvı Kompozit Kalıp Süreçlerinde Kılcal Basınç değerlendirin

During impregnation of a fibrous reinforcement in liquid composite molding (LCM) processes, capillary effects have to be understood in order to identify ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

ABD ordusu araştırma laboratuvarı toplu Nanocrystalline metallerin işlenmesi

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer (IBEX) for Radiomics

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer IBEX for Radiomics

Yönergeler ve biyomarker Explorer (IBEX) görüntüleme için Radiomics kullanarak deneyimi

Imaging Biomarker Explorer (IBEX) is an open-source tool for medical imaging radiomics work. The purpose of this paper is to describe how to use IBEX's ...

Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

Fused Filament Fabrication FFF of Metal-Ceramic Components

Erimiş filaman imalatı Metal-seramik bileşenler (FFF)

Technical ceramics are widely used for industrial and research applications, as well as for consumer goods. Today, the demand for complex geometries with ...

Fabrication of Nanoheight Channels Incorporating Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate for Acoustic Nanofluidics

Akustik Nanofluidics için Lityum Niyobat ile Yüzey Akustik Dalga Aktüasyon Birleştiren Nanoheight Kanallarıimalatı

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...