Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter at JoVE.com

Les recherches rapportées dans ce manuscrit ont été soutenues par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW et RP); Institut national du cancer des National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center à l’Université d’État du Kansas; et le département de la Défense des États-Unis (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Nous apprécions KSU-CVM Confocal Core et Joel Sanneman pour notre microscopie à immunofluorescence. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels de ces organismes de financement.

1. Placage cellulaire
<ol><li>Cultiver des cellules HFK LXSN et HFK 8E6 dans des plaques de 10 cm dans des milieux de culture de kératinocytes (10 mL / plaque) avec un supplément de croissance des kératinocytes humains (HKGS) et 1% de pénicilline / streptomycine. Cultiver des cellules à environ 80% de confluence à 37 °C dans un incubateur à enveloppe avec 5% de CO2.</li>
	<li>Remplacer les milieux de culture par 3 mL de trypsine-EDTA (0,05 %, acide tétraacétique d’éthylènediami...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

En plus de la profondeur des informations fournies, cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, la réparation DSB, en théorie, peut être évaluée à n’importe quel loci génomique sans modifier le génome de la cellule d’intérêt. Deuxièmement, l’accès à l’analyse NGS de la réparation est accru par la réduction des coûts et des efforts de calcul offerts par la création et l’analyse d’un seul DSB ciblé sur une zone définie. Enfin, étant donné que les génomes d’organismes su...

Le maintien de la stabilité génomique est essentiel pour tous les organismes vivants. Une réplication précise de l’ADN et une réponse robuste aux dommages à l’ADN (DDR) sont nécessaires pour propager fidèlement le matériel génétique 1,2. Les dommages à l’ADN se produisent régulièrement dans la plupart des cellules 2,3. Lorsque ces dommages sont détectés, la progression du cycle cellulaire est arrêtée et les mécanismes de réparation de l’ADN sont activés. Les ruptures double brin dans l’ADN ou les DSB sont le type de dommages à l’ADN le plus toxique et le plus mutagène 3,4.
Alors que plusieurs voies de signalisation DDR peuvent réparer ces lésions, les voies de réparation DSB les plus étudiées sont la recombinaison homologue (HR) et l’assemblage final non homologue (NHEJ). HR est une voie largement sans erreur qui répare un DSB en utilisant une chromatide sœur comme modèle homologue. Cela a tendance à se produire dans la phase S et la phase G2 d’un cycle cellulaire 5,6,7. NhEJ est plus sujet aux erreurs, mais cela peut se produire tout au long du cycle cellulaire 8,9. Divers essais de rapporteur ont été mis au point pour mesurer l’efficacité de mécanismes de réparation spécifiques 10,11,12. Ces essais ont tendance à s’appuyer sur la cytométrie en flux pour une mesure à haut débit de l’activité de la voie de réparation DSB en utilisant GFP ou mCherry comme lecture11,13. Bien que très efficaces, ils reposent sur une réparation canonique se produisant dans un DSB introduit artificiellement.
Il existe une variété d’autres méthodes utilisées pour étudier la réparation DSB. Beaucoup d’entre eux reposent sur la microscopie par immunofluorescence (FI) 1,14. La microscopie IF détecte des foyers nucléaires discrets représentatifs des complexes de réparation après que les DSB sont induits par l’exposition à des produits chimiques génotoxiques ou àdes rayonnements ionisants 15,16. Le suivi de la formation et de la résolution de ces foyers fournit une indication du début et de l’achèvement des réparations, respectivement14,17. Cependant, ces méthodes d’induction du DSB (c.-à-d. les produits chimiques ou les rayonnements ionisants) ne causent pas de DSB à des endroits définis du génome. Il est également fonctionnellement impossible de les utiliser pour induire systématiquement seulement un petit nombre (par exemple, 2-4) de DSB. En conséquence, les méthodes les plus couramment utilisées pour induire les DSB provoquent une multitude de lésions réparties aléatoirement dans tout le génome18. Un petit nombre d’ADB peut être introduit en insérant le site de reconnaissance d’une endonucléase coupant rare et en exprimant l’endonucléase pertinente, telle que I-Sce119. Malheureusement, l’intégration requise d’un site cible empêche l’examen du DSB aux loci génomiques endogènes.
Ce manuscrit décrit une méthode pour détecter les mutations associées à la réparation d’un DSB généré à un locus défini par l’utilisateur. Nous fournissons un exemple représentatif de l’approche appliquée pour évaluer la capacité d’une protéine virale à augmenter le nombre de mutations associées à un DSB. Plus précisément, ce manuscrit décrit l’utilisation d’un ARN guide unique (ARNg) pour diriger une endonucléase CAS9 afin d’induire un DSB au cadre de lecture ouvert CD4 humain dans les kératinocytes du prépuce humain exprimant la lutte antivectorielle (HFK LXSN) et HFK qui exprime la protéine E6 du virus du papillome humain de type 8 (HFK 8E6). Le séquençage ciblé de nouvelle génération (NGS) de la région entourant la cassure permet de définir rigoureusement les mutations associées à la réparation de la lésion. Ces données démontrent que la protéine virale provoque une augmentation d’environ 20 fois des mutations pendant la réparation du DSB. Il fournit également une caractérisation impartiale des conséquences mutagènes des DSB à un seul locus sans avoir besoin d’un séquençage du génome entier. En principe, le protocole pourrait être facilement adapté pour comparer le risque relatif de mutations entre les loci du génome ou les lignées cellulaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

Les cassures double brin (DSB) dans l’ADN sont le type de dommage à l’ADN le plus cytotoxique. Parce qu’une myriade d’insultes peuvent entraîner ces lésions (par exemple, stress de réplication, rayonnements ionisants, dommages UV non réparés), les DSB se produisent dans la plupart des cellules chaque jour. En plus de la mort cellulaire, les DSB non réparés réduisent l’intégrité du génome et les mutations qui en résultent peuvent conduire à la tumorigenèse. Ces risques et la prévalence des DSB motivent les recherches sur les mécanismes par lesquels les cellules réparent ces lésions. Le séquençage de nouvelle génération peut être associé à l’induction de DSB par rayonnement ionisant pour fournir un outil puissant permettant de définir avec précision les mutations associées aux défauts de réparation des DSB. Cependant, cette approche nécessite un séquençage du génome entier difficile sur le plan informatique et d’un coût prohibitif pour détecter la réparation des DSB aléatoires associés aux rayonnements ionisants. Les endonucléases coupantes rares, telles que I-Sce1, permettent de générer un seul DSB, mais leurs sites de reconnaissance doivent être insérés dans le génome d’intérêt. En conséquence, le site de réparation est intrinsèquement artificiel. Des avancées récentes permettent à l’ARN guide (ARNg) de diriger une endonucléase Cas9 vers n’importe quel locus du génome d’intérêt. Cela pourrait être appliqué à l’étude de la réparation du DSB rendant le séquençage de nouvelle génération plus rentable en lui permettant de se concentrer sur l’ADN flanquant le DSB induit par Cas9. L’objectif du manuscrit est de démontrer la faisabilité de cette approche en présentant un protocole permettant de définir des mutations issues de la réparation d’un DSB en amont du gène CD4. Le protocole peut être adapté pour déterminer les changements dans le potentiel mutagène du DSB associés à des facteurs exogènes, tels que les inhibiteurs de réparation, l’expression des protéines virales, les mutations et les expositions environnementales avec des exigences de calcul relativement limitées. Une fois que le génome d’un organisme a été séquencé, cette méthode peut théoriquement être utilisée à n’importe quel locus génomique et dans n’importe quel modèle de culture cellulaire de cet organisme qui peut être transfecté. Des adaptations similaires de l’approche pourraient permettre des comparaisons de la fidélité de réparation entre différents loci dans le même fond génétique.

Trois résultats représentatifs sont présentés pour ce protocole. La figure 1 est un immunoblot confirmant l’expression de CAS9 dans le contrôle HFK (LXSN) et HFK exprimant le bêta-HPV 8E6 (8E6). 48 heures après la transfection, des lysats de cellules entières ont été récoltés et ensuite sondés avec un anticorps anti-CAS9 (ou GAPDH comme contrôle de charge). Le résultat montre que HFK LXSN et HFK 8E6 expriment une quantité similaire de CAS9, ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter at JoVE.com

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Présenté ici est sgRNA/CAS9 endonucléase et protocole de séquençage de nouvelle génération qui peut être utilisé pour identifier les mutations associées à la réparation de rupture double brin près du promoteur CD4.

Utilisation du séquençage de nouvelle génération pour identifier les mutations associées à la réparation d’une rupture double brin induite par CAS9 près du promoteur CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Ce protocole vous aide à identifier les mutations qui se produisent lors de la réparation d’une rupture double brin induite par l’ARN monoguide et CAS9. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un moyen rentable et robuste de détecter des mutations à un locus génomique spécifique. Nous utilisons le kératinocyte humain comme exemple, mais ce protocole peut être adapté à toutes les lignées cellulaires transfectibles.Taylor Bugbee, un assistant de premier cycle de notre laboratoire, fera la démonstration de ce protocole. Pour commencer, cultivez des cellules HFK LXSN et HFK 8E6 dans des plaques de 10 centimètres à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur à enveloppe contenant des milieux de culture de kératinocytes avec un supplément de croissance des kératinocytes humains et une streptomycine à 1% de pénicilline. Remplacer le milieu de culture par trois millilitres de trypsine-EDTA et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.Ensuite, neutralisez la trypsine avec un volume égal de milieux supplémentés par FBS. Maintenant, transférez les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifugez à 300 fois G pendant cinq minutes. Remettez en suspension les cellules avec 10 millilitres de milieux de culture de kératinocytes avec un supplément de croissance des kératinocytes humains et déterminez la concentration des cellules avec un hémocytomètre.Ensuite, ensemencez deux plaques chacune pour les cellules HFK LXSN et HFK 8E6 dans quatre millilitres de milieux de culture de kératinocytes avec un supplément de croissance des kératinocytes humains et 1% de streptomycine de pénicilline. Après l’ensemencement, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur à veste. Le jour de la transfection, remplacez le média par trois millilitres de milieux supplémentés sans antibiotiques et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à veste.Pour transfecter les cellules, réchauffez les réactifs de transfection à température ambiante et pipetez-les doucement avant de les utiliser. Placez une quantité appropriée de tampon de transfection dans deux tubes centrifuges stériles de 1,5 millilitre pour chaque lignée cellulaire et étiquetez-les comme tube un et transfection simulée, ou tube deux. Ensuite, ajoutez deux microgrammes de CD4 humain exprimant l’ADN plasmidique, CAS9, à guide unique, ciblant l’ARN, au tube un et pipettez doucement pour mélanger complètement.Ajouter un volume égal d’eau stérile au tube deux. Ajouter une quantité appropriée du réactif de transfection au tube un avec un mélange d’ADN et à la transfection simulée ou au tube deux. À l’aide d’une pipette, mélangez-les complètement délicatement et incubez à température ambiante pendant 15 à 30 minutes pour former les complexes.Ajouter le mélange de transfection à la plaque et agiter doucement la plaque de culture pendant une minute pour répartir uniformément le mélange de transfection. Pour récolter les cellules par trypsinisation, remplacez le milieu de culture par un millilitre de trypsine EDTA et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, neutralisez la trypsine avec un volume égal de milieux supplémentés par FBS.Pour chaque plaque de cellules, transférer la suspension cellulaire dans deux tubes de microcentrifugation avec des aliquotes égales et centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Après la centrifugation, remettez en suspension la pastille cellulaire d’un tube dans un millilitre de PBS pour le séquençage, et dans un autre tube, avec du PBS glacé pour l’immunoblot. Le test Immunoblot a été effectué pour comparer l’expression de CAS9 dans les cellules HFK non transfectées et transectées.Les résultats montrent que les cellules HFK non transfectées et transectées ont exprimé une quantité similaire de CAS9, ce qui indique que l’efficacité de la transfection est similaire entre deux lignées cellulaires. Des images microscopiques par immunofluorescence de l’histone phosphorylée H2AX S139 dans des cellules transfectées sgRNA/CAS9 et un contrôle non transfecté ont été obtenues. Les résultats ont indiqué que deux cassures double brin ont été induites par CAS9 SgRNA.Les variations génomiques ont été regroupées par types d’événements mutationnels dans HFK LXSN et HFK 8E6, où chaque groupe de variations génomiques et le nombre total de variations ont été comparés entre HFK LXSN et HFK 8E6. Les résultats ont montré que le 8E6 augmente les variations génomiques dans les 200 kilobases autour des cassures double brin induites par CAS9, ce qui indique que le VPH 8E6 déréglemente la réparation de la rupture double brin et augmente l’instabilité génomique. Le but de l’immunoblot est de mesurer l’efficacité de la transfection, ce qui doit être pris en compte lors de l’analyse des données.En plus de l’efficacité de la transfection, la microscopie à immunofluorescence pourrait être utilisée pour confirmer l’induction de rupture double brin en utilisant le phospho-H2AX comme marqueur. Nous utilisons le HPV 8E6 bêta comme exemple. Cette technique peut être utilisée pour détecter les changements dans la fréquence ou le type de mutation causés par d’autres réactifs tels que les inhibiteurs de petites molécules.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Recherche

Génétique

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimisation et analyse comparative des méthodes d&#39;enrichissement de l&#39;ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l&#39;immunoprécipitation de la chromatine

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Génération d’immunoprécipitation de la chromatine Native séquençage des bibliothèques pour l’analyse de densité de nucléosomes

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Ciblé le séquençage Next-generation et bioinformatique Pipeline afin d’évaluer les déterminants génétiques de la maladie constitutionnelle

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Capture promoteur Salut-c : Haute résolution, Genome-wide profilage des Interactions de promoteur

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...