Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
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Die in diesem Manuskript berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW und RP) unterstützt; Nationales Krebsinstitut der National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center an der Kansas State University; und dem US-Verteidigungsministerium (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Wir danken KSU-CVM Confocal Core und Joel Sanneman für unsere Immunfluoreszenzmikroskopie. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung dieser Förderagenturen dar.

1. Zellenbeschichtung
<ol><li>Züchten Sie HFK LXSN- und HFK 8E6-Zellen in 10-cm-Platten in Keratinozytenkulturmedien (10 ml / Platte) mit humanem Keratinozyten-Wachstumspräparat (HKGS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Züchten Sie Zellen zu etwa 80% Konfluenz bei 37 °C in einem Jacket-Inkubator mit 5% CO2.</li>
	<li>Ersetzen Sie Kulturmedien durch 3 ml Trypsin-EDTA (0,05%, Ethylendiamintetraessigsäure). 3 min bei 37 °C inkubieren. Neutralisieren Sie Trypsin mit gleichem Volumen des mit...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

Neben der Tiefe der bereitgestellten Informationen bietet diese Methode mehrere Vorteile. Erstens kann die DSB-Reparatur theoretisch an jedem genomischen Loci beurteilt werden, ohne das Genom der interessierenden Zelle zu verändern. Zweitens wird der Zugang zur NGS-Analyse der Reparatur durch die reduzierten Kosten und den geringeren Rechenaufwand erhöht, die durch die Erstellung und Analyse eines einzelnen DSB für einen definierten Bereich erforderlich sind. Da die Genome zusätzlicher Organismen routinemäßig verf?...

Die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist für alle lebenden Organismen von entscheidender Bedeutung. Eine genaue DNA-Replikation und eine robuste DNA-Schadensantwort (DDR) sind notwendig, um das genetische Material originalgetreu zu verbreiten 1,2. DNA-Schäden treten in den meisten Zellen regelmäßigauf 2,3. Wenn diese Schäden erkannt werden, wird der Zellzyklusverlauf gestoppt und DNA-Reparaturmechanismen aktiviert. Doppelstrangbrüche in DNA oder DSBs sind die giftigste und mutagenste Art von DNA-Schäden 3,4.
Während mehrere DDR-Signalwege diese Läsionen reparieren können, sind die am gründlichsten untersuchten DSB-Reparaturwege homologe Rekombination (HR) und nicht-homologe Endverbindung (NHEJ). HR ist ein weitgehend fehlerfreier Weg, der eine DSB mit einer Schwesterchromatide als homologe Vorlage repariert. Dies geschieht tendenziell in der S- und G2-Phase eines Zellzyklus 5,6,7. NHEJ ist fehleranfälliger, kann aber während des gesamten Zellzyklusauftreten 8,9. Verschiedene Reporter-Assays wurden entwickelt, um die Effizienz spezifischer Reparaturmechanismen zu messen10,11,12. Diese Assays stützen sich in der Regel auf die Durchflusszytometrie für eine Hochdurchsatzmessung der DSB-Reparaturpfadaktivität unter Verwendung von GFP oder mCherry als Auslesung11,13. Obwohl sie sehr effizient sind, verlassen sie sich auf eine kanonische Reparatur, die bei einem künstlich eingeführten DSB auftritt.
Es gibt eine Vielzahl anderer Methoden, die verwendet werden, um die DSB-Reparatur zu untersuchen. Viele davon beruhen auf Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) 1,14. Die IF Mikroskopie weist diskrete Kernherde nach, die für Reparaturkomplexe repräsentativ sind, nachdem DSBs durch Exposition gegenüber genotoxischen Chemikalien oder ionisierender Strahlung induziert wurden15,16. Die Verfolgung der Bildung und Auflösung dieser Herde liefert einen Hinweis auf die Einleitung bzw. den Abschluss der Reparatur14,17. Diese Methoden der DSB-Induktion (d.h. Chemikalien oder ionisierende Strahlung) verursachen jedoch keine DSBs an definierten Stellen im Genom. Es ist auch funktional unmöglich, sie zu verwenden, um konsistent nur eine kleine Anzahl (z. B. 2-4) von DSBs zu induzieren. Infolgedessen verursachen die am häufigsten verwendeten Methoden zur Induktion von DSBs eine Vielzahl von Läsionen, die zufällig im gesamten Genom verteiltsind 18. Eine kleine Anzahl von DSBs kann eingeführt werden, indem die Erkennungsstelle für eine Endonuklease mit seltenem Schneiden eingefügt und die entsprechende Endonuklease wie I-Sce119 ausgedrückt wird. Leider verhindert die erforderliche Integration eines Zielortes die Untersuchung von DSB an endogenen genomischen Loci.
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Erkennung von Mutationen, die mit der Reparatur eines an einem benutzerdefinierten Ort generierten DSB verbunden sind. Wir liefern ein repräsentatives Beispiel für den Ansatz, der angewendet wird, um die Fähigkeit eines viralen Proteins zu bewerten, die Anzahl der mit einem DSB assoziierten Mutationen zu erhöhen. Insbesondere beschreibt dieses Manuskript die Verwendung einer Single-Guide-RNA (sgRNA), um eine CAS9-Endonuklease anzuordnen, um einen DSB bei menschlichem CD4-offenem Leserahmen in menschlichen Vorhautkeratinozyten zu induzieren, die Vektorkontrolle (HFK LXSN) exprimieren, und HFK, das das E6-Protein des humanen Papillomavirus Typ 8 (HFK 8E6) exprimiert. Gezielte Next-Generation-Sequenzierung (NGS) der Region, die den Bruch umgibt, ermöglicht es, Mutationen, die mit der Reparatur der Läsion verbunden sind, streng zu definieren. Diese Daten zeigen, dass das virale Protein während der DSB-Reparatur einen etwa 20-fachen Anstieg der Mutationen verursacht. Es bietet auch eine unvoreingenommene Charakterisierung der mutagenen Folgen von DSBs an einem einzigen Ort, ohne dass eine Sequenzierung des gesamten Genoms erforderlich ist. Prinzipiell könnte das Protokoll leicht angepasst werden, um das relative Risiko von Mutationen zwischen Genomloci oder Zelllinien zu vergleichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA sind die zytotoxischste Art von DNA-Schäden. Da eine Vielzahl von Beleidigungen zu diesen Läsionen führen können (z. B. Replikationsstress, ionisierende Strahlung, nicht reparierte UV-Schäden), treten DSBs jeden Tag in den meisten Zellen auf. Zusätzlich zum Zelltod reduzieren nicht reparierte DSBs die Genomintegrität und die daraus resultierenden Mutationen können die Tumorgenese vorantreiben. Diese Risiken und die Prävalenz von DSBs motivieren zu Untersuchungen der Mechanismen, mit denen Zellen diese Läsionen reparieren. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann mit der Induktion von DSBs durch ionisierende Strahlung gepaart werden, um ein leistungsfähiges Werkzeug zur genauen Definition der Mutationen bereitzustellen, die mit DSB-Reparaturdefekten verbunden sind. Dieser Ansatz erfordert jedoch eine rechenintensive und kostenintensive Sequenzierung des gesamten Genoms, um die Reparatur der zufällig auftretenden DSBs im Zusammenhang mit ionisierender Strahlung nachzuweisen. Seltene Schneideendonukleasen wie I-Sce1 bieten die Möglichkeit, ein einzelnes DSB zu erzeugen, aber ihre Erkennungsstellen müssen in das Genom von Interesse eingefügt werden. Infolgedessen ist der Ort der Reparatur von Natur aus künstlich. Jüngste Fortschritte ermöglichen es der Guide-RNA (sgRNA), eine Cas9-Endonuklease an jeden Genomort von Interesse zu leiten. Dies könnte auf die Untersuchung der DSB-Reparatur angewendet werden, die die Sequenzierung der nächsten Generation kostengünstiger macht, indem sie sich auf die DNA konzentriert, die das Cas9-induzierte DSB flankiert. Ziel des Manuskripts ist es, die Machbarkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, indem ein Protokoll vorgestellt wird, das Mutationen definieren kann, die aus der Reparatur eines DSB vor dem CD4-Gen stammen. Das Protokoll kann angepasst werden, um Veränderungen des mutagenen Potenzials von DSB zu bestimmen, die mit exogenen Faktoren wie Reparaturinhibitoren, viraler Proteinexpression, Mutationen und Umweltexpositionen mit relativ begrenzten Rechenanforderungen verbunden sind. Sobald das Genom eines Organismus sequenziert wurde, kann diese Methode theoretisch an jedem genomischen Ort und in jedem Zellkulturmodell dieses Organismus, der transfiziert werden kann, angewendet werden. Ähnliche Anpassungen des Ansatzes könnten Vergleiche der Reparaturtreue zwischen verschiedenen Loci im selben genetischen Hintergrund ermöglichen.

Für dieses Protokoll werden drei repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Abbildung 1 ist ein Immunoblot, der die Expression von CAS9 in der HFK-Kontrolle (LXSN) und die HFK-Expression von Beta-HPV 8E6 (8E6) bestätigt. 48 h nach der Transfektion wurden Ganzzelllysate entnommen und anschließend mit einem Anti-CAS9-Antikörper (oder GAPDH als Belastungskontrolle) untersucht. Das Ergebnis zeigt, dass HFK LXSN und HFK 8E6 eine ähnliche Menge an CAS9 exprimiere...

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Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Hier wird das sgRNA/CAS9-Endonuklease- und Next-Generation-Sequenzierungsprotokoll vorgestellt, das verwendet werden kann, um die Mutationen zu identifizieren, die mit der Reparatur von Doppelstrangbrüchen in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind.

Verwendung der Next-Generation-Sequenzierung zur Identifizierung von Mutationen, die mit der Reparatur eines CAS9-induzierten Doppelstrangbruchs in der Nähe des CD4-Promotors verbunden sind

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Dieses Protokoll hilft Ihnen, Mutationen zu identifizieren, die während der Reparatur eines Doppelstrangbruchs auftreten, der durch Single-Guide-RNA und CAS9 induziert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine kostengünstige und robuste Möglichkeit ist, Mutationen an einem bestimmten genomischen Ort nachzuweisen. Wir verwenden menschliche Keratinozyten als Beispiel, aber dieses Protokoll kann an alle transfizierbaren Zelllinien angepasst werden.Dieses Protokoll wird Taylor Bugbee, ein Assistent aus unserem Labor, demonstrieren. Zu Beginn kultivieren HFK LXSN- und HFK 8E6-Zellen in 10-Zentimeter-Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid in einem Jacket-Inkubator, der Keratinozytenkulturmedien mit humanem Keratinozyten-Wachstumspräparat und 1% Penicillin-Streptomycin enthält. Ersetzen Sie die Nährmedien durch drei Milliliter Trypsin-EDTA und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für drei Minuten.Neutralisieren Sie dann das Trypsin mit einer gleichen Menge an FBS-ergänzten Medien. Übertragen Sie nun die Zellen fünf Minuten lang in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und eine Zentrifuge bei 300 mal G. Resuspendieren Sie Zellen mit 10 Millilitern Keratinozytenkulturmedien mit menschlichem Keratinozyten-Wachstumspräparat und bestimmen Sie die Konzentration der Zellen mit einem Hämozytometer.Danach werden jeweils zwei Platten für HFK LXSN- und HFK 8E6-Zellen in vier Millilitern Keratinozytenkulturmedien mit humanem Keratinozyten-Wachstumspräparat und 1% Penicillin-Streptomycin ausgesät. Nach der Aussaat inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem Jackeninkubator. Ersetzen Sie am Tag der Transfektion die Medien durch drei Milliliter antibiotikafreie Ergänzungsmedien und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Jackeninkubator.Um die Zellen zu transfizieren, erwärmen Sie Transfektionsreagenzien auf Raumtemperatur und pipettieren Sie sie vorsichtig vor der Verwendung. Legen Sie eine angemessene Menge Transfektionspuffer in zwei sterile 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für jede Zelllinie und kennzeichnen Sie sie als Röhrchen eins und simulierte Transfektion oder Röhrchen zwei. Fügen Sie dann zwei Mikrogramm Plasmid-DNA-exprimierendes, CAS9, Single-Guide, RNA-zielgerichtetes menschliches CD4 hinzu, um eins zu rösten, und pipettieren Sie vorsichtig, um es vollständig zu mischen.Fügen Sie eine gleiche Menge steriles Wasser zu Tube zwei hinzu. Fügen Sie eine angemessene Menge des Transfektionsreagenzes zu Röhrchen eins mit DNA-Mischung und der simulierten Transfektion oder Röhrchen zwei hinzu. Mit einer Pipette vorsichtig vollständig vermischen und bei Raumtemperatur 15 bis 30 Minuten inkubieren, um die Komplexe zu bilden.Fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Platte und schütteln Sie die Kulturplatte vorsichtig für eine Minute, um die Transfektionsmischung gleichmäßig zu verteilen. Um die Zellen durch Trypsinisierung zu ernten, ersetzen Sie Kulturmedien durch einen Milliliter Trypsin EDTA und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Neutralisieren Sie dann Trypsin mit einer gleichen Menge an FBS-ergänzten Medien.Übertragen Sie die Zellsuspension für jede Zellplatte fünf Minuten lang auf zwei Mikrozentrifugenröhrchen mit gleichen Aliquots und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G. Nach der Zentrifugation suspendieren Sie das Zellpellet aus einem Röhrchen in einem Milliliter PBS für die Sequenzierung und in einem anderen Röhrchen mit eiskaltem PBS für Immunoblot. Es wurde ein Immunoblot-Assay durchgeführt, um die CAS9-Expression in nicht transfizierten und transektierten HFK-Zellen zu vergleichen.Die Ergebnisse zeigen, dass nicht transfizierte und transektierte HFK-Zellen eine ähnliche Menge an CAS9 exprimierten, was darauf hindeutet, dass die Transfektionseffizienz zwischen zwei Zelllinien ähnlich ist. Immunfluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von phosphoryliertem Histon H2AX S139 in SgRNA/CAS9-transfizierten Zellen und untransfizierter Kontrolle wurden erhalten. Die Ergebnisse zeigten, dass zwei Doppelstrangbrüche durch CAS9 SgRNA induziert wurden.Genomische Variationen wurden nach Arten von Mutationsereignissen in HFK LXSN und HFK 8E6 gruppiert, wobei jede Gruppe genomischer Variationen und die Gesamtzahl der Variationen zwischen HFK LXSN und HFK 8E6 verglichen wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass 8E6 die genomischen Variationen innerhalb von 200 Kilobasis um die CAS9-induzierten Doppelstrangbrüche erhöht, was darauf hindeutet, dass HPV 8E6 die Reparatur von Doppelstrangbrüchen dereguliert und die genomische Instabilität erhöht. Der Zweck von Immunoblot ist es, die Transfektionseffizienz zu messen, die bei der Datenanalyse berücksichtigt werden sollte.Zusätzlich zur Transfektionseffizienz könnte die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Induktion von Doppelstrangbrüchen mit Phospho-H2AX als Marker zu bestätigen. Wir verwenden die Beta HPV 8E6 als Beispiel. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen der Mutationshäufigkeit oder des Typs zu erkennen, die durch andere Reagenzien wie niedermolekulare Inhibitoren verursacht werden.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...