Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
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इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (P20GM130448) (NAW और RP) के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NCI R15 CA242057 01A1); कैनसस स्टेट यूनिवर्सिटी में जॉनसन कैंसर रिसर्च सेंटर; और अमेरिकी रक्षा विभाग (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW))। हम हमारे immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए KSU-CVM Confocal कोर और जोएल Sanneman की सराहना करते हैं। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि इन फंडिंग एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

1. सेल चढ़ाना
<ol><li>मानव केराटिनोसाइट वृद्धि पूरक (एचकेजीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया (10 एमएल / प्लेट) में 10 सेमी प्लेटों में एचएफके एलएक्सएसएन और एचएफके 8...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

प्रदान की गई जानकारी की गहराई के अलावा, इस विधि के कई फायदे हैं। सबसे पहले, सिद्धांत रूप में, डीएसबी की मरम्मत, ब्याज की कोशिका के जीनोम को संशोधित किए बिना किसी भी जीनोमिक लोकी पर मूल्यांकन किया जा सकता ?...

जीनोमिक स्थिरता बनाए रखना सभी जीवित जीवों के लिए महत्वपूर्ण है। सटीक डीएनए प्रतिकृति और एक मजबूत डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) आनुवंशिक सामग्री 1,2 को ईमानदारी से प्रचारित करने के लिए आवश्यक है। डीएनए क्षति अधिकांश कोशिकाओं में नियमित रूप सेहोती है 2,3। जब इन नुकसानों को महसूस किया जाता है, तो सेल चक्र प्रगति को रोक दिया जाता है, और डीएनए मरम्मत तंत्र सक्रिय हो जाते हैं। डीएनए या डीएसबी में डबल स्ट्रैंड ब्रेक डीएनए क्षति 3,4 के सबसे जहरीले और उत्परिवर्ती प्रकार हैं।
जबकि कई डीडीआर सिग्नलिंग मार्ग इन घावों की मरम्मत कर सकते हैं, सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए डीएसबी मरम्मत मार्ग होमोलोगस पुनर्संयोजन (एचआर) और गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) हैं। एचआर एक काफी हद तक त्रुटि मुक्त मार्ग है जो एक सजातीय टेम्पलेट के रूप में एक बहन क्रोमैटिड का उपयोग करके एक डीएसबी की मरम्मत करता है। यह एक सेल चक्र 5,6,7 के एस चरण और जी 2 चरण में होता है। एनएचईजे अधिक त्रुटि-प्रवण है, लेकिन यह सेल चक्र 8,9 में हो सकता है। विशिष्ट मरम्मत तंत्र10,11,12 की दक्षता को मापने के लिए विभिन्न रिपोर्टर assays विकसित किए गए हैं। ये assays एक रीडआउट11,13 के रूप में GFP या mCherry का उपयोग कर DSB मरम्मत मार्ग गतिविधि के एक उच्च थ्रूपुट माप के लिए प्रवाह cytometry पर भरोसा करते हैं। जबकि अत्यधिक कुशल, वे कृत्रिम रूप से पेश किए गए डीएसबी में होने वाली विहित मरम्मत पर भरोसा करते हैं।
डीएसबी मरम्मत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न अन्य तरीकों का उपयोग किया जाता है। इनमें से कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) माइक्रोस्कोपी1,14 पर भरोसा करते हैं। IF माइक्रोस्कोपी मरम्मत परिसरों के असतत परमाणु foci प्रतिनिधि का पता लगाता है के बाद DSBs genotoxic रसायनों या ionizing विकिरण15,16 के संपर्क में आने से प्रेरित कर रहे हैं. इन फोकी के गठन और संकल्प को ट्रैक करना क्रमशः14,17 मरम्मत दीक्षा और पूरा होने का संकेत प्रदान करता है। हालांकि, डीएसबी प्रेरण के इन तरीकों (यानी, रसायनों या आयनीकरण विकिरण) जीनोम में परिभाषित स्थानों पर डीएसबी का कारण नहीं बनते हैं। डीएसबी की केवल एक छोटी संख्या (जैसे, 2-4) को लगातार प्रेरित करने के लिए उनका उपयोग करना भी कार्यात्मक रूप से असंभव है। नतीजतन, डीएसबी को प्रेरित करने के सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीके जीनोम18 में बेतरतीब ढंग से वितरित घावों की एक भीड़ का कारण बनते हैं। एक दुर्लभ काटने वाले एंडोन्यूक्लिएज के लिए मान्यता साइट को सम्मिलित करके और प्रासंगिक एंडोन्यूक्लिएज को व्यक्त करके डीएसबी की एक छोटी संख्या पेश की जा सकती है, जैसे कि I-Sce119। दुर्भाग्य से, एक लक्ष्य साइट का आवश्यक एकीकरण अंतर्जात जीनोमिक लोकी पर डीएसबी की परीक्षा को रोकता है।
यह पांडुलिपि उपयोगकर्ता-परिभाषित लोकस पर उत्पन्न डीएसबी की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन करती है। हम एक डीएसबी से जुड़े उत्परिवर्तन की संख्या बढ़ाने के लिए एक वायरल प्रोटीन की क्षमता का आकलन करने के लिए लागू दृष्टिकोण का एक प्रतिनिधि उदाहरण प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, यह पांडुलिपि एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) के उपयोग का वर्णन करती है ताकि एक कैस 9 एंडोन्यूक्लिएज को निर्देशित किया जा सके ताकि मानव सीडी 4 में एक डीएसबी को प्रेरित किया जा सके, जो वेक्टर नियंत्रण (एचएफके एलएक्सएसएन) और एचएफके को व्यक्त करता है जो मानव पैपिलोमा वायरस टाइप 8 (एचएफके 8ई 6) के ई 6 प्रोटीन को व्यक्त करता है। ब्रेक के आसपास के क्षेत्र के लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) घाव की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तन को सख्ती से परिभाषित करने की अनुमति देता है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि वायरल प्रोटीन डीएसबी मरम्मत के दौरान उत्परिवर्तन में लगभग 20 गुना वृद्धि का कारण बनता है। यह पूरे जीनोम अनुक्रमण की आवश्यकता के बिना एक ही स्थान पर डीएसबी के म्यूटाजेनिक परिणामों का एक निष्पक्ष लक्षण वर्णन भी प्रदान करता है। सिद्धांत रूप में, प्रोटोकॉल को जीनोम लोकी या सेल लाइनों के बीच उत्परिवर्तन के सापेक्ष जोखिम की तुलना करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

डीएनए में डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) डीएनए क्षति का सबसे साइटोटोक्सिक प्रकार है। क्योंकि अपमान के असंख्य इन घावों में परिणाम कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, प्रतिकृति तनाव, ionizing विकिरण, unrepaired यूवी क्षति), DSBs प्रत्येक दिन अधिकांश कोशिकाओं में होते हैं। सेल की मृत्यु के अलावा, बिना मरम्मत वाले डीएसबी जीनोम अखंडता को कम करते हैं और परिणामस्वरूप उत्परिवर्तन ों को कम कर सकते हैं। ये जोखिम और डीएसबी की व्यापकता उन तंत्रों में जांच को प्रेरित करती है जिनके द्वारा कोशिकाएं इन घावों की मरम्मत करती हैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को आयनीकरण विकिरण द्वारा डीएसबी के प्रेरण के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि डीएसबी मरम्मत दोषों से जुड़े उत्परिवर्तनों को ठीक से परिभाषित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान किया जा सके। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए आयनीकरण विकिरण से जुड़े बेतरतीब ढंग से होने वाले डीएसबी की मरम्मत का पता लगाने के लिए कम्प्यूटेशनल रूप से चुनौतीपूर्ण और लागत निषेधात्मक पूरे जीनोम अनुक्रमण की आवश्यकता होती है। दुर्लभ काटने वाले एंडोन्यूक्लिएज, जैसे कि I-Sce1, एक एकल DSB उत्पन्न करने की क्षमता प्रदान करते हैं, लेकिन उनकी मान्यता साइटों को ब्याज के जीनोम में डाला जाना चाहिए। नतीजतन, मरम्मत की साइट स्वाभाविक रूप से कृत्रिम है। हाल की प्रगति गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को किसी भी जीनोम लोकस के लिए कैस 9 एंडोन्यूक्लिएज को निर्देशित करने की अनुमति देती है। यह DSB मरम्मत के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को अधिक लागत प्रभावी बनाता है, जिससे इसे Cas9-प्रेरित DSB के डीएनए फ्लैंकिंग पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति मिलती है। पांडुलिपि का लक्ष्य एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करके इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करना है जो उत्परिवर्तन को परिभाषित कर सकता है जो सीडी 4 जीन के ऊपर डीएसबी की मरम्मत से स्टेम करता है। प्रोटोकॉल को बहिर्जात कारकों से जुड़े डीएसबी की म्यूटाजेनिक क्षमता में परिवर्तन ों को निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि मरम्मत अवरोधक, वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति, उत्परिवर्तन, और अपेक्षाकृत सीमित गणना आवश्यकताओं के साथ पर्यावरणीय एक्सपोजर। एक बार जब किसी जीव के जीनोम को अनुक्रमित किया जाता है, तो इस विधि को सैद्धांतिक रूप से किसी भी जीनोमिक लोकस पर और उस जीव के किसी भी सेल संस्कृति मॉडल में नियोजित किया जा सकता है जिसे ट्रांसफेक्ट किया जा सकता है। दृष्टिकोण के समान अनुकूलन एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि में विभिन्न लोकी के बीच मरम्मत निष्ठा की तुलना की अनुमति दे सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल के लिए तीन प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। चित्रा 1 एक immunoblot HFK नियंत्रण (LXSN) और HFK बीटा-HPV 8E6 (8E6) व्यक्त में CAS9 की अभिव्यक्ति की पुष्टि अभिव्यक्ति है। अभिकर्मक के बाद 48 ?...

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Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

यहां प्रस्तुत किया गया है एसजीआरएनए / सीएएस 9 एंडोन्यूक्लिएज और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रोटोकॉल जिसका उपयोग सीडी 4 प्रमोटर के पास डबल स्ट्रैंड ब्रेक मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

CD4 प्रमोटर के पास CAS9-प्रेरित डबल स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत से जुड़े उत्परिवर्तनों की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करना

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

यह प्रोटोकॉल आपको एकल-गाइड आरएनए और कैस 9 द्वारा प्रेरित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक की मरम्मत के दौरान होने वाले उत्परिवर्तनों की पहचान करने में मदद करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक विशिष्ट जीनोमिक लोकस पर उत्परिवर्तन का पता लगाने का एक लागत प्रभावी और मजबूत तरीका है। हम एक उदाहरण के रूप में मानव केराटिनोसाइट का उपयोग करते हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल को किसी भी ट्रांसफेक्टेबल सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन टेलर Bugbee, हमारी प्रयोगशाला से एक स्नातक सहायक हो जाएगा. शुरू करने के लिए, संस्कृति HFK LXSN और HFK 8E6 कोशिकाओं में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेंटीमीटर प्लेटों में एक जैकेट इनक्यूबेटर में 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मानव केराटिनोसाइट विकास पूरक और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया युक्त एक जैकेट इनक्यूबेटर में शामिल है। ट्रिप्सिन-ईडीटीए के तीन मिलीलीटर के साथ संस्कृति मीडिया को बदलें और तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।फिर, FBS-पूरक मीडिया की एक समान मात्रा के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें। अब, कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर 15-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करें। मानव केराटिनोसाइट विकास पूरक के साथ केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करें।इसके बाद, मानव केराटिनोसाइट विकास पूरक और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ केराटिनोसाइट संस्कृति मीडिया के चार मिलीलीटर में एचएफके एलएक्सएसएन और एचएफके 8ई 6 कोशिकाओं के लिए प्रत्येक के लिए दो प्लेटें बीज। सीडिंग के बाद, एक जैकेट इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। अभिकर्मक के दिन, एंटीबायोटिक मुक्त पूरक मीडिया के तीन मिलीलीटर के साथ मीडिया को बदलें और एक जैकेट इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, कमरे के तापमान पर गर्म अभिकर्मक अभिकर्मक और उपयोग करने से पहले उन्हें धीरे से पिपेट करें। प्रत्येक सेल लाइन के लिए दो बाँझ 1.5-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अभिकर्मक बफर की एक उचित मात्रा रखें और उन्हें ट्यूब एक और नकली अभिकर्मक, या ट्यूब दो के रूप में लेबल करें। फिर, प्लास्मिड डीएनए-व्यक्त, CAS9, एकल-गाइड, आरएनए-लक्षित मानव CD4 के दो माइक्रोग्राम को ट्यूब एक और पिपेट को पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे जोड़ें।ट्यूब दो के लिए बाँझ पानी की एक समान मात्रा जोड़ें। डीएनए मिश्रण और नकली अभिकर्मक या ट्यूब दो के साथ ट्यूब एक करने के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक की एक उपयुक्त राशि जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके, धीरे से उन्हें पूरी तरह से मिलाएं और परिसरों को बनाने के लिए 15 से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।प्लेट में ड्रॉप-वार अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें और धीरे से एक मिनट के लिए संस्कृति प्लेट को हिलाएं ताकि समान रूप से अभिकर्मक मिश्रण वितरित किया जा सके। ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा कोशिकाओं को काटने के लिए, संस्कृति मीडिया को ट्रिप्सिन ईडीटीए के एक मिलीलीटर के साथ बदलें और तीन मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, एफबीएस-पूरक मीडिया की समान मात्रा के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें।कोशिकाओं की प्रत्येक प्लेट के लिए, सेल निलंबन को पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर समान एलीकोट और सेंट्रीफ्यूज के साथ दो माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। centrifugation के बाद, अनुक्रमण के लिए PBS के एक मिलीलीटर में एक ट्यूब से सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें, और एक अन्य ट्यूब में, इम्यूनोब्लॉट के लिए बर्फ के ठंडे पीबीएस के साथ। Immunoblot परख untransfected और transacted HFK कोशिकाओं में CAS9 अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए किया गया था।परिणाम बताते हैं कि असंक्रमित और ट्रांसेक्टेड एचएफके कोशिकाओं ने CAS9 की एक समान मात्रा व्यक्त की, यह दर्शाता है कि अभिकर्मक दक्षता दो सेल लाइनों के बीच समान है। SgRNA / CAS9 transfected कोशिकाओं और untransfected नियंत्रण में फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन H2AX S139 की immunofluorescence माइक्रोस्कोपी छवियों को प्राप्त किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक CAS9 SgRNA द्वारा प्रेरित किए गए थे।जीनोमिक विविधताओं को HFK LXSN और HFK 8E6 में उत्परिवर्तनीय घटनाओं के प्रकारों द्वारा वर्गीकृत किया गया था, जहां जीनोमिक विविधताओं के प्रत्येक समूह और भिन्नताओं की कुल संख्या की तुलना HFK LXSN और HFK 8E6 के बीच की गई थी। परिणामों से पता चला है कि 8E6 CAS9-प्रेरित डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के आसपास 200 किलोबेस के भीतर जीनोमिक विविधताओं को बढ़ाता है, यह दर्शाता है कि HPV 8E6 डबल-स्ट्रैंड ब्रेक मरम्मत को विनियमित करता है और जीनोमिक अस्थिरता को बढ़ाता है। इम्यूनोब्लॉट का उद्देश्य अभिकर्मक दक्षता को मापना है, जिसे डेटा विश्लेषण के दौरान माना जाना चाहिए।अभिकर्मक दक्षता के अलावा, इम्युनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग मार्कर के रूप में फॉस्फो-एच 2 एएक्स का उपयोग करके डबल-स्ट्रैंड ब्रेक प्रेरण की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। हम एक उदाहरण के रूप में बीटा एचपीवी 8ई 6 का उपयोग करते हैं। इस तकनीक का उपयोग अन्य अभिकर्मकों जैसे छोटे अणु अवरोधकों के कारण उत्परिवर्तन आवृत्ति या प्रकार में परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

जंगली प्रकार अवरुद्ध पीसीआर कम आवृत्ति दैहिक उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक अति संवेदनशील विधि के रूप में प्रत्यक्ष अनुक्रमण के साथ संयुक्त

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए उपयुक्त प्लांट ऑगेलरल डीएनए संवर्धन के तरीके का अनुकूलन और तुलनात्मक विश्लेषण

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

क्रोमैटिन इम्युनोपर्रेबिज़ का उपयोग करने वाली सी-केट लिगेंड प्रमोटर का विश्लेषण

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome घनत्व विश्लेषण के लिए देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation अनुक्रमण पुस्तकालयों की पीढ़ी

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

जीन क्लोनिंग के बिना एक जीन-बाधित स्ट्रेप्टोकोकस mutans तनाव की पीढ़ी

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

वानस्पतिक नमूनों के लिए मजबूत डीएनए अलगाव और उच्च प्रवाह अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

संवैधानिक रोग के आनुवंशिक निर्धारकों का मूल्यांकन करने के लिए लक्षित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और Bioinformatics पाइपलाइन

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

प्रमोटर कब्जा हाय-सी: उच्च संकल्प, जीनोम-व्यापक प्रमोटर बातचीत की रूपरेखा

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए निकट पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...