Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
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La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW e RP); National Cancer Institute del National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center presso la Kansas State University; e il Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Apprezziamo KSU-CVM Confocal Core e Joel Sanneman per la nostra microscopia a immunofluorescenza. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di queste agenzie di finanziamento.

1. Placcatura cellulare
<ol><li>Coltiva cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in piastre da 10 cm in terreni di coltura di cheratinociti (10 ml / piastra) con integratore di crescita dei cheratinociti umani (HKGS) e 1% di penicillina / streptomicina. Far crescere le cellule a circa l'80% di confluenza a 37 °C in un incubatore a camicia con il 5% di CO2.</li>
	<li>Sostituire i terreni di coltura con 3 ml di tripsina-EDTA (0,05%, acido tetraacetico etilendiammina). Incubare a 37 °C per 3 min. Neutraliz...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

Oltre alla profondità delle informazioni fornite, ci sono diversi vantaggi in questo metodo. In primo luogo, la riparazione DSB, in teoria, può essere valutata in qualsiasi loci genomico senza modificare il genoma della cellula di interesse. In secondo luogo, l'accesso all'analisi NGS della riparazione è aumentato dal costo ridotto e dallo sforzo computazionale offerto dalla creazione e dall'analisi di un singolo DSB mirato a un'area definita. Infine, con i genomi di altri organismi che diventano regolarmente disponib...

Mantenere la stabilità genomica è fondamentale per tutti gli organismi viventi. Una replicazione accurata del DNA e una robusta risposta al danno del DNA (DDR) sono necessarie per propagare fedelmente il materiale genetico 1,2. I danni al DNA si verificano regolarmente nella maggior parte delle cellule 2,3. Quando questi danni vengono rilevati, la progressione del ciclo cellulare viene interrotta e vengono attivati i meccanismi di riparazione del DNA. Le rotture a doppio filamento nel DNA o nei DSB sono il tipo più tossico e mutageno di danno al DNA 3,4.
Mentre diverse vie di segnalazione DDR possono riparare queste lesioni, le vie di riparazione DSB più studiate sono la ricombinazione omologa (HR) e l'unione finale non omologa (NHEJ). HR è un percorso in gran parte privo di errori che ripara un DSB utilizzando un cromatide gemello come modello omologo. Questo tende ad accadere nella fase S e nella fase G2 di un ciclo cellulare 5,6,7. NHEJ è più soggetto a errori, ma può accadere durante il ciclo cellulare 8,9. Sono stati sviluppati vari saggi reporter per misurare l'efficienza di specifici meccanismi di riparazione 10,11,12. Questi saggi tendono a fare affidamento sulla citometria a flusso per una misurazione ad alto rendimento dell'attività del percorso di riparazione del DSB utilizzando GFP o mCherry come lettura11,13. Sebbene altamente efficienti, si basano sulla riparazione canonica che si verifica in un DSB introdotto artificialmente.
Ci sono una varietà di altri metodi utilizzati per studiare la riparazione DSB. Molti di questi si basano sulla microscopia a immunofluorescenza (IF) 1,14. La microscopia IF rileva focolai nucleari discreti rappresentativi di complessi di riparazione dopo che i DSB sono indotti dall'esposizione a sostanze chimiche genotossiche o radiazioni ionizzanti15,16. Tracciare la formazione e la risoluzione di questi fuochi fornisce un'indicazione di inizio e completamento della riparazione, rispettivamente14,17. Tuttavia, questi metodi di induzione del DSB (cioè sostanze chimiche o radiazioni ionizzanti) non causano DSB in posizioni definite nel genoma. È anche funzionalmente impossibile usarli per indurre costantemente solo un piccolo numero (ad esempio, 2-4) di DSB. Di conseguenza, i metodi più comunemente usati per indurre i DSB causano una moltitudine di lesioni distribuite casualmente in tutto il genoma18. Un piccolo numero di DSB può essere introdotto inserendo il sito di riconoscimento per un'endonucleasi rara ed esprimendo l'endonucleasi pertinente, come I-Sce119. Sfortunatamente, l'integrazione richiesta di un sito target impedisce l'esame del DSB in loci genomici endogeni.
Questo manoscritto descrive un metodo per rilevare le mutazioni associate alla riparazione di un DSB generato in un luogo definito dall'utente. Forniamo un esempio rappresentativo dell'approccio applicato per valutare la capacità di una proteina virale di aumentare il numero di mutazioni associate a un DSB. In particolare, questo manoscritto descrive l'uso di un singolo RNA guida (sgRNA) per dirigere un'endonucleasi CAS9 per indurre un DSB al frame di lettura aperto CD4 umano nei cheratinociti del prepuzio umano che esprimono il controllo vettoriale (HFK LXSN) e HFK che esprime la proteina E6 del virus del papilloma umano di tipo 8 (HFK 8E6). Il sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS) della regione circostante la rottura consente di definire rigorosamente le mutazioni associate alla riparazione della lesione. Questi dati dimostrano che la proteina virale provoca un aumento di circa 20 volte delle mutazioni durante la riparazione del DSB. Fornisce inoltre una caratterizzazione imparziale delle conseguenze mutagene dei DSB in un singolo locus senza la necessità di sequenziamento dell'intero genoma. In linea di principio, il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per confrontare il rischio relativo di mutazioni tra loci del genoma o linee cellulari.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

Le rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA sono il tipo più citotossico di danno al DNA. Poiché una miriade di insulti può causare queste lesioni (ad esempio, stress di replicazione, radiazioni ionizzanti, danni UV non riparati), i DSB si verificano nella maggior parte delle cellule ogni giorno. Oltre alla morte cellulare, i DSB non riparati riducono l'integrità del genoma e le mutazioni risultanti possono guidare la tumorigenesi. Questi rischi e la prevalenza di DSB motivano le indagini sui meccanismi con cui le cellule riparano queste lesioni. Il sequenziamento di nuova generazione può essere abbinato all'induzione di DSB mediante radiazioni ionizzanti per fornire un potente strumento per definire con precisione le mutazioni associate ai difetti di riparazione del DSB. Tuttavia, questo approccio richiede un sequenziamento dell'intero genoma computazionalmente impegnativo e proibitivo per rilevare la riparazione dei DSB che si verificano casualmente associati alle radiazioni ionizzanti. Rare endonucleasi da taglio, come I-Sce1, forniscono la capacità di generare un singolo DSB, ma i loro siti di riconoscimento devono essere inseriti nel genoma di interesse. Di conseguenza, il sito di riparazione è intrinsecamente artificiale. Recenti progressi consentono all'RNA guida (sgRNA) di dirigere un'endonucleasi Cas9 a qualsiasi locus del genoma di interesse. Questo potrebbe essere applicato allo studio della riparazione del DSB rendendo il sequenziamento di prossima generazione più conveniente consentendo di concentrarsi sul DNA che fiancheggia il DSB indotto da Cas9. L'obiettivo del manoscritto è dimostrare la fattibilità di questo approccio presentando un protocollo in grado di definire mutazioni che derivano dalla riparazione di un DSB a monte del gene CD4. Il protocollo può essere adattato per determinare i cambiamenti nel potenziale mutageno del DSB associati a fattori esogeni, come inibitori di riparazione, espressione proteica virale, mutazioni ed esposizioni ambientali con requisiti di calcolo relativamente limitati. Una volta che il genoma di un organismo è stato sequenziato, questo metodo può essere teoricamente impiegato in qualsiasi locus genomico e in qualsiasi modello di coltura cellulare di quell'organismo che può essere trasfettato. Adattamenti simili dell'approccio potrebbero consentire confronti di fedeltà di riparazione tra diversi loci nello stesso background genetico.

Per questo protocollo vengono presentati tre risultati rappresentativi. La Figura 1 è un immunoblot che conferma l'espressione di CAS9 nel controllo HFK (LXSN) e HFK che esprime beta-HPV 8E6 (8E6). 48 ore dopo la trasfezione, i lisati a cellule intere sono stati raccolti e successivamente sondati con un anticorpo anti-CAS9 (o GAPDH come controllo del carico). Il risultato mostra che HFK LXSN e HFK 8E6 esprimono una quantità simile di CAS9, indicando che l'e...

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Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Qui viene presentata l'endonucleasi sgRNA/CAS9 e il protocollo di sequenziamento di nuova generazione che può essere utilizzato per identificare le mutazioni associate alla riparazione della rottura del doppio filamento vicino al promotore CD4.

Utilizzo del sequenziamento di nuova generazione per identificare le mutazioni associate alla riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da CAS9 vicino al promotore CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Questo protocollo aiuta a identificare le mutazioni che si verificano durante la riparazione di una rottura a doppio filamento indotta da RNA a guida singola e CAS9. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un modo economico e robusto per rilevare mutazioni in uno specifico locus genomico. Usiamo i cheratinociti umani come esempio, ma questo protocollo può essere adattato a qualsiasi linea cellulare trasfezionabile.A dimostrare questo protocollo sarà Taylor Bugbee, un assistente universitario del nostro laboratorio. Per iniziare, coltiva le cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in piastre da 10 centimetri a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica in un incubatore di giacca contenente terreni di coltura di cheratinociti con integratore di crescita dei cheratinociti umani e streptomicina all'1% di penicillina. Sostituire il terreno di coltura con tre millilitri di tripsina-EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti.Quindi, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di supporti integrati da FBS. Ora, trasferire le celle in un tubo centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Sospendere nuovamente le cellule con 10 millilitri di terreni di coltura dei cheratinociti con supplemento di crescita dei cheratinociti umani e determinare la concentrazione di cellule con un emocitometro.Successivamente, seminare due piastre ciascuna per le cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in quattro millilitri di terreni di coltura dei cheratinociti con integratore di crescita dei cheratinociti umani e 1% di penicillina streptomicina. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore di giacca. Il giorno della trasfezione, sostituire i media con tre millilitri di supporti integrati privi di antibiotici e incubare per due ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice di giacche.Per trasfettare le cellule, riscaldare i reagenti di trasfezione a temperatura ambiente e pipettarli delicatamente prima dell'uso. Posizionare una quantità appropriata di tampone di trasfezione in due tubi centrifughi sterili da 1,5 millilitri per ogni linea cellulare ed etichettarli come tubo uno e finta trasfezione, o tubo due. Quindi, aggiungere due microgrammi di DNA plasmidico che esprime, CAS9, CD4 umano a guida singola, mirato all'RNA al tubo uno e pipettare delicatamente per mescolare completamente.Aggiungere un volume uguale di acqua sterile al tubo due. Aggiungere una quantità appropriata del reagente di trasfezione al tubo uno con miscela di DNA e alla trasfezione simulata o al tubo due. Usando una pipetta, mescolarli delicatamente completamente e incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per formare i complessi.Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia sul piatto e agitare delicatamente la piastra di coltura per un minuto per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione. Per raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione, sostituire i terreni di coltura con un millilitro di tripsina EDTA e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Quindi, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di supporti integrati da FBS.Per ogni piastra di cellule, trasferire la sospensione cellulare in due tubi microcentrifuga con aliquote uguali e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, sospendere nuovamente il pellet cellulare da un tubo in un millilitro di PBS per il sequenziamento e in un altro tubo, con PBS ghiacciato per immunoblot. Il test immunoblot è stato eseguito per confrontare l'espressione di CAS9 in cellule HFK non trasfettate e transettate.I risultati mostrano che le cellule HFK non trasfettate e transettate hanno espresso una quantità simile di CAS9, indicando che l'efficienza di trasfezione è simile tra due linee cellulari. Sono state ottenute immagini al microscopio a immunofluorescenza dell'istone fosforilato H2AX S139 in cellule trasfettate SgRNA/CAS9 e controllo non trasfettato. I risultati hanno indicato che due rotture a doppio filamento sono state indotte da CAS9 SgRNA.Le variazioni genomiche sono state raggruppate per tipi di eventi mutazionali in HFK LXSN e HFK 8E6, dove ogni gruppo di variazioni genomiche e il numero totale di variazioni sono stati confrontati tra HFK LXSN e HFK 8E6. I risultati hanno mostrato che 8E6 aumenta le variazioni genomiche entro 200 kilobase intorno alle rotture a doppio filamento indotte da CAS9, indicando che l'HPV 8E6 deregola la riparazione della rottura a doppio filamento e aumenta l'instabilità genomica. Lo scopo di immunoblot è misurare l'efficienza della trasfezione, che dovrebbe essere considerata durante l'analisi dei dati.Oltre all'efficienza della trasfezione, la microscopia a immunofluorescenza potrebbe essere utilizzata per confermare l'induzione della rottura a doppio filamento utilizzando il fosfo-H2AX come marcatore. Usiamo il beta HPV 8E6 come esempio. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare cambiamenti nella frequenza o nel tipo di mutazione causati da altri reagenti come gli inibitori di piccole molecole.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Ricerca

Genetica

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