Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
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この原稿で報告された研究は、国立衛生研究所(P20GM130448)(NAWおよびRP)の国立一般医学研究所によって支援されました。国立衛生研究所の国立がん研究所 (NCI R15 CA242057 01A1);カンザス州立大学のジョンソンがん研究センター;米国国防総省(CMDRP PRCRP CA160224(NAW))です。KSU-CVM Confocal CoreとJoel Sannemanの免疫蛍光顕微鏡検査に感謝します。コンテンツは著者の責任であり、必ずしもこれらの資金提供機関の公式見解を表すものではありません。

1. セルプレーティング
<ol><li>ヒトケラチノサイト増殖サプリメント(HKGS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むケラチノサイト培養培地(10mL/プレート)中の10cmプレートでHFK LXSNおよびHFK 8E6細胞を増殖させる。5%CO2を有するジャケットインキュベーター中で37°Cで約80%コンフルエントまで細胞を増殖させる。</li>
	<li>培養培地を3mLのトリプシン-EDTA(0.05%、エチレンジア...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

提供される情報の深さに加えて、この方法にはいくつかの利点があります。第1に、DSB修復は、理論的には、目的の細胞のゲノムを改変することなく任意のゲノム遺伝子座で評価することができる。第二に、修理のNGS分析へのアクセスは、定義された領域をターゲットにした単一のDSBを作成して分析することによって得られるコストと計算労力の削減によって増加します。最後に、追加の生物...

ゲノムの安定性を維持することは、すべての生物にとって非常に重要です。正確なDNA複製と堅牢なDNA損傷応答(DDR)は、遺伝物質を忠実に伝播するために必要である1,2。DNA損傷は、ほとんどの細胞で定期的に起こる2,3。これらの損傷が感知されると、細胞周期の進行が止まり、DNA修復機構が活性化される。DNAまたはDSBの二本鎖切断は、DNA損傷の中で最も有毒で変異原性のあるタイプである3,4。
いくつかのDDRシグナル伝達経路がこれらの病変を修復することができるが、最も徹底的に研究されたDSB修復経路は相同組換え(HR)および非相同末端結合(NHEJ)である。HRは、姉妹染色分体を相同テンプレートとして使用してDSBを修復する、ほとんどエラーのない経路です。これは、細胞周期5、6、7のS期およびG2期において起こる傾向がある。NHEJはよりエラーが発生しやすいが、細胞周期全体を通して起こり得る8,9。特異的修復機構の効率を測定するために様々なレポーターアッセイが開発されている10、11、12。これらのアッセイは、GFPまたはmCherryを読み出しとして用いたDSB修復経路活性のハイスループット測定のためにフローサイトメトリーに依存する傾向がある11、13。非常に効率的ですが、人工的に導入されたDSBで発生する標準的な修復に依存しています。
DSB修復を研究するために使用される他の様々な方法があります。これらの多くは、免疫蛍光(IF)顕微鏡1,14に依存している。IF顕微鏡は、DSBが遺伝毒性化学物質または電離放射線への曝露によって誘導された後の修復複合体を代表する離散核病巣を検出する15,16。これらの病巣の形成および解決を追跡することは、それぞれ修復の開始および完了の指標を提供する14、17。しかしながら、DSB誘導のこれらの方法(すなわち、化学物質または電離放射線)は、ゲノム中の定義された位置でDSBを引き起こさない。また、それらを使用して、少数のDSBのみ(例えば、2〜4個)のみを一貫して誘導することも機能的に不可能である。その結果、DSBを誘導する最も一般的に使用される方法は、ゲノム全体にランダムに分布する多数の病変を引き起こす18。希少切断エンドヌクレアーゼの認識部位を挿入し、I-Sce119などの適切なエンドヌクレアーゼを発現させることにより、少数のDSBを導入することができる。残念なことに、標的部位の必要な統合は、内因性ゲノム遺伝子座におけるDSBの検査を妨げる。
本稿では、ユーザ定義遺伝子座で発生したDSBの修復に関連する変異を検出する方法を記載する。我々は、DSBに関連する変異の数を増加させるウイルスタンパク質の能力を評価するために適用されるアプローチの代表例を提供する。具体的には、この原稿は、ヒト包皮ケラチノサイトにおけるヒトCD4オープンリーディングフレームでDSBを誘導するためにCAS9エンドヌクレアーゼを指示するための単一のガイドRNA(sgRNA)の使用を記載するベクターコントロール(HFK LXSN)およびヒトパピローマウイルス8型(HFK 8E6)のE6タンパク質を発現するHFKを発現する。ブレークを取り囲む領域の標的次世代シーケンシング(NGS)は、病変の修復に関連する変異を厳密に定義することを可能にする。これらのデータは、ウイルスタンパク質がDSB修復中に変異の約20倍の増加を引き起こすことを実証している。また、全ゲノムシーケンシングを必要とせずに、単一の遺伝子座におけるDSBの変異原性の影響を偏りなく特徴付けます。原則として、このプロトコルは、ゲノム遺伝子座または細胞株間の突然変異の相対リスクを比較するために容易に適合させることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

DNA中の二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も細胞傷害性のあるタイプである。無数の侮辱がこれらの病変(例えば、複製ストレス、電離放射線、修復されていないUV損傷)をもたらす可能性があるため、DSBは毎日ほとんどの細胞で発生します。細胞死に加えて、修復されていないDSBはゲノムの完全性を低下させ、結果として生じる変異は腫瘍形成を促進する可能性がある。これらのリスクとDSBの有病率は、細胞がこれらの病変を修復するメカニズムの調査を動機付ける。次世代シーケンシングは、電離放射線によるDSBの誘導と組み合わせることができ、DSB修復欠陥に関連する変異を正確に定義するための強力なツールを提供します。しかし、このアプローチでは、電離放射線に関連するランダムに発生するDSBの修復を検出するために、計算上困難でコストのかかる全ゲノムシーケンシングが必要です。I-Sce1などの希少切断エンドヌクレアーゼは、単一のDSBを生成する能力を提供するが、それらの認識部位は目的のゲノムに挿入されなければならない。その結果、修復部位は本質的に人工的である。最近の進歩により、ガイドRNA(sgRNA)はCas9エンドヌクレアーゼを目的の任意のゲノム遺伝子座に誘導することができます。これは、Cas9誘導DSBに隣接するDNAに焦点を合わせることを可能にすることによって、次世代シーケンシングをより費用対効果の高いものにするDSB修復の研究に適用できる可能性がある。原稿の目標は、CD4遺伝子の上流のDSBの修復に由来する変異を定義できるプロトコルを提示することによって、このアプローチの実現可能性を実証することである。このプロトコルは、比較的限られた計算要件で、修復阻害剤、ウイルスタンパク質発現、突然変異、および環境曝露などの外因性因子に関連するDSBの変異原性電位の変化を決定するために適合させることができる。生物のゲノムが配列決定されると、この方法は理論的には、任意のゲノム遺伝子座およびトランスフェクト可能なその生物の任意の細胞培養モデルにおいて採用され得る。このアプローチの同様の適応は、同じ遺伝的背景にある異なる遺伝子座間の修復忠実度の比較を可能にする可能性がある。

このプロトコルの 3 つの代表的な結果を示します。図1は、β-HPV 8E6(8E6)を発現するHFKコントロール(LXSN)およびHFKにおけるCAS9の発現を確認したイムノブロットである。トランスフェクションの48時間後、全細胞ライセートを回収し、続いて抗CAS9抗体(またはローディングコントロールとしてGAPDH)でプローブした。結果は、HFK LXSNおよびHFK 8E6が同量のC...

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Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

ここでは、CD4プロモーター近傍の二本鎖切断修復に関連する変異を同定するために使用できるsgRNA/CAS9エンドヌクレアーゼおよび次世代シーケンシングプロトコルを紹介します。

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

このプロトコルは、シングルガイドRNAおよびCAS9によって誘導される二本鎖切断の修復中に生じる変異を同定するのに役立つ。この技術の主な利点は、特定のゲノム遺伝子座での変異を検出するための費用対効果が高く堅牢な方法であることです。ヒトケラチノサイトを例にとりますが、このプロトコルはあらゆるトランスフェクタブル細胞株に適合させることができます。このプロトコルを実証するのは、私たちの研究室の学部助手であるTaylor Bugbeeです。開始するために、ヒトケラチノサイト増殖サプリメントおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むケラチノサイト培養培地を含むジャケットインキュベーター中で、5%二酸化炭素を用いて摂氏37度の10センチメートルプレートでHFK LXSNおよびHFK 8E6細胞を培養する。培養培地を3ミリリットルのトリプシン-EDTAと交換し、摂氏37度で3分間インキュベートする。次いで、等量のFBS補充培地でトリプシンを中和する。次に、細胞を15ミリリットルの遠沈管に移し、300倍Gで5分間遠心分離する。ヒトケラチノサイト増殖サプリメントを用いて10ミリリットルのケラチノサイト培養培地で細胞を再懸濁し、血球計数器で細胞の濃度を決定する。その後、HFK LXSNおよびHFK 8E6細胞についてそれぞれ2つのプレートを、ヒトケラチノサイト増殖サプリメントおよび1%ペニシリンストレプトマイシンと共に4ミリリットルのケラチノサイト培養培地に播種した。播種後、細胞をジャケットインキュベーター内で摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートする。トランスフェクション当日、培地を抗生物質フリーの3ミリリットルの補充培地と交換し、ジャケットインキュベーター内で摂氏37度で2時間インキュベートします。細胞をトランスフェクトするには、トランスフェクション試薬を室温に温め、使用する前に穏やかにピペットでピペットします。各細胞株の 2 本の滅菌 1.5 ミリリットル遠沈管に適量のトランスフェクションバッファーを入れ、それらをチューブ 1 およびモックトランスフェクションまたはチューブ 2 としてラベル付けします。次に、DNA発現するプラスミド、CAS9、シングルガイド、RNA標的ヒトCD4の2マイクログラムをチューブ1本およびピペットに穏やかに加えて、完全に混合する。等量の滅菌水をチューブ2本に加える。適量のトランスフェクション試薬をDNA混合物および模擬トランスフェクションまたはチューブ2と共にチューブ1本に加える。ピペットを使用して、それらを完全に穏やかに混合し、室温で15〜30分間インキュベートして複合体を形成する。トランスフェクション混合物をプレートに滴下し、培養プレートを 1 分間静かに振って、トランスフェクション混合物を均等に分配します。トリプシン処理によって細胞を回収するには、培養培地を1ミリリットルのトリプシンEDTAと交換し、摂氏37度で3分間インキュベートする。次いで、等量のFBS添加培地でトリプシンを中和する。細胞の各プレートについて、細胞懸濁液を等しいアリコートを有する2つの微量遠心チューブに移し、300倍Gで5分間遠心分離する。遠心分離後、1つのチューブから細胞ペレットをシークエンシング用の1ミリリットルのPBSに再懸濁し、別のチューブにイムノブロット用の氷冷PBSで再懸濁する。イムノブロットアッセイは、非形質移入および形質移入HFK細胞におけるCAS9発現を比較するために実施した。この結果は、トランスフェクションされていないHFK細胞とトランスフェクトされたHFK細胞が同量のCAS9を発現したことを示し、トランスフェクション効率が2つの細胞株間で類似していることを示している。SgRNA/CAS9形質移入細胞および非形質移入対照におけるリン酸化ヒストンH2AX S139の免疫蛍光顕微鏡像が得られた。結果は、CAS9 SgRNAによって2つの二本鎖切断が誘導されたことを示した。ゲノム変異をHFK LXSNおよびHFK 8E6における変異事象の種類によってグループ化し、そこでゲノム変異の各群および変異の総数をHFK LXSNおよびHFK 8E6の間で比較した。結果は、8E6がCAS9誘発二本鎖切断の周囲200キロ塩基以内でゲノム変異を増加させることを示し、HPV 8E6が二本鎖切断修復を調節解除し、ゲノム不安定性を増加させることを示している。イムノブロットの目的は、データ解析中に考慮する必要があるトランスフェクション効率を測定することです。トランスフェクション効率に加えて、免疫蛍光顕微鏡を用いて、ホスホ-H2AXをマーカーとして用いて二本鎖切断誘導を確認することができた。例としてベータHPV 8E6を使用します。この技術は、小分子阻害剤などの他の試薬によって引き起こされる突然変異頻度またはタイプの変化を検出するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...