Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter at JoVE.com

Forskning rapportert i dette manuskriptet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW og RP); National Cancer Institute of the National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center i Kansas State University; og det amerikanske forsvarsdepartementet (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Vi setter pris på KSU-CVM Confocal Core og Joel Sanneman for vår immunfluorescensmikroskopi. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til disse finansieringsbyråene.

1. Celle plating
<ol><li>Vokse HFK LXSN og HFK 8E6 celler i 10 cm plater i keratinocytt kulturmedier (10 ml / plate) med menneskelig keratinocytt vekst supplement (HKGS) og 1% penicillin / streptomycin. Voks celler til ca 80% samløp ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.</li>
	<li>Erstatt kulturmedier med 3 ml trypsin-EDTA (0,05%, etylendiamin tetraacetic acid). Inkuber ved 37 °C i 3 minutter. Nøytraliser trypsin med likt volum av foster bovint serum (FBS) supplert medier og overfør cell...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

I tillegg til dybden av informasjon som er gitt, er det flere fordeler med denne metoden. For det første kan DSB-reparasjon i teorien vurderes ved enhver genomisk loci uten å endre genomet til interessecellen. For det andre økes tilgangen til NGS-analyse av reparasjon av reduserte kostnader og beregningsinnsats ved å lage og analysere en enkelt DSB rettet mot et definert område. Til slutt, med genomene til flere organismer som rutinemessig blir tilgjengelige og flere publikasjoner som demonstrerer vellykket transfek...

Opprettholdelse av genomisk stabilitet er avgjørende for alle levende organismer. Nøyaktig DNA-replikasjon og en robust DNA-skaderespons (DDR) er nødvendig for å trofast forplante det genetiske materialet 1,2. DNA-skader forekommer regelmessig i de fleste celler 2,3. Når disse skadene registreres, stoppes cellesyklusprogresjonen, og DNA-reparasjonsmekanismer aktiveres. Doble trådbrudd i DNA eller DSB er den mest giftige og mutagene typen DNA-skade 3,4.
Mens flere DDR-signalveier kan reparere disse lesjonene, er de mest grundig studerte DSB-reparasjonsveiene homolog rekombinasjon (HR) og ikke-homolog endekobling (NHEJ). HR er en stort sett feilfri vei som reparerer en DSB ved hjelp av en søsterkromotid som en homolog mal. Dette har en tendens til å skje i S-fasen og G2-fasen av en cellesyklus 5,6,7. NHEJ er mer feilutsatt, men det kan skje gjennom hele cellesyklusen 8,9. Ulike reporteranalyser er utviklet for å måle effektiviteten til spesifikke reparasjonsmekanismer 10,11,12. Disse analysene har en tendens til å stole på strømningscytometri for en høy gjennomstrømningsmåling av DSB-reparasjonsveiaktivitet ved hjelp av GFP eller mCherry som en avlesning11,13. Selv om de er svært effektive, er de avhengige av kanonisk reparasjon som skjer ved en kunstig introdusert DSB.
Det finnes en rekke andre metoder som brukes til å studere DSB-reparasjon. Mange av disse er avhengige av immunfluorescens (IF) mikroskopi 1,14. IF-mikroskopi oppdager diskret kjernefysisk foci-representant for reparasjonskomplekser etter at DSB-er er indusert ved eksponering for gentoksiske kjemikalier eller ioniserende stråling15,16. Sporing av dannelsen og oppløsningen av disse foci gir en indikasjon på reparasjonsinitiering og ferdigstillelse, henholdsvis14,17. Disse metodene for DSB-induksjon (dvs. kjemikalier eller ioniserende stråling) forårsaker imidlertid ikke DSB-er på definerte steder i genomet. Det er også funksjonelt umulig å bruke dem til konsekvent å indusere bare et lite antall (f.eks. 2-4) DSBer. Som et resultat forårsaker de mest brukte metodene for å indusere DSB-er en rekke lesjoner tilfeldig fordelt over hele genomet18. Et lite antall DSBer kan innføres ved å sette inn anerkjennelsesstedet for en sjeldent skjærende endonuclease og uttrykke den relevante endonuclease, for eksempel I-Sce119. Dessverre forhindrer den nødvendige integrasjonen av et målsted undersøkelse av DSB ved endogen genomisk loci.
Dette manuskriptet beskriver en metode for å oppdage mutasjoner knyttet til reparasjon av en DSB generert ved et brukerdefinert locus. Vi gir et representativt eksempel på tilnærmingen som brukes for å vurdere evnen til et viralt protein for å øke antall mutasjoner forbundet med en DSB. Spesielt beskriver dette manuskriptet bruken av en enkelt guide RNA (sgRNA) for å lede en CAS9-endonuclease for å indusere en DSB på menneskelig CD4 åpen leseramme i humane forhud keratinocytter som uttrykker vektorstyring (HFK LXSN) og HFK som uttrykker E6-proteinet til humant papillomavirus type 8 (HFK 8E6). Målrettet neste generasjons sekvensering (NGS) i regionen rundt pausen gjør at mutasjoner forbundet med reparasjon av lesjonen kan defineres grundig. Disse dataene viser at virusproteinet forårsaker en omtrent 20 ganger økning i mutasjoner under DSB-reparasjon. Det gir også en objektiv karakterisering av de mutagene konsekvensene av DSBer på et enkelt locus uten behov for sekvensering av hele genomet. I prinsippet kan protokollen lett tilpasses for å sammenligne den relative risikoen for mutasjoner mellom genom loci eller cellelinjer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

Dobbel strandbrudd (DSB) i DNA er den mest cytotoksiske typen DNA-skade. Fordi et utall fornærmelser kan føre til disse lesjonene (f.eks. replikeringsstress, ioniserende stråling, uopprettelig UV-skade), forekommer DSBer i de fleste celler hver dag. I tillegg til celledød reduserer ikke-reparerte DSBer genomintegritet, og de resulterende mutasjonene kan drive tumorigenesis. Disse risikoene og utbredelsen av DSBer motiverer undersøkelser av mekanismene som celler reparerer disse lesjonene. Neste generasjons sekvensering kan pares med induksjon av DSBer ved å ionisere stråling for å gi et kraftig verktøy for å nøyaktig definere mutasjonene forbundet med DSB-reparasjonsfeil. Denne tilnærmingen krever imidlertid beregningsmessig utfordrende og kostnadsoverkommelig hele genomsekvensering for å oppdage reparasjonen av de tilfeldig forekommende DSB-ene forbundet med ioniserende stråling. Sjeldne kutte endonucleases, som I-Sce1, gir muligheten til å generere en enkelt DSB, men deres anerkjennelsessteder må settes inn i genomet av interesse. Som et resultat er reparasjonsstedet iboende kunstig. Nylige fremskritt gjør det mulig for guide RNA (sgRNA) å lede en Cas9-endonuklease til ethvert genom locus av interesse. Dette kan brukes på studiet av DSB-reparasjon som gjør neste generasjons sekvensering mer kostnadseffektivt ved å la det fokuseres på DNA-flanken til den Cas9-induserte DSB. Målet med manuskriptet er å demonstrere muligheten for denne tilnærmingen ved å presentere en protokoll som kan definere mutasjoner som stammer fra reparasjon av en DSB oppstrøms for CD4-genet. Protokollen kan tilpasses for å bestemme endringer i det mutagene potensialet til DSB forbundet med eksogene faktorer, for eksempel reparasjonshemmere, viralt proteinuttrykk, mutasjoner og miljøeksponeringer med relativt begrensede beregningskrav. Når en organismes genom er sekvensert, kan denne metoden teoretisk brukes ved ethvert genomisk locus og i enhver cellekulturmodell av den organismen som kan transfekeres. Lignende tilpasninger av tilnærmingen kan tillate sammenligninger av reparasjonsgjengivelse mellom forskjellige loci i samme genetiske bakgrunn.

Tre representative resultater presenteres for denne protokollen. Figur 1 er en immunoblot som bekrefter uttrykk for CAS9 i HFK-kontroll (LXSN) og HFK som uttrykker beta-HPV 8E6 (8E6). 48 timer etter transfeksjon ble hele cellelysater høstet og deretter undersøkt med et anti-CAS9 antistoff (eller GAPDH som lastekontroll). Resultatet viser at HFK LXSN og HFK 8E6 uttrykker tilsvarende mengde CAS9 som indikerer at transfeksjonseffektiviteten er lik mellom to ce...

Watch this Scientific Journal Video about Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter at JoVE.com

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Presentert her er sgRNA / CAS9 endonuclease og neste generasjons sekvenseringsprotokoll som kan brukes til å identifisere mutasjonene forbundet med dobbel strandbruddreparasjon nær CD4-promotoren.

Bruke neste generasjons sekvensering til å identifisere mutasjoner forbundet med reparasjon av et CAS9-indusert dobbeltstrengsbrudd i nærheten av CD4-promotoren

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Denne protokollen hjelper deg med å identifisere mutasjoner som oppstår under reparasjon av et dobbeltstrengsbrudd indusert av enveis RNA og CAS9. Den største fordelen med denne teknikken er at det er en kostnadseffektiv og robust måte å oppdage mutasjoner på et bestemt genomisk locus. Vi bruker menneskelig keratinocytt som eksempel, men denne protokollen kan tilpasses alle transfekterbare cellelinjer.Å demonstrere denne protokollen vil være Taylor Bugbee, en bachelorassistent fra laboratoriet vårt. Til å begynne med, kultur HFK LXSN og HFK 8E6 celler i 10-centimeter plater ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i en jakke inkubator som inneholder keratinocytt kulturmedier med menneskelig keratinocytt vekst supplement og 1% penicillin streptomycin. Erstatt kulturmediene med tre milliliter trypsin-EDTA og inkuber ved 37 grader Celsius i tre minutter.Deretter nøytraliserer du trypsinet med et likt volum FBS-supplerte medier. Overfør nå cellene til et 15 milliliter sentrifugerrør og sentrifuger ved 300 ganger G i fem minutter. Re-suspendere celler med 10 milliliter keratinocytt kulturmedier med menneskelig keratinocytt vekst supplement og bestemme konsentrasjonen av celler med et hemocytometer.Etterpå frø to plater hver for HFK LXSN og HFK 8E6 celler i fire milliliter keratinocytt kulturmedier med menneskelig keratinocytt vekst supplement og 1% penicillin streptomycin. Etter sådd inkuberer du cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en jakkeinkubator. På transfeksjonsdagen erstatter du medier med tre milliliter antibiotikafrie, supplerte medier og inkuberer i to timer ved 37 grader Celsius i en inkubator.For å transfektere cellene, varme transfeksjonsreagenser til romtemperatur og pipette dem forsiktig før bruk. Plasser en passende mengde transfeksjonsbuffer i to sterile 1,5 milliliter sentrifugerør for hver cellelinje og merk dem som rør en og mock transfection, eller rør to. Legg deretter til to mikrogram plasmid DNA-uttrykkende, CAS9, enveis, RNA-målretting av menneskelig CD4 til rør en og pipette forsiktig for å blande helt.Tilsett et likt volum sterilt vann til rør to. Tilsett en passende mengde transfeksjonsreagens til rør en med DNA-blanding og mock transfection eller rør to. Bruk en pipette, bland dem forsiktig helt og inkuber ved romtemperatur i 15 til 30 minutter for å danne kompleksene.Tilsett transfeksjonsblandingen dråpevis på platen og rist forsiktig kulturplaten i ett minutt for å fordele transfeksjonsblandingen jevnt. For å høste cellene ved trypsinisering, erstatt kulturmedier med en milliliter trypsin EDTA og inkuber ved 37 grader Celsius i tre minutter. Deretter nøytraliserer du trypsin med et likt volum FBS-supplerte medier.For hver plate av celler, overfør cellefjæringen til to mikrocentrifugerør med like aliquots og sentrifuge ved 300 ganger G i fem minutter. Etter sentrifugering, re-suspendere cellepellet fra ett rør i en milliliter PBS for sekvensering, og i et annet rør, med iskald PBS for immunoblot. Immunoblotanalyse ble utført for å sammenligne CAS9-uttrykket i utransfected og transekterte HFK-celler.Resultatene viser at utransfected og transekterte HFK-celler uttrykte en lignende mengde CAS9, noe som indikerer at transfeksjonseffektivitet er lik mellom to cellelinjer. Immunfluorescence mikroskopi bilder av fosforylatert histone H2AX S139 i SgRNA / CAS9 transfected celler og utransfektert kontroll ble oppnådd. Resultatene indikerte at to dobbeltstrengsbrudd ble indusert av CAS9 SgRNA.Genomiske variasjoner ble gruppert etter typer mutasjonshendelser i HFK LXSN og HFK 8E6, hvor hver gruppe genomiske variasjoner og totalt antall variasjoner ble sammenlignet mellom HFK LXSN og HFK 8E6. Resultatene viste at 8E6 øker genomiske variasjoner innen 200 kilobase rundt cas9-induserte dobbeltstrengsbrudd, noe som indikerer at HPV 8E6 deregulaterer reparasjon av dobbeltstrengsbrudd og øker genomisk ustabilitet. Formålet med immunoblot er å måle transfeksjonseffektivitet, som bør vurderes under dataanalyse.I tillegg til transfeksjonseffektivitet kan immunfluorescensmikroskopi brukes til å bekrefte bruddinduksjon med dobbel tråd ved hjelp av fosfo-H2AX som markør. Vi bruker beta HPV 8E6 som eksempel. Denne teknikken kan brukes til å oppdage endringer i mutasjonsfrekvens eller type forårsaket av andre reagenser som små molekylhemmere.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Villtype Blokkering PCR Kombinert med direkte sekvensering som en svært følsom metode for påvisning av lavfrekvent somatiske mutasjoner

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisering og sammenligningsanalyse av organellar DNA-berigelsesmetoder som er egnet for neste generasjons sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse av c-KIT ligand-promotoren ved bruk av kromatinimmunutfelling

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generering av en gen-forstyrret Streptococcus mutans belastning uten Gene kloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Neste generasjons sekvensering og bioinformatikk rørledning for å evaluere genetisk determinanter av konstitusjonelle sykdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotoren fange Hei-C: Med høy oppløsning, genomet-bred profilering av arrangøren interaksjoner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...