Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
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A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (P20GM130448) (NAW e RP); Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde (NCI R15 CA242057 01A1); Centro de Pesquisa do Câncer Johnson na Universidade Estadual do Kansas; e o Departamento de Defesa dos EUA (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Agradecemos a KSU-CVM Confocal Core e Joel Sanneman pela nossa microscopia de imunofluorescência. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dessas agências de financiamento.

1. Revestimento de células
<ol><li>Cresça células HFK LXSN e HFK 8E6 em placas de 10 cm em mídia de cultura queratinócito (10 mL/placa) com suplemento de crescimento de queratinócito humano (HKGS) e 1% penicilina/estreptomicina. Cresça células para cerca de 80% de confluência a 37 °C em uma incubadora de jaquetas com 5% de CO2.</li>
	<li>Substitua a mídia cultural por 3 mL de trippsin-EDTA (0,05%, ácido tetraácético de etilenodiamina). Incubar a 37 °C por 3 min. Neutralizar a ...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

Além da profundidade das informações fornecidas, existem várias vantagens para este método. Primeiro, o reparo do DSB, em teoria, pode ser avaliado em qualquer loci genômico sem modificar o genoma da célula de interesse. Em segundo lugar, o acesso à análise de reparo do NGS é aumentado pelo custo reduzido e pelo esforço computacional proporcionado pela fabricação e análise de um único DSB direcionado a uma área definida. Finalmente, com os genomas de organismos adicionais se tornando rotineiramente dispon...

Manter a estabilidade genômica é fundamental para todos os organismos vivos. A replicação precisa do DNA e uma resposta robusta de dano de DNA (DDR) são necessárias para propagar fielmente o material genético 1,2. Os danos no DNA ocorrem regularmente na maioria das células 2,3. Quando esses danos são sentidos, a progressão do ciclo celular é interrompida, e os mecanismos de reparação do DNA são ativados. Quebras duplas de fios no DNA ou DSBs são o tipo mais tóxico e mutagênico de dano de DNA 3,4.
Embora várias vias de sinalização DDR possam reparar essas lesões, as vias de reparo DSB mais estudadas são a recombinação homologous (RH) e a junção final não homóloga (NHEJ). O RH é um caminho em grande parte livre de erros que repara um DSB usando um cromátide irmã como modelo homólogo. Isso tende a acontecer na fase S e G2 de um ciclocelular 5,6,7. O NHEJ é mais propenso a erros, mas pode acontecer ao longo do ciclocelular 8,9. Vários ensaios de repórteres foram desenvolvidos para medir a eficiência de mecanismos específicos de reparo 10,11,12. Esses ensaios tendem a depender da citometria de fluxo para uma medição de alto rendimento da atividade da via de reparo DSB usando GFP ou mCherry como leitura11,13. Embora altamente eficientes, eles dependem de reparos canônicos que ocorrem em um DSB artificialmente introduzido.
Há uma variedade de outros métodos usados para estudar o reparo do DSB. Muitos deles dependem da microscopia de imunofluorescência (IF) 1,14. Se a microscopia detectar focos nucleares discretos representativos de complexos de reparo após os DSBs serem induzidos pela exposição a produtos químicos genotoxicos ou radiação ionizante15,16. O acompanhamento da formação e resolução desses focos fornece uma indicação de iniciação e conclusão do reparo, respectivamente14,17. No entanto, esses métodos de indução de DSB (ou seja, produtos químicos ou radiação ionizante) não causam DSBs em locais definidos no genoma. Também é funcionalmente impossível usá-los para induzir consistentemente apenas um pequeno número (por exemplo, 2-4) de DSBs. Como resultado, os métodos mais comumente utilizados de induzir DSBs causam uma infinidade de lesões distribuídas aleatoriamente ao longo do genoma18. Um pequeno número de DSBs pode ser introduzido inserindo o local de reconhecimento de uma endonuclease de corte raro e expressando a endonuclease pertinente, como o I-Sce119. Infelizmente, a necessária integração de um local de destino impede o exame de DSB em loci genômico endógeno.
Este manuscrito descreve um método para detectar mutações associadas ao reparo de um DSB gerado em um lócus definido pelo usuário. Fornecemos um exemplo representativo da abordagem aplicada para avaliar a capacidade de uma proteína viral de aumentar o número de mutações associadas a um DSB. Especificamente, este manuscrito descreve o uso de um único guia RNA (sgRNA) para direcionar uma endonuclease CAS9 para induzir um DSB no quadro de leitura aberta CD4 humano em queratinócitos de prepúcio humano expressando controle vetorial (HFK LXSN) e HFK que expressa a proteína E6 do vírus papiloma humano tipo 8 (HFK 8E6). O sequenciamento de última geração (NGS) da região em torno do rompimento permite que mutações associadas à reparação da lesão sejam rigorosamente definidas. Esses dados demonstram que a proteína viral causa um aumento de aproximadamente 20 vezes nas mutações durante o reparo do DSB. Também fornece uma caracterização imparcial das consequências mutagênicas dos DSBs em um único lócus sem a necessidade de sequenciamento de genoma inteiro. Em princípio, o protocolo poderia ser facilmente adaptado para comparar o risco relativo de mutações entre loci genoma ou linhas celulares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

Quebras duplas de fios (DSBs) no DNA são o tipo mais citotóxico de dano de DNA. Como uma miríade de insultos pode resultar nessas lesões (por exemplo, estresse de replicação, radiação ionizante, dano UV não reparado), os DSBs ocorrem na maioria das células todos os dias. Além da morte celular, DSBs não reparados reduzem a integridade do genoma e as mutações resultantes podem impulsionar a tumorigênese. Esses riscos e a prevalência de DSBs motivam investigações sobre os mecanismos pelos quais as células reparam essas lesões. O sequenciamento da próxima geração pode ser emparelhado com a indução de DSBs por radiação ionizante para fornecer uma ferramenta poderosa para definir precisamente as mutações associadas aos defeitos de reparo do DSB. No entanto, essa abordagem requer sequenciamento de genoma inteiro e proibitivo de custos computacionalmente para detectar o reparo dos DSBs que ocorrem aleatoriamente associados à radiação ionizante. Endonucleases de corte raros, como o I-Sce1, fornecem a capacidade de gerar um único DSB, mas seus locais de reconhecimento devem ser inseridos no genoma do interesse. Como resultado, o local de reparo é inerentemente artificial. Os avanços recentes permitem orientar o RNA (sgRNA) a direcionar uma endonuclease Cas9 para qualquer lócus de genoma de interesse. Isso poderia ser aplicado ao estudo do reparo do DSB tornando o sequenciamento da próxima geração mais econômico, permitindo que ele se concentrasse no DNA flanqueando o DSB induzido pelo Cas9. O objetivo do manuscrito é demonstrar a viabilidade dessa abordagem apresentando um protocolo que pode definir mutações que decorrem da reparação de um DSB upstream do gene CD4. O protocolo pode ser adaptado para determinar mudanças no potencial mutagênico do DSB associados a fatores exógenos, como inibidores de reparação, expressão de proteína viral, mutações e exposições ambientais com requisitos de computação relativamente limitados. Uma vez que o genoma de um organismo tenha sido sequenciado, este método pode ser teoricamente empregado em qualquer lócus genômico e em qualquer modelo de cultura celular desse organismo que pode ser transfeminado. Adaptações semelhantes da abordagem poderiam permitir comparações de fidelidade de reparo entre diferentes loci no mesmo fundo genético.

Três resultados representativos são apresentados para este protocolo. Figura 1 é um imunoblot confirmando expressão de CAS9 no controle HFK (LXSN) e HFK expressando beta-HPV 8E6 (8E6). 48 h após a transfecção, os lises celulares inteiros foram colhidos e, posteriormente, sondados com um anticorpo anti-CAS9 (ou GAPDH como controle de carga). O resultado mostra que hfk LXSN e HFK 8E6 estão expressando quantidade semelhante de CAS9 indicando que a efici?...

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Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Apresentado aqui é o endonuclease sgRNA/CAS9 e o protocolo de sequenciamento de próxima geração que pode ser usado para identificar as mutações associadas ao reparo de quebra de fios duplos perto do promotor CD4.

Usando o sequenciamento da próxima geração para identificar mutações associadas ao reparo de uma quebra de fio dupla induzida pelo CAS9 perto do promotor cd4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Este protocolo ajuda a identificar mutações que ocorrem durante o reparo de uma quebra de dois fios induzida pelo RNA de guia único e CAS9. A principal vantagem desta técnica é que é uma maneira econômica e robusta de detectar mutações em um lócus genômico específico. Usamos a queratinócito humana como exemplo, mas este protocolo pode ser adaptado a qualquer linha celular transfectável.Demonstrando este protocolo estará Taylor Bugbee, um assistente de graduação do nosso laboratório. Para começar, cultura HFK LXSN e HFK 8E6 células em placas de 10 centímetros a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora de jaqueta contendo mídia de cultura queratinócito com suplemento de crescimento de queratinócitos humanos e estreptomicina de penicilina de 1%. Substitua a mídia cultural por três mililitros de trippsina-EDTA e incubar a 37 graus Celsius por três minutos.Em seguida, neutralize o trypsin com um volume igual de mídia complementada pelo FBS. Agora, transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes G por cinco minutos. Re suspenda células com 10 mililitros de mídia de cultura queratinócito com suplemento de crescimento de queratinócitos humanos e determine a concentração de células com hemótmetro.Depois, semente duas placas cada para células HFK LXSN e HFK 8E6 em quatro mililitros de mídia de cultura queratinócito com suplemento de crescimento de queratinócito humano e estreptomicina de 1%penicilina. Após a semeadura, incuba as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora de jaquetas. No dia da transfecção, substitua a mídia por três mililitros de mídia suplementada sem antibióticos e incuba por duas horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de jaquetas.Para transfetar as células, os reagentes de transfecção quentes para a temperatura ambiente e pipetá-los suavemente antes de usá-los. Coloque uma quantidade apropriada de tampão de transfecção em dois tubos de centrífuga de 1,5 mililitros estéreis para cada linha celular e rotule-os como tubo um e transfecção simulada, ou tubo dois. Em seguida, adicione dois microgramas de expressagem de DNA plasmídeo, CAS9, guia único, CD4 humano direcionado ao RNA ao tubo um e pipeta suavemente para misturar completamente.Adicione um volume igual de água estéril ao tubo dois. Adicione uma quantidade apropriada do reagente de transfecção ao tubo um com mistura de DNA e a transfecção simulada ou tubo dois. Usando uma pipeta, misture-as completamente e incuba-as à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos para formar os complexos.Adicione a mistura de transfecção em termos de gota ao prato e agite suavemente a placa de cultura por um minuto para distribuir uniformemente a mistura de transfecção. Para colher as células por trippsinização, substitua a mídia cultural por um mililitro de trippsina EDTA e incubar a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, neutralizar o trypsin com um volume igual de mídia suplementada pelo FBS.Para cada placa de células, transfira a suspensão celular para dois tubos de microcentrifuuuge com alíquotas iguais e centrífuga a 300 vezes G por cinco minutos. Após a centrifugação, suspenda a pelota celular de um tubo em um mililitro de PBS para sequenciamento, e em outro tubo, com PBS gelado para imunoblot. O ensaio de imunoblot foi realizado para comparar a expressão CAS9 em células HFK não transtravadas e transectadas.Os resultados mostram que as células HFK não transtravadas e transectadas expressaram uma quantidade semelhante de CAS9, indicando que a eficiência de transfecção é semelhante entre duas linhas celulares. Foram obtidas imagens de microscopia de microscopia de imunofluorescência de histone H2AX S139 em células transfetônicas SgRNA/CAS9 e controle não transtrafetado. Os resultados indicaram que duas quebras de dois fios foram induzidas pelo CAS9 SgRNA.As variações genômicas foram agrupadas por tipos de eventos mutacionais em HFK LXSN e HFK 8E6, onde cada grupo de variações genômicas e o número total de variações foram comparados entre HFK LXSN e HFK 8E6. Os resultados mostraram que o 8E6 aumenta as variações genômicas dentro de 200 quilobase em torno das quebras de dois fios induzidos pelo CAS9, indicando que o HPV 8E6 desregulamenta o reparo de quebra de dois fios e aumenta a instabilidade genômica. O objetivo do imunoblot é medir a eficiência da transfecção, que deve ser considerada durante a análise dos dados.Além da eficiência da transfecção, a microscopia de imunofluorescência poderia ser usada para confirmar a indução de quebra de dois fios usando fosfo-H2AX como marcador. Usamos o beta HPV 8E6 como exemplo. Esta técnica pode ser usada para detectar alterações na frequência ou tipo de mutação causadas por outros reagentes, como inibidores de moléculas pequenas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Otimização e Análise Comparativa de Métodos de Enriquecimento de DNA de Plantas Organizadas Adequado para Seqüenciamento de Próxima Geração

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Sequenciamento de nova geração direcionado e fluxo de análises de bioinformática para avaliar determinantes genéticos de doenças constitucionais

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...