Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
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La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (P20GM130448) (NAW y RP); Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud (NCI R15 CA242057 01A1); Centro de Investigación del Cáncer Johnson en la Universidad Estatal de Kansas; y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Agradecemos a KSU-CVM Confocal Core y a Joel Sanneman por nuestra microscopía de inmunofluorescencia. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de estas agencias de financiación.

1. Revestimiento celular
<ol><li>Cultive células HFK LXSN y HFK 8E6 en placas de 10 cm en medios de cultivo de queratinocitos (10 ml / placa) con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS) y penicilina / estreptomicina al 1%. Cultive las células a aproximadamente el 80% de confluencia a 37 °C en una incubadora de camisa con un 5% de CO2.</li>
	<li>Reemplace los medios de cultivo con 3 ml de tripsina-EDTA (0.05%, ácido tetraacético etilendiamina). Incubar a 37 °C durante...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

Además de la profundidad de la información proporcionada, hay varias ventajas de este método. En primer lugar, la reparación de DSB, en teoría, se puede evaluar en cualquier loci genómico sin modificar el genoma de la célula de interés. En segundo lugar, el acceso al análisis ngsano de la reparación se ve incrementado por la reducción del costo y el esfuerzo computacional que ofrece la creación y el análisis de un único OSD dirigido a una zona definida. Finalmente, con los genomas de organismos adicionales ...

Mantener la estabilidad genómica es fundamental para todos los organismos vivos. La replicación precisa del ADN y una respuesta robusta al daño del ADN (DDR) son necesarias para propagar fielmente el material genético 1,2. Los daños en el ADN ocurren regularmente en la mayoría de las células 2,3. Cuando se detectan estos daños, se detiene la progresión del ciclo celular y se activan los mecanismos de reparación del ADN. Las roturas de doble cadena en el ADN o DSB son el tipo de daño al ADN más tóxico y mutagénico 3,4.
Si bien varias vías de señalización DDR pueden reparar estas lesiones, las vías de reparación de DSB más estudiadas son la recombinación homóloga (HR) y la unión final no homóloga (NHEJ). HR es una vía en gran parte libre de errores que repara un DSB utilizando una cromátida hermana como plantilla homóloga. Esto tiende a suceder en la fase S y la fase G2 de un ciclo celular 5,6,7. NHEJ es más propenso a errores, pero puede ocurrir a lo largo del ciclo celular 8,9. Se han desarrollado varios ensayos de reporteros para medir la eficiencia de mecanismos de reparación específicos 10,11,12. Estos ensayos tienden a basarse en la citometría de flujo para una medición de alto rendimiento de la actividad de la vía de reparación de DSB utilizando GFP o mCherry como lectura11,13. Si bien son altamente eficientes, se basan en la reparación canónica que ocurre en un DSB introducido artificialmente.
Hay una variedad de otros métodos utilizados para estudiar la reparación de DSB. Muchos de estos se basan en la microscopía de inmunofluorescencia (IF) 1,14. La microscopía IF detecta focos nucleares discretos representativos de complejos de reparación después de que los DSB son inducidos por la exposición a productos químicos genotóxicos o radiaciones ionizantes15,16. El seguimiento de la formación y resolución de estos focos proporciona una indicación del inicio y la finalización de la reparación, respectivamente14,17. Sin embargo, estos métodos de inducción de DSB (es decir, productos químicos o radiación ionizante) no causan DSB en lugares definidos en el genoma. También es funcionalmente imposible usarlos para inducir consistentemente solo un pequeño número (por ejemplo, 2-4) de DSB. Como resultado, los métodos más utilizados para inducir DSB causan una multitud de lesiones distribuidas aleatoriamente por todo el genoma18. Se puede introducir un pequeño número de DSB insertando el sitio de reconocimiento para una endonucleasa de corte raro y expresando la endonucleasa pertinente, como I-Sce119. Desafortunadamente, la integración requerida de un sitio objetivo impide el examen de DSB en loci genómicos endógenos.
Este manuscrito describe un método para detectar mutaciones asociadas con la reparación de un DSB generado en un locus definido por el usuario. Proporcionamos un ejemplo representativo del enfoque aplicado para evaluar la capacidad de una proteína viral para aumentar el número de mutaciones asociadas con un DSB. Específicamente, este manuscrito describe el uso de un ARN guía único (sgRNA) para dirigir una endonucleasa CAS9 para inducir un DSB en el marco de lectura abierto CD4 humano en queratinocitos del prepucio humano que expresan control vectorial (HFK LXSN) y HFK que expresa la proteína E6 del virus del papiloma humano tipo 8 (HFK 8E6). La secuenciación dirigida de próxima generación (NGS) de la región que rodea la ruptura permite definir rigurosamente las mutaciones asociadas con la reparación de la lesión. Estos datos demuestran que la proteína viral causa un aumento de aproximadamente 20 veces en las mutaciones durante la reparación del DSB. También proporciona una caracterización imparcial de las consecuencias mutagénicas de los DSB en un solo locus sin la necesidad de secuenciar el genoma completo. En principio, el protocolo podría adaptarse fácilmente para comparar el riesgo relativo de mutaciones entre loci del genoma o líneas celulares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

Las roturas de doble cadena (DSB) en el ADN son el tipo más citotóxico de daño en el ADN. Debido a que una miríada de insultos pueden resultar en estas lesiones (por ejemplo, estrés de replicación, radiación ionizante, daño UV no reparado), los DSB ocurren en la mayoría de las células cada día. Además de la muerte celular, los DSB no reparados reducen la integridad del genoma y las mutaciones resultantes pueden impulsar la tumorigénesis. Estos riesgos y la prevalencia de los DSB motivan las investigaciones sobre los mecanismos por los cuales las células reparan estas lesiones. La secuenciación de próxima generación se puede combinar con la inducción de DSB mediante radiación ionizante para proporcionar una herramienta poderosa para definir con precisión las mutaciones asociadas con los defectos de reparación de DSB. Sin embargo, este enfoque requiere una secuenciación del genoma completo computacionalmente desafiante y prohibitiva para detectar la reparación de los DSB que ocurren al azar asociados con la radiación ionizante. Las endonucleasas de corte raras, como I-Sce1, proporcionan la capacidad de generar un solo DSB, pero sus sitios de reconocimiento deben insertarse en el genoma de interés. Como resultado, el sitio de reparación es inherentemente artificial. Los avances recientes permiten que el ARN guía (sgRNA) dirija una endonucleasa Cas9 a cualquier locus del genoma de interés. Esto podría aplicarse al estudio de la reparación del DSB, lo que hace que la secuenciación de próxima generación sea más rentable al permitir que se centre en el ADN que flanquea el DSB inducido por Cas9. El objetivo del manuscrito es demostrar la viabilidad de este enfoque mediante la presentación de un protocolo que puede definir mutaciones que se derivan de la reparación de un DSB aguas arriba del gen CD4. El protocolo se puede adaptar para determinar los cambios en el potencial mutagénico del DSB asociados con factores exógenos, como inhibidores de la reparación, expresión de proteínas virales, mutaciones y exposiciones ambientales con requisitos de cálculo relativamente limitados. Una vez que el genoma de un organismo ha sido secuenciado, este método puede ser empleado teóricamente en cualquier locus genómico y en cualquier modelo de cultivo celular de ese organismo que pueda ser transfectado. Adaptaciones similares del enfoque podrían permitir comparaciones de la fidelidad de reparación entre diferentes loci en el mismo fondo genético.

Se presentan tres resultados representativos para este protocolo. La Figura 1 es una expresión inmunoblot que confirma la expresión de CAS9 en el control de HFK (LXSN) y HFK que expresa beta-HPV 8E6 (8E6). 48 h después de la transfección, se recolectaron lisados de células enteras y posteriormente se sondearon con un anticuerpo anti-CAS9 (o GAPDH como control de carga). El resultado muestra que HFK LXSN y HFK 8E6 están expresando una cantidad similar de...

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Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Aquí se presenta la endonucleasa sgRNA / CAS9 y el protocolo de secuenciación de próxima generación que se puede utilizar para identificar las mutaciones asociadas con la reparación de rotura de doble cadena cerca del promotor CD4.

Uso de la secuenciación de próxima generación para identificar mutaciones asociadas con la reparación de una rotura de doble cadena inducida por CAS9 cerca del promotor CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Este protocolo le ayuda a identificar las mutaciones que se producen durante la reparación de una rotura de doble cadena inducida por arn de guía única y CAS9. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma rentable y robusta de detectar mutaciones en un locus genómico específico. Utilizamos el queratinocito humano como ejemplo, pero este protocolo se puede adaptar a cualquier línea celular transfectable.Demostrando este protocolo estará Taylor Bugbee, un asistente de pregrado de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive células HFK LXSN y HFK 8E6 en placas de 10 centímetros a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en una incubadora de camisa que contiene medios de cultivo de queratinocitos con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos y estreptomicina de penicilina al 1%. Reemplace el medio de cultivo con tres mililitros de tripsina-EDTA e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos.Luego, neutralice la tripsina con un volumen igual de medios suplementados con FBS. Ahora, transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células con 10 mililitros de medios de cultivo de queratinocitos con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos y determine la concentración de células con un hemocitómetro.Después, sembra dos placas cada una para células HFK LXSN y HFK 8E6 en cuatro mililitros de medios de cultivo de queratinocitos con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos y estreptomicina de penicilina al 1%. Después de la siembra, incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en una incubadora de chaqueta. El día de la transfección, reemplace los medios con tres mililitros de medios suplementados sin antibióticos e incube durante dos horas a 37 grados centígrados en una incubadora de chaqueta.Para transfectar las células, caliente los reactivos de transfección a temperatura ambiente y los pipete suavemente antes de usarlos. Coloque una cantidad adecuada de tampón de transfección en dos tubos de centrífuga estériles de 1,5 mililitros para cada línea celular y etiquételos como tubo uno y transfección simulada, o tubo dos. Luego, agregue dos microgramos de CD4 humano que expresa adn plásmido, CAS9, de guía única, dirigido a ARN para sondear uno y pipetear suavemente para mezclar por completo.Agregue un volumen igual de agua estéril al tubo dos. Agregue una cantidad adecuada del reactivo de transfección al tubo uno con la mezcla de ADN y la transfección simulada o el tubo dos. Usando una pipeta, mézclelos suavemente por completo e incube a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos para formar los complejos.Agregue la mezcla de transfección gota a gota a la placa y agite suavemente la placa de cultivo durante un minuto para distribuir uniformemente la mezcla de transfección. Para cosechar las células por tripsinización, reemplace los medios de cultivo con un mililitro de tripsina EDTA e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos. Luego, neutralice la tripsina con un volumen igual de medios suplementados con FBS.Para cada placa de células, transfiera la suspensión celular a dos tubos de microcentrífuga con alícuotas iguales y centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular de un tubo en un mililitro de PBS para la secuenciación, y en otro tubo, con PBS helado para immunoblot. Se realizó un ensayo de immunoblot para comparar la expresión de CAS9 en células HFK no transfectadas y transectadas.Los resultados muestran que las células HFK no transfectadas y transectadas expresaron una cantidad similar de CAS9, lo que indica que la eficiencia de transfección es similar entre dos líneas celulares. Se obtuvieron imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de histona fosforilada H2AX S139 en células transfectadas sgRNA/CAS9 y control no transfectado. Los resultados indicaron que dos roturas de doble cadena fueron inducidas por CAS9 SgRNA.Las variaciones genómicas se agruparon por tipos de eventos mutacionales en HFK LXSN y HFK 8E6, donde se comparó cada grupo de variaciones genómicas y el número total de variaciones entre HFK LXSN y HFK 8E6. Los resultados mostraron que 8E6 aumenta las variaciones genómicas dentro de los 200 kilobases alrededor de las roturas de doble cadena inducidas por CAS9, lo que indica que el VPH 8E6 desregula la reparación de roturas de doble cadena y aumenta la inestabilidad genómica. El propósito de immunoblot es medir la eficiencia de la transfección, que debe considerarse durante el análisis de datos.Además de la eficiencia de la transfección, la microscopía de inmunofluorescencia podría usarse para confirmar la inducción de rotura de doble cadena utilizando fosfo-H2AX como marcador. Usamos el vph beta 8E6 como ejemplo. Esta técnica se puede utilizar para detectar cambios en la frecuencia o el tipo de mutación causados por otros reactivos, como los inhibidores de moléculas pequeñas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Investigación

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Análisis del promotor de ligandos c-KIT usando inmunoprecipitación de cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Dirigida tubería de Bioinformática y secuenciación de próxima generación para evaluar determinantes genéticos de la enfermedad constitucional

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor captura Hola-C: Perfiles de alta resolución, genoma de interacciones promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

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The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...