Name: using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter at JoVE.com

Bu makalede bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (P20GM130448) (NAW ve RP) tarafından desteklenmiştir; Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI R15 CA242057 01A1); Kansas Eyalet Üniversitesi'ndeki Johnson Kanser Araştırma Merkezi; ve ABD Savunma Bakanlığı (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). KSU-CVM Konfokal Çekirdek ve Joel Sanannem'e immünofloresan mikroskopimiz için teşekkür ederiz. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve bu finansman kuruluşlarının resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. Hücre kaplaması
<ol><li>HFK LXSN ve HFK 8E6 hücrelerini, insan keratinosit büyüme takviyesi (HKGS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile keratinosit kültür ortamında (10 mL / plaka) 10 cm'lik plakalarda büyütün. Hücreleri% 5 CO2 ile bir ceket inkübatöründe 37 ° C'de yaklaşık% 80 birleşime kadar büyütün.</li>
	<li>Kültür ortamını 3 mL tripsin-EDTA (% 0.05, etilendiamin tetraasetik asit) ile değiştirin. 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Tripsini eşit haciml...

<ol>
	<li>V&#237;tor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+DNA+double-strand+break+repair:+an+ever-growing+toolbox.">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li><li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response.">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745 (2011).</li><li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+breaks:+Signaling,+repair+and+the+cancer+connection.">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li><li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression.">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. 5. 3. B. P. 1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks.">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication.">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li><li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-dependent+protein+kinase:+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis.">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 194-205 (2015).</li><li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+non-homologous+end-joining:+A+synopsis+of+synapsis.">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li><li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells.">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li><li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50,+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs,+and+transcription+context.">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li><li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation.">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li><li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints.">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li><li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy.">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).</li><li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps.">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. , (2018).</li><li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -. P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury.">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327, 48-60 (2012).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#947;-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">&#947;-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li><li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization.">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).</li><li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+endonuclease,+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila.">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity.">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356 (2020).</li><li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors.">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).</li><li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -. C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misleading+westerns:+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures.">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+insects:+Applications,+best+practices+and+biosafety+concerns.">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li><li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining.">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li></ol>

Sağlanan bilgilerin derinliğine ek olarak, bu yöntemin birkaç avantajı vardır. İlk olarak, DSB onarımı, teoride, ilgili hücrenin genomunu değiştirmeden herhangi bir genomik lokusta değerlendirilebilir. İkincisi, onarımın NGS analizine erişim, tanımlanmış bir alanı hedefleyen tek bir DSB'nin yapılması ve analiz edilmesinin sağladığı düşük maliyet ve hesaplama çabası ile arttırılır. Son olarak, ek organizmaların genomlarının rutin olarak kullanılabilir hale gelmesi ve çeşitli memeli...

Genomik stabilitenin korunması, tüm canlı organizmalar için kritik öneme sahiptir. Doğru DNA replikasyonu ve sağlam bir DNA hasar yanıtı (DDR), genetik materyali sadık bir şekilde yaymak için gereklidir 1,2. DNA hasarları çoğu hücrede düzenli olarak meydana gelir 2,3. Bu hasarlar hissedildiğinde, hücre döngüsü ilerlemesi durdurulur ve DNA onarım mekanizmaları aktive edilir. DNA veya DSB'lerdeki çift iplikçik kırılmaları, DNA hasarının en toksik ve mutajenik türüdür 3,4.
Birkaç DDR sinyal yolu bu lezyonları onarabilirken, en iyi çalışılan DSB onarım yolları homolog rekombinasyon (HR) ve homolog olmayan uç birleştirmedir (NHEJ). HR, homolog bir şablon olarak kardeş kromatid kullanarak bir DSB'yi onaran büyük ölçüde hatasız bir yoldur. Bu, bir hücre döngüsünün S fazında ve G2 fazında 5,6,7 olma eğilimindedir. NHEJ hataya daha yatkındır, ancak hücre döngüsü 8,9 boyunca gerçekleşebilir. Belirli onarım mekanizmalarının verimliliğini ölçmek için çeşitli muhabir testleri geliştirilmiştir10,11,12. Bu tahliller, GFP veya mCherry'yi11,13 olarak kullanarak DSB onarım yolu aktivitesinin yüksek verim ölçümü için akış sitometrisine dayanma eğilimindedir. Son derece verimli olsalar da, yapay olarak tanıtılan bir DSB'de meydana gelen kanonik onarıma güvenirler.
DSB onarımını incelemek için kullanılan çeşitli başka yöntemler vardır. Bunların birçoğu immünofloresan (IF) mikroskopisi 1,14'e dayanmaktadır. IF mikroskopisi, DSB'ler genotoksik kimyasallara veya iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalarak indüklendikten sonra onarım komplekslerini temsil eden ayrı nükleer odakları tespit eder15,16. Bu odakların oluşumunu ve çözünürlüğünü izlemek, sırasıyla14,17 onarımın başlatılması ve tamamlanmasının bir göstergesidir. Bununla birlikte, bu DSB indüksiyon yöntemleri (yani, kimyasallar veya iyonlaştırıcı radyasyon), genomda tanımlanmış yerlerde DSB'lere neden olmaz. Ayrıca, bunları DSB'lerin yalnızca küçük bir sayısını (örneğin, 2-4) tutarlı bir şekilde indüklemek için kullanmak işlevsel olarak imkansızdır. Sonuç olarak, DSB'leri indüklemek için en sık kullanılan yöntemler, genom boyunca rastgele dağılmış çok sayıda lezyona neden olur18. Nadir kesen bir endonükleaz için tanıma bölgesi yerleştirilerek ve I-Sce119 gibi ilgili endonükleazı eksprese ederek az sayıda DSB tanıtılabilir. Ne yazık ki, bir hedef bölgenin gerekli entegrasyonu, DSB'nin endojen genomik lokuslarda incelenmesini önler.
Bu makalede, kullanıcı tanımlı bir lokusta üretilen bir DSB'nin onarımı ile ilişkili mutasyonları tespit etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir viral proteinin bir DSB ile ilişkili mutasyon sayısını artırma yeteneğini değerlendirmek için uygulanan yaklaşımın temsili bir örneğini sunuyoruz. Spesifik olarak, bu makalede, vektör kontrolünü ifade eden insan sünnet derisi keratinositlerinde (HFK LXSN) ve insan papilloma virüsü tip 8'in (HFK 8E6) E6 proteinini eksprese eden HFK'da insan CD4 açık okuma çerçevesinde bir DSB'yi indüklemek için bir CAS9 endonükleazını yönlendirmek için tek bir kılavuz RNA'nın (sgRNA) kullanımı açıklanmaktadır. Kırılmayı çevreleyen bölgenin hedefli yeni nesil dizilimi (NGS), lezyonun onarımı ile ilişkili mutasyonların titizlikle tanımlanmasını sağlar. Bu veriler, viral proteinin DSB onarımı sırasında mutasyonlarda yaklaşık 20 kat artışa neden olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tüm genom dizilemesine gerek kalmadan tek bir lokusta DSB'lerin mutajenik sonuçlarının tarafsız bir karakterizasyonunu sağlar. Prensip olarak, protokol, genom lokusları veya hücre hatları arasındaki göreceli mutasyon riskini karşılaştırmak için kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89167-794</td>
			<td>BCA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5910 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000772</td>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomic Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>832001</td>
			<td>deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microplate Genie pulse</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-400A</td>
			<td>Plate shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA191878</td>
			<td>Anti-FLAG antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epilife CF Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MEPICF500</td>
			<td>Cell cultrue media and supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td>Cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11012</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighPrep PCR Clean-up system</td>
			<td>MagBio</td>
			<td>AC-60005</td>
			<td>Bead-based PCR cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK2600</td>
			<td>PCR mastermix/PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagAttract HMW DNA kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>67563</td>
			<td>High Molecular Weight DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stand-96</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10027</td>
			<td>96-Well Magnetic Rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A37834</td>
			<td>Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300-cycle cartridge/sequencing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Library preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Kit v2 Set A</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20027215</td>
			<td>Indexes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>260251</td>
			<td>deep well 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100X)</td>
			<td>Calsson Labs</td>
			<td>PSL02-6X100ML</td>
			<td>Antibiotics for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>px330-CD4</td>
			<td>Addgen</td>
			<td>136938</td>
			<td>SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5&#8217;- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel Advanced System</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td>capillary electrophersis machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAxcel DNA screening kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>929004</td>
			<td>DNA buffer/ capillary electrophersis tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x ds HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q23851</td>
			<td>Fluorometer reagents/1x dsDNA solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td>Fluorometer assay tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVN653-100ML</td>
			<td>Lysis buffer for protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xfect Transfection Reagent</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631318</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>genomic data analysis software</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>CLC Workbench v21.0.</td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using next generation sequencing to identify mutations associated with repair of a cas9-induced double strand break near the cd4 promoter

DNA'daki çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) DNA hasarının en sitotoksik türüdür. Sayısız hakaret bu lezyonlara neden olabileceğinden (örneğin, replikasyon stresi, iyonlaştırıcı radyasyon, onarılmamış UV hasarı), DSB'ler her gün çoğu hücrede görülür. Hücre ölümüne ek olarak, onarılmamış DSB'ler genom bütünlüğünü azaltır ve ortaya çıkan mutasyonlar tümörigenezi tetikleyebilir. Bu riskler ve DSB'lerin prevalansı, hücrelerin bu lezyonları onarma mekanizmalarına yönelik araştırmaları motive etmektedir. Yeni nesil dizileme, DSB onarım kusurlarıyla ilişkili mutasyonları tam olarak tanımlamak için güçlü bir araç sağlamak üzere iyonlaştırıcı radyasyonla DSB'lerin indüksiyonu ile eşleştirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, iyonlaştırıcı radyasyonla ilişkili rastgele oluşan DSB'lerin onarımını tespit etmek için hesaplama açısından zorlu ve maliyet engelleyici tüm genom dizilemesini gerektirir. I-Sce1 gibi nadir kesici endonükleazlar, tek bir DSB üretme yeteneği sağlar, ancak tanıma bölgeleri ilgilenilen genoma yerleştirilmelidir. Sonuç olarak, onarım bölgesi doğal olarak yapaydır. Son gelişmeler, kılavuz RNA'nın (sgRNA) bir Cas9 endonükleazını ilgilenilen herhangi bir genom lokusuna yönlendirmesine izin vermektedir. Bu, Cas9 kaynaklı DSB'yi çevreleyen DNA'ya odaklanmasına izin vererek yeni nesil dizilemeyi daha uygun maliyetli hale getiren DSB onarımı çalışmasına uygulanabilir. Makalenin amacı, CD4 geninin bir DSB yukarı akışının onarımından kaynaklanan mutasyonları tanımlayabilen bir protokol sunarak bu yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermektir. Protokol, onarım inhibitörleri, viral protein ekspresyonu, mutasyonlar ve nispeten sınırlı hesaplama gereksinimlerine sahip çevresel maruziyetler gibi eksojen faktörlerle ilişkili DSB'nin mutajenik potansiyelindeki değişiklikleri belirlemek için uyarlanabilir. Bir organizmanın genomu dizilendikten sonra, bu yöntem teorik olarak herhangi bir genomik lokusta ve o organizmanın transfekte edilebilen herhangi bir hücre kültürü modelinde kullanılabilir. Yaklaşımın benzer uyarlamaları, aynı genetik arka plandaki farklı lokuslar arasındaki onarım sadakatinin karşılaştırılmasına izin verebilir.

Bu protokol için üç temsili sonuç sunulmuştur. Şekil 1 , HFK kontrolünde (LXSN) CAS9 ekspresyonunu doğrulayan bir immünoblot ve beta-HPV 8E6 (8E6) ekspresyonunu HFK'dır. Transfeksiyondan 48 saat sonra, tüm hücre lizatları toplandı ve daha sonra bir anti-CAS9 antikoru (veya yükleme kontrolü olarak GAPDH) ile incelendi. Sonuç, HFK LXSN ve HFK 8E6'nın, transfeksiyon verimliliğinin iki hücre hattı arasında benzer olduğunu gösteren benzer m...

Watch this Scientific Journal Video about Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter at JoVE.com

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Bu protokol, tek kılavuzlu RNA ve CAS9 tarafından indüklenen çift iplikçikli bir kopmanın onarımı sırasında meydana gelen mutasyonları tanımlamanıza yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir genomik lokustaki mutasyonları tespit etmenin uygun maliyetli ve sağlam bir yolu olmasıdır. Örnek olarak insan keratinositini kullanıyoruz, ancak bu protokol herhangi bir transfektabl hücre hattına uyarlanabilir.Bu protokolü gösteren, laboratuvarımızdan bir lisans asistanı olan Taylor Bugbee olacaktır. Başlamak için, kültür HFK LXSN ve HFK 8E6 hücreleri, insan keratinosit büyüme takviyesi ve% 1 penisilin streptomisin içeren keratinosit kültür ortamı içeren bir ceket inkübatöründe% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 10 santimetrelik plakalarda. Kültür ortamını üç mililitre tripsin-EDTA ile değiştirin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra, tripsini eşit miktarda FBS takviyeli medya ile nötralize edin. Şimdi, hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. İnsan keratinosit büyüme takviyesi ile 10 mililitre keratinosit kültür ortamı ile hücreleri yeniden askıya alın ve bir hemositometre ile hücrelerin konsantrasyonunu belirleyin.Daha sonra, insan keratinosit büyüme takviyesi ve% 1 penisilin streptomisin ile dört mililitre keratinosit kültür ortamında HFK LXSN ve HFK 8E6 hücreleri için her biri iki plaka tohumlayın. Tohumlamayı takiben, hücreleri bir ceket inkübatöründe 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Transfeksiyon gününde, medyayı üç mililitre antibiyotiksiz takviyeli medya ile değiştirin ve bir ceket inkübatöründe 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin.Hücreleri transfekte etmek için, transfeksiyon reaktiflerini oda sıcaklığına ısıtın ve kullanmadan önce nazikçe pipetleyin. Her hücre hattı için iki steril 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne uygun miktarda transfeksiyon tamponu yerleştirin ve bunları tüp bir olarak etiketleyin ve sahte transfeksiyon veya tüp iki. Daha sonra, bir tüpe iki mikrogram plazmid DNA'sı eksprese eden, CAS9, tek kılavuzlu, RNA hedefli insan CD4'ü ekleyin ve tamamen karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin.İkinci tüpe eşit miktarda steril su ekleyin. DNA karışımı ve sahte transfeksiyon veya tüp iki ile bir tüpe uygun miktarda transfeksiyon reaktifi ekleyin. Bir pipet kullanarak, yavaşça tamamen karıştırın ve kompleksleri oluşturmak için oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin.Transfeksiyon karışımını plakaya damla damla ekleyin ve transfeksiyon karışımını eşit şekilde dağıtmak için kültür plakasını bir dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Hücreleri tripsinizasyon yoluyla hasat etmek için, kültür ortamını bir mililitre tripsin EDTA ile değiştirin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tripsini eşit miktarda FBS takviyeli medya ile nötralize edin.Her hücre plakası için, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 300 kez G'de eşit alikotlu ve santrifüjlü iki mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini dizileme için bir mililitre PBS'de bir tüpten ve başka bir tüpte, immünoblot için buz gibi soğuk PBS ile yeniden askıya alın. Transfekte edilmemiş ve transekte HFK hücrelerinde CAS9 ekspresyonunu karşılaştırmak için immünoblot testi yapıldı.Sonuçlar, transfekte edilmemiş ve transekte HFK hücrelerinin benzer miktarda CAS9 eksprese ettiğini ve transfeksiyon verimliliğinin iki hücre hattı arasında benzer olduğunu göstermektedir. SgRNA/CAS9 transfekte hücrelerinde fosforile histon H2AX S139'un immünofloresan mikroskopi görüntüleri ve transfekte edilmemiş kontrol elde edildi. Sonuçlar, iki çift iplikçik kırılmasının CAS9 SgRNA tarafından indüklendiğini gösterdi.Genomik varyasyonlar, HFK LXSN ve HFK 8E6'daki mutasyonel olay türlerine göre gruplandırıldı; burada her bir genomik varyasyon grubu ve toplam varyasyon sayısı HFK LXSN ve HFK 8E6 arasında karşılaştırıldı. Sonuçlar, 8E6'nın CAS9 kaynaklı çift iplikçik kırılmaları etrafında 200 kilobaz içindeki genomik varyasyonları arttırdığını ve HPV 8E6'nın çift iplikçik kırılması onarımını deregüle ettiğini ve genomik instabiliteyi arttırdığını gösterdi. İmmünoblotun amacı, veri analizi sırasında göz önünde bulundurulması gereken transfeksiyon verimliliğini ölçmektir.Transfeksiyon verimliliğine ek olarak, immünofloresan mikroskopi, bir belirteç olarak fosfo-H2AX kullanılarak çift iplikli kırılma indüksiyonunu doğrulamak için kullanılabilir. Örnek olarak HPV 8E6 beta sürümünü kullanıyoruz. Bu teknik, küçük molekül inhibitörleri gibi diğer reaktiflerin neden olduğu mutasyon sıklığı veya tipindeki değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Hedef yeni nesil sıralama ve Biyoinformatik boru hattı anayasal hastalığı genetik belirleyicileri değerlendirmek için

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...