Name: small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for myg opdræt. Finansieringen blev ydet af University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er donald Bren professor ved University of California, Irvine.

Erklæring om dyreetik Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health. Protokoller blev godkendt af de institutionelle Animal Care and Use Udvalg ved University of California (Animal Welfare Assurance Numbers A3416.01).
1. Oversvømmelsesfrigivelsesforsøg på ikke-gendrev myg (Figur 1)
<ol><li>Opsætning og vedligeholdelse af bure<ol>
<li>Opsætning af tre sæt tredolicere 0,216 m3 bure ved at tilføje 60 anden-instar wild-type (WT) larver i hvert bur over tre på hinanden følgende uger. BEMÆRK: Det er ikke muligt at bestemme kønnet på anden-instar larver ved let mikroskopi, så prøverne tilsat til hvert bur vil bestå af både mænd og kvinder.</li>
		<li>Ved hver uge skal voksne kvinder i hvert bur forsynes med bedøvede mus som blodmelskilde (Figur 2A) og en fårpositionsbeholder 3 dage efter blodmelet. BEMÆRK: Mens et alternativt kunstigt fodringsapparat kan bruges, resulterer det i bedre myggefodringsydelse i disse store (0,216 m3) burformater, der giver levende bedøvede mus til blodmel. Dette kræver en godkendt protokol for dyrebrug og relevant (f.eks. Udvalget for Institutionel Dyrepleje og Anvendelse, IACUC) til brug af mus. BEMÆRK: Enkelte mus bedøves med en blanding af 4 mg/mus ketamin HCl og 0,4 mg/mus xylazine. Dyr injiceres med mellem 0,1 - 0,5 mL af denne blanding.</li>
		<li>Hatch æg fra hvert bur ugentligt og vælg 60 second-instar (L2) larver tilfældigt, der skal returneres til deres respektive bure for at udligne dødeligheden (uge 4-8). BEMÆRK: Trin 1.1.1 til 1.1.3 er nødvendige for at etablere en stabil og distribueret aldersstruktureret population i burene - benævnt "indledende fase".</li>
		<li>I uge 9 tildeles bure samlet i trin 1.1.1 tilfældigt i triplikater for udgivelser af det ønskede mandlige frigivelsesforhold.<ol>
<li>Udpege et sæt tredelte bure som kontrol for at vurdere konsistensen i hele eksperimentet.</li>
			<li>Angiv et sæt triplikater for hvert ønsket frigivelsesforhold (f.eks. 1:1 eller 1:0.1 transgene:WT-hanner). BEMÆRK: Dette punkt på kaldes 'Eksperimentel fase'.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Replikerer og frigiver nøgletal<ol>
<li>Tilsæt 60 WT pupper (30 hanner og 30 hunner) til kontrolburene ugentligt.</li>
		<li>For at opretholde et 1:1-forhold skal du tilføje ugentlige 30 transgene hanunge sammen med 60 (30 mandlige og 30 kvindelige) WT-pupper i hvert respektive bur.</li>
		<li>For at opretholde en 1:0.1 forhold, tilføje ugentlige 300 transgene mandlige pupper sammen med 60 (30 mandlige og 30 kvindelige) WT pupper i hvert respektive bur. BEMÆRK: Fortsat tilsætning af vilde myg til burene opretholder burtætheden, som forventes at falde ugentligt på grund af aldersrelateret voksendødelighed.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Screening af fænotyper<ol>
<li>Vælg i alt 300 larver fra hvert bur tilfældigt. Ved brug af et stereomikroskop udstyret med fluorescensfiltre skal du screene for at udtrykke den fluorescerende dominerende markør i larve- og pupalstadiet og score kønnet på de resulterende voksne (figur 3). BEMÆRK: Den fænotype screening vil afhænge af den dominerende markør, der indgår i transgenekonstruktionen, der er integreret i myggene (f.eks. Discosoma sp. rødt fluorescerende protein [DsRed], cyan fluorescerende protein [CFP], grønt fluorescerende protein [GFP]), og af promotoren, der driver sit udtryk (den mest anvendte i mygtransgenese er 3xP3-promotorens kørselsudtryk i øjne og nervestreng).</li>
		<li>Følg denne protokol i så mange generationer som krævet af de resultatparametre, der er defineret i forsøgsdesignet. BEMÆRK: Forsøget afsluttes normalt, når alle myg har mindst en kopi af transgenen (bestemt af tilstedeværelsen af den dominerende fluorescerende markør), eller forholdet mellem transgene til WT myg i et bur stabiliseres og svinger ikke meget efter et par (3-5) generationer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Overlappende generation forsøg med gen-drev myg (Figur 4)
BEMÆRK: Myg, der transporterer gendrevsystemer, kræver skriftlige og reviderede protokoller og bør godkendes af en institutionel biosikkerhedskomité (IBC) eller tilsvarende og andre, hvor det er nødvendigt. Mygge indeslutning (ACL 2 + niveau) bør følge anbefalede procedurer5,6,7. Konkret bør gendrevsforsøgene anvende to strenge indespærringsstrategier. Den første er normalt fysiske barrierer (Barrierestrategi) mellem organismer og miljøet. Dette kræver, at der er en sikker insekt- og standarddriftsprocedurer (herunder overvågning) for at sikre, at myg ikke kan undslippe. Den anden indespærringsstrategi kan være molekylær, økologisk eller reproduktiv5.
<ol><li>Opsætning af bur<ol>
<li>Opsætning af to sæt tredolicere 0,216 m3 bure for hver ønsket transgen: WT mandlige frigivelsesforhold.<ol>
<li>For at opnå en mandlig frigivelsesforhold på 1:1, tilsæt 120 transgene mænd, 120 WT mænd og 120 WT hunner på puppestadiet til hvert replikeret bur.</li>
			<li>For at opnå et frigivelsesforhold på 1:10 tilsættes 12 transgene mænd, 120 WT-hanner og 120 WT-hunner på puppestadiet til hvert replikeret bur. BEMÆRK: Forskellige frigivelsesforhold kan testes (1:1, 1:3, 1:10 osv.), og antallet af myg, der bruges til at indlede forsøgene, varierer i overensstemmelse hermed. Det er dog vigtigt at overveje virkningerne af lave tal på den statistiske evaluering af dataene.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vedligeholdelse og screening af befolkningen<ol>
<li>Giv 4-7 dage gamle hunner i hvert bur med et blodmåltid ved hjælp af bedøvede mus (Figur 2A).</li>
		<li>Tre dage efter blodmelet skal du indsætte en ovipositionsbeholder i hvert bur.</li>
		<li>Hatch æg i en larve bakke, skal du vælge ~ 240 første instar (L1) larver tilfældigt fra hvert bur, bageste dem til voksenalderen, og returnere dem til deres respektive bure.</li>
		<li>Giv yderligere (2-3) blod måltider hver 3-4 dage for de nyligt fremkomne voksne som beskrevet i trin 2.2.1. BEMÆRK: Der tilsættes ingen yderligere transgene mænd i nogen af de efterfølgende generationer.</li>
		<li>Vælg i alt 300 larver fra hvert bur tilfældigt og screen dem for tilstedeværelsen af den dominerende markør fænotype på larve- og pupal stadier ved hjælp af et fluorescens stereomikroskop og score nye voksne til sex (Figur 3). BEMÆRK: Som tidligere vil den fænotypiske screening afhænge af den dominerende markør og promotor, der er inkluderet i gendrevssystemet og integreret i de transgene myg (f.eks. DsRed, CFP eller GFP). Hvis homozygot eller heteroallelic forstyrrelser af de målrettede gener resultere i en synlig fænotype (for eksempel gener relateret til øjenpigmentering), screening af dette træk vil afhænge af, hvilket stadium det er nemmest at visualisere den ændrede fænotype.</li>
		<li>Følg denne protokol i så mange generationer som krævet af de resultatparametre, der er defineret i forsøgsdesignet. BEMÆRK: Hver generation (afgrænset af blodmelet) tager ~ tre uger. Forsøget afsluttes normalt, når alle myg anses for homozygoe for gendrevskonstruktionen, eller populationerne stabiliseres ved en maksimal procentdel af myg, der bærer mindst en kopi af gendrevskonstruktionen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ikke-overlappende generation forsøg med gendrev myg (figur 5).
<ol><li>Opsætning af bur<ol>
<li>Opret tredolicere 0,005 m3 bur populationer for hver specifik frigivelse forholdet mellem transgenics til WT hanner, der skal undersøges (for eksempel tre sæt tre gange bure hver oprettet med 1:1, 1:3, 1:10 release ratios). Opret alle bure med et lige samlet antal mænd og kvinder. BEMÆRK: Den supplerende fil er en video, der demonstrerer opførelsen af 0,005 m3 koloni bur.<ol>
<li>Tilføj 50 transgene hanner, 50 WT hanner og 100 WT-hunner til hver af tre replikerede bure for at opnå et 1:1 mandligt frigivelsesforhold.</li>
			<li>Tilføj 25 transgene hanner, 75 WT hanner og 100 WT hunner til hver af tre replikerede bure for at opnå et 1:3 mandligt frigivelsesforhold.</li>
			<li>Tilføj 9 transgene hanner, 90 WT hanner og 100 WT hunner til hver af tre replikerede bure for at opnå et 1:10 mandligt frigivelsesforhold. BEMÆRK: Forskellige frigivelsesforhold kan testes, og antallet af myg, der bruges til at starte forsøgene, kan variere i overensstemmelse hermed. Det er dog vigtigt at overveje virkningen af lavt antal myg på de statistiske analyser. Disse er enkelt udgivelser; der tilsættes ingen yderligere transgene hanner ved en efterfølgende generation.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Vedligeholdelse og screening af befolkningen<ol>
<li>Giv de 4-7 dage gamle hunner i hvert bur blodmåltider ved hjælp af et kunstigt fodringsapparat (figur 2B) to på hinanden følgende dage. BEMÆRK: Rutinemæssige blodmåltider til kvinder består af en kommercielt tilgængelig blodkilde (f.eks. kalveblod), der leveres fra et fodringsapparat. Levende bedøvede mus bruges kun til at give blodmel i større (0,216 m3) burformater for bedre fodringsydelse.</li>
		<li>Tilsæt en oviposition beholder 3 dage efter den anden blodmel. Efter tre dage skal du fjerne ovipositionsbeholderne. BEMÆRK: På dette trin kan 5-10 kvinder vælges tilfældigt fra hvert bur og placeres individuelt i hætteglas for at vurdere yderligere fitnessparametre, såsom frugtbarhed og fecundity, hvis det er nødvendigt.</li>
		<li>Score efter køn alle voksne (døde og levende) tilbage i buret og gemme dem på -80 ° C for molekylær analyse.</li>
		<li>Hatch æg og tilfældigt vælge 200 L1 larver fra 1:1 og 1:3 forholdet bure til at befolke nye bure til den næste generation. BEMÆRK: På grund af den lave hyppighed af at starte transgen person i 1:10-forholdet bure, stikprøver kan føre til overdreven tab af transgene afkom i den næste generation til at fortsætte befolkningen.</li>
		<li>For at sikre en nøjagtig prøveudtagning for 1:10 burene og et tilstrækkeligt antal transgene myg skal du screene alle larver for den dominerende markør og vælge 200 larver, der afspejler den observerede transgenefrekvens for at befolke de nye bure. BEMÆRK: 1:10 burene kan opretholdes identisk med 1:1 og 1:3 bure, når de når en transgene frekvens på ≥80%.</li>
		<li>Vælg 500 larver fra hvert bur tilfældigt til en dybdegående analyse. Skærm under et fluorescens stereomikroskop for de forventede markørfænotyper i larve- og pupalstadiet og scorer køn hos voksne (figur 3). BEMÆRK: 'Ekstraordinære' fænotyper kan vælges til at blive yderligere krydset og analyseret molekylært for at overvåge resistent alleledannelse.</li>
		<li>Denne protokol kan følges i så mange generationer som krævet af de resultatparametre, der er defineret i det eksperimentelle design. BEMÆRK: Hver generation er afgrænset af blodmelet og tager ~ tre uger. Forsøget afsluttes normalt, når alle myg anses for homozygot for gendrevskonstruktionen, eller populationerne stabiliseres ved en maksimal forekomst af transgene myg. Og som før vil screening for fænotyper afhænge af de dominerende markører og promotor integreret i de transgene myg (for eksempel DsRed, CFP, GFP) eller i de målrettede gener, hvis de præsenterer en synlig fænotype (for eksempel gener relateret til øjenpigmentering).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).</li><li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory.">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods.">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li><li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing.">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li><li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms.">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li><li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector.">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingen oplysninger.

Genetisk manipulerede myg, der har patogenblokerende evne eller bærer sterilitetsgener, udgør nye værktøjer til at kontrollere vektorbårne sygdomme. I betragtning af de mange parametre, der omfatter disse alternative tilgange, består et kritisk skridt i deres forskning af laboratoriebegrænsede eksperimentelle evalueringer, der giver mulighed for en hurtig og sikker forudsigelse af de potentielle resultater af en syntetisk transgenefrigivelse til kontrolformål1.
Fordi overvågningen af transgene dynamik i bur populationer kan strække sig i flere måneder, en af de centrale aspekter af protokollerne er konsistensen i eksperimentelle design mellem replikater (herunder myg opdræt, bur størrelse, aldersstrukturerede befolkninger, faste frigivelse nøgletal, stabile blodmel kilder og minimalt invasive screening procedurer).
Han-only udgivelser betragtes som ideelle, fordi mandlige myg hverken overfører patogener eller fodrer på mennesker, derfor kan de sikkert introducere arvelige egenskaber i vilde populationer. I laboratorieburforsøg er det muligt at opdage transgene stammer med nedsat mandlig parrings konkurrenceevne og andre fitnessbelastninger forbundet med transgeneintegration. Men direkte og specifikke eksperimenter, som dem, der udføres i store bure10, kan udføres for korrekt at analysere mandlige konkurrenceevne, samt kvindelige fecundity i mere naturlige myg tætheder2. Desuden kan empiriske data fra burforsøgene bruges til at parameterisere modeller af burpopulationsdynamik, herunder resistent alleldannelse, og give nyttige oplysninger om effektivitet og mulige justeringer i den foreslåede teknologi.
De protokoller, der er beskrevet her, kan nemt tilpasses andre eksperimentelle designs efter behov med minimale krav til regelmæssig insektinfrastruktur og forhold. Hertil kommer, bortset fra de kommercielle bure og mikroskoper, de fleste af materialerne er billige og tillader billige flere gentagelser og gentagelser af forsøgene. Dette gør det især også muligt at forhåndsscreene flere transgene stammer i små burforsøg for at prioritere de bedst præsterende kandidater, der skal fremmes i den trinvise testvej, og for at suspendere testning af dem, der viser suboptimale præstationer.
Endelig er bekymring over anvendelsen af genetisk modificerede organismer motiverer udarbejdelsen af rammer for udvikling, evaluering og anvendelse af genetiske strategier til forebyggelse af mygbårne sygdomme5,8,9. Relevansen og udførelsen af de protokoller, der er defineret her, er i overensstemmelse med disse retningslinjer.

Strategier baseret på genetisk manipulerede myg forfølges for at kontrollere overførsel af vektorbårne patogener som dem, der forårsager malaria1. Disse omfatter teknologier 1), der har til formål at reducere antallet og tæthederne af Anopheles myg (befolkning undertrykkelse), eller 2) med henblik på at forringe evnen af vektorer til at overføre parasitter ansvarlig for menneskers sygdom (befolkning modifikation, udskiftning, eller ændring), hvori stammer af vektorer er manipuleret til at udtrykke effektor gener, der forhindrer patogen transmission. Disse genetiske tilgange er blevet styrket af fremkomsten af CRISPR / Cas9-baserede gendrev, med proofs-of-concept i parasit-transmitterende myg af effektiv spredning af nyttelast træk samt anti-parasitiske effektor molekyler i bur populationer.
Små laboratorieburforsøg er et første skridt til evaluering af de karakteristiske træk ved transgene stammer som led i en trinvis tilgang til deres videre udvikling i retning af feltanvendelser2. Specifikke resultatovervejelser omfatter arvelighed af det indførte DNA i et konkurrencepræget miljø, penetrance og ekspressivitet af fænotypen og stabilitet. Relevante eksperimentelle designfunktioner omfatter burenes størrelse, myggetætheder, antal gentagelser, overlappende eller ikke-overlappende generationer, aldersstrukturerede målpopulationer, enkelt- eller flere udslip af manipulerede stammer, kun for mænd, udslip af kvinder eller blandet køn, frigivelsesforhold, blodmelkilder (kunstige eller levende dyr) og screeningsprocedurer.
Vi beskriver her protokoller, der anvendes til at evaluere stammer af anopheline myg for oversvømmelsesfrigivelser (ingen gendrev system) og dem, der bærer autonome gen-drev systemer medieret af Cas9 endonucleaser og guide RNA (gRNA). Anvendelsen af disse protokoller findes i Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, og Adolfi et al. (2020) 4.
Oversvømmelsesfrigivelsesforsøg evaluerer spredningshastigheden af en designet transgene under mendelian arv efter flere udgivelser af et stort antal transgene myg til en vild befolkning. Uden fastgørelse af transgene til et drevsystem giver data fra oversvømmelsesfrigivelsesforsøg oplysninger om egnetheden og dynamikken i transgene af interesse i en stabiliseret befolkning.
Når mygpopulationer indeholder et autonomt gendrevsystem, er små burforsøg designet til at vurdere dynamikken i spredningen af den ønskede transgene ved at bestemme hastigheden af dominerende markørforøgelse efter en enkelt introduktion af transgene mænd. Autonome gendrevselementer bærer de gener, der vedkodning af Cas9-nuklease, gRNA og dominerende markør, der er forbundet på en sådan måde, at de er aktive i de efterfølgende generationer.
»Overlappende« generationer henviser til den samtidige tilstedeværelse af flere generationer i samme bur for at skabe en aldersstruktureret kontinuerlig befolkning, mens "ikke-overlappende" henviser til enkelte diskrete generationer i hver af de på hinanden følgende burpopulationer2. Gendrevburforsøg kan afsluttes, når den oprindelige dynamik i drevhastigheden (konverteringsfrekvensen) kan bestemmes (8-10 generationer afhængigt af konstruktionen), og mens de giver oplysninger om transgenenes kortsigtede stabilitet i mygpopulationen, kan de ikke afsløre, hvad der sker, når og hvis de dominerende markørfrekvenser når eller er tæt på fuld introduktion (hver myg, der bærer mindst en kopi af gendrevsystemet).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial feeders</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>SP6W1-3</td>
			<td>Starter pack &#8211; 6 feeders with 3ml reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage, commercial</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1450D</td>
			<td>Collapsible Cage, 24 X 24 X 24&#34; - 0.216 m3 (60 cm3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage tub (popcorn)</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>VP170-0006</td>
			<td>0.005 m3 (170 fl oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with fluorescence light and filters</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue sticks</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>88646598807</td>
			<td>Gluesticks 40 pk,&#160; 0.4X4&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Woodwards Ace</td>
			<td>2382513</td>
			<td>Stanley, 40 watt, GR20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon screen (netting)</td>
			<td>Joann.com</td>
			<td>1102912</td>
			<td>Tulle 108&#34; Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oviposition cups</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>259126</td>
			<td>Beaker PP grad 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor cutting tool</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>487899</td>
			<td>Box cutters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>978561</td>
			<td>Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>908194</td>
			<td>Swingline Commercial Desk Stapler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sleeve (stockinette)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56612-664</td>
			<td>~48 cm (19&#8221;) cut from bolt ~15 cm (6&#8221;) X ~23 m (25y)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>295715</td>
			<td>Pk of 100, 14&#8221; cable ties - 35.6 cm (14 in)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes

Kontrol med myggebårne patogener ved hjælp af genetisk modificerede vektorer er blevet foreslået som et lovende redskab til at supplere konventionelle kontrolstrategier. CRISPR-baserede sporingsgendrevsystemer har gjort transgene teknologier mere tilgængelige inden for det videnskabelige samfund. Evaluering af transgene myg ydeevne og sammenligninger med vilde-type kolleger i små laboratoriebur forsøg giver værdifulde data til udformningen af efterfølgende felt bur eksperimenter og eksperimentelle vurderinger for at forfine strategier for sygdomsforebyggelse. Her præsenterer vi tre forskellige protokoller, der anvendes i laboratoriemiljøer til at evaluere transgene spredning i anopheline myg vektorer af malaria. Disse omfatter oversvømmelsesfrigivelser (intet gendrevsystem) og gendrev overlappende og ikke-overlappende generationsforsøg. De tre forsøg varierer på en række parametre og kan tilpasses de ønskede eksperimentelle indstillinger. Desuden er insektundersøgelser i små bure en del af den gradvise overgang af manipulerede insekter fra laboratoriet til åbne feltudslip. Derfor repræsenterer de protokoller, der er beskrevet her, uvurderlige værktøjer til at tilvejebringe empiriske værdier, der i sidste ende vil hjælpe med gennemførelsen af nye teknologier til udryddelse af malaria.

Transgene anopheline myg genereret til at bære ikke-gendrev eller autonome gendrevsændringer er oprettet til burforsøg som beskrevet i afsnittet Protokoller. De repræsentative resultater, der vises her, skildrer fænotypen dynamikken i de bedst præsterende replikker af hver af burforsøgene udført af Pham et al. (2019) 2 for Anopheles stephensi myg. De tre forsøg (henholdsvis 1 - 3: oversvømmelsesfri ikke-gendrev, overlappende gendrev og ikke-overlappende gendrev) varierede på forskellige parametre, såsom burets størrelse (0,216 m3 vs. 0,005 m3), uanset om målpopulationen var aldersstruktureret, kilde til blodmel (mus eller kunstig føder) og frigivelsesforhold. Som et repræsentationsmiddel viser figur 6 de observerede data, der er udvalgt fra samme frigivelsesforhold (1:1) for alle de tre anvendte protokoller i løbet af syv generationer.
1:1-versionen uden for drevet når >80% transgene introduktion inden for 6-7 generationer. For gendrevne transgene burforsøg når 1:1-udgivelserne i både de ikke-overlappende og overlappende protokoller dette niveau inden for 3-4 generationer, hvilket validerer forventningen om, at en enkelt frigivelse af et gendrevsystem kan være mere effektivt end ikke-drev oversvømmelsesfrigivelser til transgene introduktion. Den hurtigere bane kan også bekræftes af trendlinjernes hældning. Begge gendrevsprotokoller, på trods af forskellige opsætninger, præsenterer lignende vinkler og hældningstendenser. I slutningen af observationen opnår ikke-drevbure ~ 80% af individer, der bærer transgenen, mens bure med gendrev individer når fuldstændig (eller næsten komplet) introduktion. Komplet data og behandling detaljer om individuelle eksperiment resultater ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet her kan findes i figur 1-3 af Pham et al. (2019) 2, Figur 2-3 af Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3 og figur 3 i Adolfi et al. (2020) 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig01.jpg"> Figur 1. Ikke-drev oversvømmelsesfrigivelse forsøg skematisk.  Ni 0,216 m3 bure er oprettet med 60 vilde-type anden-instar (blandet køn) larver tilsat til hver. Fra uge 3 får hunner en blodmel ugentlig, og æg indsamles og klækkes. Indtil uge 8 udvælges 60 larver tilfældigt og returneres til deres respektive bure ugentligt for at skabe en aldersstruktureret befolkning i burene (indledende fase). Fra uge 9 tildeles de ni bure tilfældigt i tredotel i henhold til deres transgene:vilde mandlige frigivelsesforhold (eksperimentel fase). BurE A (Kontrol) har ingen transgen pupper tilføjet. Kvinder får en blodmel ugentligt og æg indsamles, klækkes, og opdrættes til pupper. 30 han- og 30 hununge af vilde unger lægges tilbage til deres bure. Bure 1:1 har yderligere 30 transgene han pupper tilføjet. Bure 1:0.1 har yderligere 300 transgene han pupper tilføjet. 300 larver fra hvert af de 9 bure vælges tilfældigt og screenes for fluorescerende markør. Denne procedure blev gentaget ugentligt indtil transgene fiksering (stabiliseret forhold mellem transgenic-wildtype myg efter et par generationer). Tilpasset fra Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig02.jpg"> Figur 2. Blodfodring af burpopulationer.  (A) Bedøvede mus eller (B) Hemotek-blodfodere tilbydes til blodfodring af kvindelige myg på henholdsvis 0,216 m3 burene eller de små 0,005 m3 bure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig03.jpg"> Figur 3. Screening fænotyper for ikke-drev, overlappende gen-drev og ikke-overlappende gen-drev bur forsøg.  Fluorescerende billeder af en larve, puppe og voksen af transgene eller vilde fænotyper. I dette eksempel blev An. stephensi individer screenet for DsRed-markøren drevet af 3xP3-promotoren i øjnene (DsRed + eller DsRed-), synlig i alle tre faser, og voksne blev screenet for sex ( ♀ eller ♂ ). Bemærk baggrunden fluorescens i vilde larver forbundet med maden bolus i midgut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig04.jpg"> Figur 4. Overlappende gendrev bur forsøg skematisk.  Seks 0,216 m3 bure er oprettet i tredobling i henhold til deres gen-drev:wild-type mandlige frigivelse nøgletal. 120 vilde mænd og 120 vilde hunner blev tilføjet til hvert bur. Bure med en 1:1 gen-drev mandlige frigivelsesforhold havde en yderligere 120 transgene mænd tilføjet. Bure med en 1:10 mandlige frigivelse ratio havde en yderligere 12 transgene mænd tilføjet. Indtil fuld introduktion af transgene, hver 3. uge, er voksne kvinder forsynet med blodmel og æg indsamles og udklækkes. I alt 240 larver blev udvalgt tilfældigt og returneret til deres respektive bure. Tre hundrede (300) larver vælges tilfældigt og screenes for den dominerende markør. De er senere screenet som pupper og voksne for øjenfarve og sex. Der tilsættes ingen yderligere transgene hanner til de oprindelige bure. Tilpasset fra Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig05.jpg"> Figur 5. Ikke-overlappende gendrev bur forsøg skematisk.  Ni små 0,005 m3 bure er oprettet i tredolicere i henhold til deres gen-drev:wild-type mandlige frigivelse nøgletal. Bure med en 1:1 mandlige frigivelsesforhold har 100 vilde-type kvinder, 50 vilde-type mænd, og 50 gen-drev mænd tilføjet. Bure med en 1:3 mandlige frigivelsesforhold har 100 vilde-type kvinder, 75 vilde-type mænd, og 25 gen-drev mænd tilføjet. Bure 1:10 mandlige frigivelsesforhold har 100 vilde-type kvinder, 90 vilde-type mænd, og 9 gen-drev mænd tilføjet. Kvinder får et blodmåltid og æg indsamlet og udklækket. For 1:1 og 1:3 bure vælges 200 larver tilfældigt og bruges til at befolke nye bure, adskilt fra deres forældres, til den næste generation. Yderligere 500 larver vælges tilfældigt og opdrættes til pupper, når de screenes for det dominerende markørgen. De 500 pupper opdrættes derefter til voksne og scores efter køn. Alle resterende larver screenes for markøren. For 1:10 bure, er alle larver scoret i generationer 1-12 og 200 larver, der afspejler den eksisterende transgene frekvens bruges til at befolke nye bure. Fra generation 13 er disse bure oprettet identisk med 1:1 og 1:3 bure. Tilpasset fra Pham et al. (2019) 2 og Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig06.jpg"> Figur 6. Forudsagt transgene fiksering dynamik for de forskellige befolkning udskiftning bur forsøg.  Repræsentation af den forventede fænotype dynamik af de bedst præsterende replikerer for hver af de bur forsøg eksperimenter udført af Pham et al. (2019) 2, overvåges over 7 generationer. Eksperimenter, der er oprettet, er beskrevet i protokollerne. Forudsigelserne er baseret på data fra alle 9 eksperimenter på 1:1 release modeller (tredotel replikerer for hver af de tre forskellige bur forsøg protokoller). X-aksen er generationen efter den første introduktion, og Y-aksen er andelen af larver, der viser DsRed-markørfænotypen (DsRed+) over tid. Stiplede linjer repræsenterer lineære tendenslinjer for dataene. Fænotypen DsRed+ skyldes, at der er mindst én kopi af den ændrede allele. Derfor afspejler resultaterne udbredelsen af transgene, fremskyndet i gendrevsystemet og når (nær) fuld introduktion i slutningen af observationen. For variationen mellem replikioner og fuldstændige detaljerede data om forsøgene henvises til Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú R et al. (2020)3 og Adolfi A et al. (2020)4. Billeder tilpasset fra Pham TB et al. (2019) Eksperimentel befolkningsmodifikation af malariavektormygen, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Effektivt gendrevsredningssystem i malariamyggen Anopheles stephensi. 11 , stk. 1: 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 og Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Næste generations gendrev til befolkningsmodifikation af malariavektormygen, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende fil: Opførelsen af 0,005 m3 koloni bur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588%20Supplementalvideo-1.m4v" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Protokollerne rapporteret her illustrerer tre alternative måder at vurdere udførelsen af genetisk manipulerede myg bestemt til vektorkontrol i laboratorie-indeholdte små bur forsøg. Hver protokol er skræddersyet til den specifikke ændring mygstamme bjørne (gendrev eller ikke-gendrev) og de typer af parametre målt.

Små burlaboratorieforsøg med genetisk manipulerede anopheline myg

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Den protokol, der er beskrevet her, er passende til at evaluere transgene myg ydeevne og sammenligninger med vilde type kolleger i et lille laboratorium bur forsøg. De små burforsøg er vigtige for at tilvejebringe empiriske værdier, der vil hjælpe med at udfylde gennemførelsen af nye teknologier til udryddelse af malaria. Burforsøgene kan tilpasses andre eksperimentelle designs og er egnede til at vurdere dynamikken i en trussel om et ønsketransgen.Efter indførelsen transgene individer. Begynd den indledende fase af eksperimentet ved at oprette en tre 0,216 kubikmeter bure i triplikater. Og tilføje 60 anden-instar vilde type larver til hvert bur over tre på hinanden følgende uger.Hver uge giver voksne kvinder i hvert bur bedøvede mus som en blodmelskilde. Og en fårposition beholder tre dage efter blod måltid. Hatch æg fra hvert bur ugentligt.Fra uge fire til otte skal du vælge 60 second-instar L2 larver tilfældigt for at vende tilbage til deres respektive bure. I uge ni tildeles tilfældigt et sæt trelicate bure som kontroller og et sæt for hvert ønsket frigivelsesforhold. Tilføj 60 vilde type pupper med 30 hanner og 30 hunner til kontrol bure ugentligt.Opretholde en en til en forhold i hvert respektive bur ved ugentligt at tilføje 30 transgene mandlige pupper sammen med 60 vilde type pupper. For en en til 0,1 forhold, tilsæt 300 transgene mandlige pupper ugentligt i hvert respektive bur sammen med 60 vilde type pupper. Gentag at tilføje myg pupper i buret, giver blod måltid og rugeæg hver uge.Vælg i alt 300 larver fra hvert bur tilfældigt til screening. Screen larverne under et stereomikroskop med fluorescensfiltre til udtryk af den fluorescerende dominerende markør i larve- og pupalstadier. Score køn af den resulterende pupper.I gendrevseksperimentet skal du anvende en barrierestrategi ved at holde myg i en sikker insekt og følge standarddriftsprocedurer med regelmæssig overvågning. Forbered et bur oprettet med to sæt tredolicere 0,216 kubikmeter bure for hver ønsket transgen til vild type mandlige frigivelsesforhold. For at opnå et mandligt frigivelsesforhold på en til en, tilsæt 120 transgene mænd, 120 vilde mænd og kvinder på puppestadiet til hvert replikeret bur.Giv et blodmåltid ved hjælp af bedøvede mus til fire til syv dage gamle kvinder i hvert bur. Efter udklækning af æg i en larvebakke skal du vælge ca. 240 første instar L1 larver tilfældigt fra hvert bur og opdrætte dem til pupper, før du vender tilbage til deres respektive bure. Vælg og screen larver til øjenmarkør og kønsfænotype som beskrevet før.Saml et bur opsætning af tredolicere 0,005 kubikmeter bure med et lige antal mænd og kvinder for hver specifik frigivelse forholdet mellem transgenics til vilde type mænd. Ved hjælp af et kunstigt fodringsapparat giver blodmåltider til de fire til syv dage gamle kvinder i hvert bur to på hinanden følgende dage. Tre dage efter det andet blodmåltid tilsættes en ovipositionsbeholder og fjern beholderne efter tre dage.Efter at have scoret alle de døde og de levende voksne, der forbliver i buret efter køn, skal du opbevare dem på minus 80 grader Celsius til molekylær analyse. Hatch æg og køre vælge 200 L1 larver og sætte larverne til side for at befolke nye bure til den næste generation. Derefter tilfældigt vælge en anden 500 larver fra hvert bur afsat til screening.Bag de udvalgte 200 larver til pupper og 500 larver til L4 instar fase. Returner puppe fra 200 bakker for at udfylde nyt bur. Screen tilfældigt udvalgte larver for øjenmarkør og kønsfænotype Som før.I den repræsentative analyse, den forventede fænotype dynamik af de bedst præsterende replikker er vist for de forskellige befolkning udskiftning bur forsøg protokoller. Resultaterne viste den lineære stigende andel af larver med DsRed markør fænotype over syv generationer. Den ene til en ikke-drev udgivelse nåede lidt mere end 80% transgene introduktion inden for syv generationer.Gendrevprotokollerne opnåede dette inden for tre til fire generationer. Således validere, at en enkelt frigivelse af et gendrev system kan være mere effektiv til transgene introduktion. I slutningen af observationen havde spredningen af transgene nået næsten fuldstændig introduktion i gendrevsystemer.Vigtige parametre, såsom frigivelse ratio befolkning aldersstruktur, bur størrelse, og andre vil variere afhængigt af formålet med eksperimentet og specifikke mål. Forsøg med at vurdere fitness parametre såsom frugtbarhed og fecundity kan gøres. Yderligere mere empiriske data fra burforsøgene kan bruges til at parameterisere matematiske modeller af befolkningsdynamik.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flowsortering og Exome-sekventering af Reed-Sternberg-cellerne af klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution af mikroorganismer Ved hjælp af en kemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput robotersvejsede Assisted Isolering af temperaturfølsomme Lethal mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En Array-baserede komparativ genomisk hybridisering Platform for effektiv påvisning af kopi antal variationer i hurtig Neutron-induceret Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventrikulær transplantation af konstruerede neuronal prækursorer til in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generation af tumor Organoider fra genetisk manipulerede musemodeller af prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificering af mutationer ved høj opløsning smelter i en TILLING population af ris

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Graduering af Tau subcellulære lokalisering som et redskab til at undersøge ekspression af sygdomsrelaterede gener

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generation af definerede genomiske modifikationer med CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Undersøgelse af den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic LYDDÆMPER af crispr/Cas9 ribonucleoprotein i akutte myeloid leukæmiceller

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...