Name: small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
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हम मच्छर पालन के लिए Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish पॉवेल और Madeline Nottoli के आभारी हैं। वित्त पोषण कैलिफोर्निया इरविन मलेरिया पहल विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया था। AAJ कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड ब्रेन प्रोफेसर है।

<ol>
	<li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).</li><li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory.">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods.">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li><li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing.">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li><li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms.">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li><li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector.">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70 (2019).</li></ol>

लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मच्छर जिनमें रोगज़नक़ अवरुद्ध करने की क्षमता होती है या बाँझपन जीन सहन करते हैं, वेक्टर जनित बीमारियों को नियंत्रित करने के लिए नए उपकरण ों का गठन करते हैं। इन वैकल्पिक दृष्टिकोणों को शामिल करने वाले मापदंडों की बहुलता को देखते हुए, उनके शोध में एक महत्वपूर्ण कदम में प्रयोगशाला-सीमित प्रयोगात्मक मूल्यांकन शामिल हैं जो नियंत्रण उद्देश्यों के लिए सिंथेटिक ट्रांसजीन रिलीज के संभावित परिणामों की तेज और सुरक्षित भविष्यवाणी की अनुमति देते हैं1।
क्योंकि पिंजरे में बंद आबादी में ट्रांसजीन गतिशीलता की निगरानी कई महीनों तक बढ़ सकती है, प्रोटोकॉल के केंद्रीय पहलुओं में से एक प्रतिकृति के बीच प्रयोगात्मक डिजाइन में स्थिरता है (मच्छर पालन, पिंजरे का आकार, आयु-संरचित आबादी, निश्चित रिलीज अनुपात, स्थिर रक्त भोजन स्रोत और न्यूनतम इनवेसिव स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं सहित)।
पुरुष-केवल रिलीज को आदर्श माना जाता है क्योंकि पुरुष मच्छर न तो रोगजनकों को प्रसारित करते हैं और न ही मनुष्यों पर फ़ीड करते हैं, इसलिए वे सुरक्षित रूप से जंगली आबादी में वंशानुगत विशेषताओं को पेश कर सकते हैं। प्रयोगशाला पिंजरे के प्रयोगों में, ट्रांसजेनिक उपभेदों को कम पुरुष संभोग प्रतिस्पर्धा और ट्रांसजीन एकीकरण से जुड़े अन्य फिटनेस भार के साथ पता लगाना संभव है। हालांकि, प्रत्यक्ष और विशिष्ट प्रयोग, जैसे कि बड़े पिंजरों 10 में आयोजित किए गए, पुरुष प्रतिस्पर्धा त्मकता का ठीक से विश्लेषण करने के लिए आयोजित किया जा सकता है, साथ ही साथ अधिक प्राकृतिक मच्छर घनत्व में मादा प्रजनन 2। इसके अलावा, पिंजरे के परीक्षणों से अनुभवजन्य डेटा का उपयोग पिंजरे की आबादी की गतिशीलता के मॉडल को पैरामीटर करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रतिरोधी एलील गठन शामिल है, और प्रस्तावित तकनीक में प्रभावशीलता और संभावित समायोजन पर उपयोगी जानकारी प्रदान करता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से आवश्यकतानुसार अन्य प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, नियमित कीटनाशक बुनियादी ढांचे और स्थितियों के बारे में न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ। इसके अलावा, वाणिज्यिक पिंजरों और माइक्रोस्कोप को छोड़कर, अधिकांश सामग्री सस्ती हैं और परीक्षणों की कम लागत वाली कई प्रतिकृतियों और पुनरावृत्तियों की अनुमति देती हैं। विशेष रूप से, यह कई ट्रांसजेनिक उपभेदों को छोटे पिंजरे के परीक्षणों में पूर्व-स्क्रीनिंग करने की अनुमति देता है ताकि सर्वोत्तम प्रदर्शन करने वाले उम्मीदवारों को चरणबद्ध परीक्षण मार्ग में आगे बढ़ने और उप-इष्टतम प्रदर्शन दिखाने वालों पर परीक्षण को निलंबित करने के लिए प्राथमिकता दी जा सके।
अंत में, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों के उपयोग के बारे में चिंता मच्छर जनित बीमारियों की रोकथाम के लिए आनुवंशिक रणनीतियों के विकास, मूल्यांकन और अनुप्रयोग के लिए ढांचे के विस्तार को प्रेरित करती है5,8,9। यहां परिभाषित प्रोटोकॉल की प्रासंगिकता और निष्पादन इन दिशानिर्देशों के अनुरूप हैं।

आनुवांशिक रूप से इंजीनियर मच्छरों पर आधारित कार्यनीतियों को वेक्टर जनित रोगजनकों के संचरण को नियंत्रित करने के लिए अपनाया जा रहा है जैसे कि मलेरिया का कारण बनता है। इनमें प्रौद्योगिकियां शामिल हैं 1) एनोफिलीज़ मच्छरों (जनसंख्या दमन) की संख्या और घनत्व को कम करने के उद्देश्य से, या 2) का उद्देश्य मानव रोग (जनसंख्या संशोधन, प्रतिस्थापन, या परिवर्तन) के लिए जिम्मेदार परजीवी को संचारित करने के लिए वैक्टर की क्षमता को कम करना है, जिसमें वैक्टर के उपभेदों को प्रभावक जीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जाता है जो रोगज़नक़ संचरण को रोकते हैं। इन आनुवांशिक दृष्टिकोणों को CRISPR / Cas9-आधारित जीन ड्राइव के आगमन से बल मिला है, जिसमें पेलोड लक्षणों के प्रभावी प्रसार के परजीवी-संचारण मच्छरों के साथ-साथ पिंजरे में बंद आबादी में एंटी-परजीवी प्रभावक अणुओं के प्रमाण-की-अवधारणा है।
छोटे प्रयोगशाला पिंजरे के परीक्षण क्षेत्र अनुप्रयोगों की ओर उनके आगे के विकास के लिए एक चरणबद्ध दृष्टिकोण के हिस्से के रूप में ट्रांसजेनिक उपभेदों की विशेषता का मूल्यांकन करने के लिए एक पहला कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं2। विशिष्ट परिणाम विचारों में एक प्रतिस्पर्धी वातावरण में पेश किए गए डीएनए की वंशानुगतता, फेनोटाइप की पेनेट्रेंस और अभिव्यक्ति, और स्थिरता शामिल हैं। प्रासंगिक प्रयोगात्मक डिजाइन सुविधाओं में पिंजरों का आकार, मच्छर घनत्व, प्रतिकृतियों की संख्या, ओवरलैपिंग या गैर-अतिव्यापी पीढ़ियों, आयु-संरचित लक्ष्य आबादी, इंजीनियर उपभेदों के एकल या कई रिलीज, केवल पुरुष-केवल, केवल महिला-या मिश्रित-सेक्स रिलीज, रिलीज अनुपात, रक्त भोजन स्रोत (कृत्रिम या जीवित पशु), और स्क्रीनिंग प्रक्रियाएं शामिल हैं।
हम यहां उन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो कि अनचाहेतुक रिलीज (कोई जीन-ड्राइव सिस्टम नहीं) के लिए एनोफेलिन मच्छरों के उपभेदों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं और जो कैस 9 एंडोन्यूक्लिएज द्वारा मध्यस्थता वाले स्वायत्त जीन-ड्राइव सिस्टम को ले जाते हैं और आरएनए (जीआरएनए) का मार्गदर्शन करते हैं। इन प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग Pham et al में दिखाई देते हैं। (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, और एडॉल्फी एट अल। (2020) ४ ।
Inundative रिलीज परीक्षण एक जंगली आबादी में ट्रांसजेनिक मच्छरों की एक बड़ी संख्या के कई रिलीज के बाद मेंडेलियन विरासत के तहत एक डिजाइन ट्रांसजीन की प्रसार दर का मूल्यांकन करते हैं। एक ड्राइव सिस्टम के लिए ट्रांसजीन के लगाव के बिना, निष्क्रिय रिलीज परीक्षणों से डेटा एक स्थिर आबादी में ब्याज के ट्रांसजीन की फिटनेस और गतिशील के बारे में जानकारी प्रदान करता है।
जब मच्छरों की आबादी में एक स्वायत्त जीन-ड्राइव प्रणाली होती है, तो छोटे पिंजरे के परीक्षणों को ट्रांसजेनिक पुरुषों के एकल परिचय के बाद प्रमुख मार्कर वृद्धि की दर का निर्धारण करके वांछित ट्रांसजीन के प्रसार की गतिशीलता का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। स्वायत्त जीन-ड्राइव तत्व Cas9 न्यूक्लिएज, gRNA और प्रमुख मार्कर को एन्कोडिंग करने वाले जीनों को इस तरह के फैशन में जोड़ते हैं जो बाद की पीढ़ियों में सक्रिय होने के लिए इस तरह से जुड़े होते हैं।
'ओवरलैपिंग' पीढ़ियां एक उम्र-संरचित निरंतर आबादी बनाने के लिए एक ही पिंजरे में कई पीढ़ियों की एक साथ उपस्थिति को संदर्भित करती हैं, जबकि 'गैर-ओवरलैपिंग' प्रत्येक लगातार पिंजरे में बंद आबादी में एकल असतत पीढ़ियों को संदर्भित करता है2। जीन-ड्राइव पिंजरे के प्रयोगों को समाप्त किया जा सकता है एक बार ड्राइव (रूपांतरण) दर की प्रारंभिक गतिशीलता निर्धारित की जा सकती है (निर्माण के आधार पर 8-10 पीढ़ियां), और जब वे मच्छर आबादी के भीतर ट्रांसजीन की अल्पकालिक स्थिरता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, तो वे यह प्रकट नहीं कर सकते हैं कि जब और यदि प्रमुख मार्कर आवृत्तियां पूर्ण परिचय तक पहुंचती हैं या उनके करीब होती हैं (जीन-ड्राइव सिस्टम की कम से कम एक प्रति लिपि ले जाने वाला प्रत्येक मच्छर)।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial feeders</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>SP6W1-3</td>
			<td>Starter pack &#8211; 6 feeders with 3ml reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage, commercial</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1450D</td>
			<td>Collapsible Cage, 24 X 24 X 24&#34; - 0.216 m3 (60 cm3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage tub (popcorn)</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>VP170-0006</td>
			<td>0.005 m3 (170 fl oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with fluorescence light and filters</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue sticks</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>88646598807</td>
			<td>Gluesticks 40 pk,&#160; 0.4X4&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Woodwards Ace</td>
			<td>2382513</td>
			<td>Stanley, 40 watt, GR20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon screen (netting)</td>
			<td>Joann.com</td>
			<td>1102912</td>
			<td>Tulle 108&#34; Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oviposition cups</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>259126</td>
			<td>Beaker PP grad 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor cutting tool</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>487899</td>
			<td>Box cutters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>978561</td>
			<td>Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>908194</td>
			<td>Swingline Commercial Desk Stapler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sleeve (stockinette)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56612-664</td>
			<td>~48 cm (19&#8221;) cut from bolt ~15 cm (6&#8221;) X ~23 m (25y)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>295715</td>
			<td>Pk of 100, 14&#8221; cable ties - 35.6 cm (14 in)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes

आनुवांशिक रूप से संशोधित वैक्टरों का उपयोग करके मच्छर-जनित रोगजनकों के नियंत्रण को पारंपरिक नियंत्रण रणनीतियों के पूरक के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। CRISPR-आधारित होमिंग जीन ड्राइव सिस्टम ने ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियों को वैज्ञानिक समुदाय के भीतर अधिक सुलभ बना दिया है। ट्रांसजेनिक मच्छर के प्रदर्शन का मूल्यांकन और छोटे प्रयोगशाला पिंजरे के परीक्षणों में जंगली-प्रकार के समकक्षों के साथ तुलना रोग की रोकथाम के लिए रणनीतियों को परिष्कृत करने के लिए बाद के क्षेत्र पिंजरे के प्रयोगों और प्रयोगात्मक आकलनों के डिजाइन के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करती है। यहां, हम मलेरिया के एनोफिलिन मच्छर वैक्टर में फैलने वाले ट्रांसजीन का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपयोग किए जाने वाले तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इनमें निष्क्रिय रिलीज (कोई जीन-ड्राइव सिस्टम नहीं), और जीन-ड्राइव ओवरलैपिंग और गैर-ओवरलैपिंग पीढ़ी के परीक्षण शामिल हैं। तीन परीक्षण कई मापदंडों में भिन्न होते हैं और उन्हें वांछित प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, छोटे पिंजरों में कीटीय अध्ययन प्रयोगशाला से खुले क्षेत्र रिलीज के लिए इंजीनियर कीड़ों के प्रगतिशील संक्रमण का हिस्सा हैं। इसलिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल अनुभवजन्य मूल्यों को प्रदान करने के लिए अमूल्य उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो अंततः मलेरिया उन्मूलन के लिए नई प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र कार्यान्वयन में सहायता करेंगे।

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Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल प्रयोगशाला-निहित छोटे पिंजरे के परीक्षणों में वेक्टर नियंत्रण के लिए नियत आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मच्छरों के प्रदर्शन का आकलन करने के तीन वैकल्पिक तरीकों को दर्शाते हैं। प्रत्येक प्रोटोकॉल को विशिष्ट संशोधन मच्छर तनाव भालू (जीन ड्राइव या गैर-जीन ड्राइव) और मापा मापदंडों के प्रकारों के अनुरूप है।

आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एनोफिलीन मच्छरों के छोटे पिंजरे प्रयोगशाला परीक्षण

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

यहां वर्णित प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक मच्छर प्रदर्शन और एक छोटे से प्रयोगशाला पिंजरे के परीक्षणों में जंगली प्रकार के समकक्षों के साथ तुलना का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त हैं। छोटे पिंजरे के परीक्षण अनुभवजन्य मूल्यों को प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जो मलेरिया उन्मूलन के लिए नई प्रौद्योगिकियों के कार्यान्वयन को भरने में सहायता करेंगे। पिंजरे के परीक्षणों को अन्य प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और एक इच्छा ट्रांस-जीन के खतरे की गतिशीलता का आकलन करने के लिए उपयुक्त हैं।परिचय ट्रांसजेनिक व्यक्तियों के बाद. तीन 0.216 घन मीटर पिंजरों को तीन प्रतियों में स्थापित करके प्रयोग के प्रारंभिक चरण को शुरू करें। और लगातार तीन हफ्तों में प्रत्येक पिंजरे में 60 सेकंड-इंस्टार जंगली प्रकार के लार्वा जोड़ना।हर हफ्ते, रक्त भोजन स्रोत के रूप में anesthetized चूहों के साथ प्रत्येक पिंजरे में वयस्क मादाएं प्रदान करें। और रक्त भोजन के तीन दिन बाद एक ओवीपोजिशन कंटेनर। प्रत्येक पिंजरे से साप्ताहिक अंडे हैच करें।सप्ताह चार से आठ तक, अपने संबंधित पिंजरों पर लौटने के लिए यादृच्छिक रूप से 60 सेकंड-इनस्टार एल 2 लार्वा का चयन करें। सप्ताह नौ में, बेतरतीब ढंग से नियंत्रण के रूप में तीन गुना पिंजरों का एक सेट असाइन करें और प्रत्येक वांछित रिलीज अनुपात के लिए एक सेट। नियंत्रण पिंजरों के लिए साप्ताहिक रूप से 30 पुरुषों और 30 मादाओं के साथ 60 जंगली प्रकार के प्यूपे जोड़ें।साप्ताहिक 30 ट्रांसजेनिक पुरुष pupae 60 जंगली प्रकार pupae के साथ जोड़ने के द्वारा प्रत्येक संबंधित पिंजरे में एक से एक अनुपात बनाए रखने. एक से 0.1 अनुपात के लिए, 60 जंगली प्रकार के प्यूपे के साथ प्रत्येक संबंधित पिंजरे में 300 ट्रांसजेनिक पुरुष प्यूपे साप्ताहिक जोड़ें। पिंजरे में मच्छर प्यूपे जोड़ने, रक्त भोजन प्रदान करने और हर हफ्ते अंडे सेने को दोहराएं।स्क्रीनिंग के लिए यादृच्छिक रूप से प्रत्येक पिंजरे से कुल 300 लार्वा का चयन करें। लार्वा और pupal चरणों में फ्लोरोसेंट प्रमुख मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए प्रतिदीप्ति फिल्टर के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा स्क्रीन। परिणामस्वरूप pupae के लिंग स्कोर.जीन ड्राइव प्रयोग में, मच्छरों को एक सुरक्षित कीट में रखकर और नियमित निगरानी के साथ मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करके एक बाधा रणनीति का उपयोग करें। प्रत्येक वांछित ट्रांसजेनिक से जंगली प्रकार के पुरुष रिलीज अनुपात के लिए 0.216 क्यूबिक मीटर पिंजरों के दो सेटों के साथ स्थापित एक पिंजरे को तैयार करें। एक से एक के एक पुरुष रिलीज अनुपात को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक प्रतिकृति पिंजरे में प्यूपा चरण में 120 ट्रांसजेनिक पुरुषों, 120 जंगली प्रकार के पुरुषों और महिलाओं को जोड़ें।प्रत्येक पिंजरे में चार से सात दिन की पुरानी मादाओं को एनेस्थेटिक चूहों का उपयोग करके रक्त भोजन प्रदान करें। लार्वा ट्रे में अंडे सेने के बाद, प्रत्येक पिंजरे से यादृच्छिक रूप से लगभग 240 पहले इंस्टार एल 1 लार्वा का चयन करें और उन्हें अपने संबंधित पिंजरों पर लौटने से पहले प्यूपे में पीछे करें। आंख मार्कर और सेक्स फेनोटाइप के लिए लार्वा का चयन करें और स्क्रीन करें जैसा कि पहले वर्णित है।जंगली प्रकार के पुरुषों के लिए ट्रांसजेनिक्स के प्रत्येक विशिष्ट रिलीज अनुपात के लिए पुरुषों और महिलाओं की समान संख्या के साथ तीन प्रतियों के 0.005 घन मीटर पिंजरों के पिंजरे के सेटअप को इकट्ठा करें। एक कृत्रिम भोजन उपकरण का उपयोग करके, लगातार दो दिनों में प्रत्येक पिंजरे में चार से सात दिन की पुरानी मादाओं को रक्त भोजन प्रदान करें। दूसरे रक्त भोजन के तीन दिन बाद, एक ओवीपोज़िशन कंटेनर जोड़ें और तीन दिनों के बाद कंटेनरों को हटा दें।सेक्स द्वारा पिंजरे में शेष सभी मृतकों और जीवित वयस्कों को स्कोर करने के बाद, उन्हें आणविक विश्लेषण के लिए माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अंडे हैच करें और 200 एल 1 लार्वा का चयन करें और अगली पीढ़ी के लिए नए पिंजरों को पॉप्युलेट करने के लिए लार्वा को अलग करें। फिर बेतरतीब ढंग से स्क्रीनिंग के लिए अलग रखे गए प्रत्येक पिंजरे से एक और 500 लार्वा का चयन करें।चयनित 200 लार्वा को प्यूपा और 500 लार्वा को एल 4 इनस्टार चरण में पीछे करें। नए पिंजरे को पॉप्युलेट करने के लिए 200 ट्रे से प्यूपा वापस करें। स्क्रीन बेतरतीब ढंग से आंख मार्कर और सेक्स फेनोटाइप के लिए लार्वा का चयन पहले की तरह.प्रतिनिधि विश्लेषण में, सबसे अच्छा प्रदर्शन प्रतिकृतियों की अपेक्षित फेनोटाइप गतिशीलता विभिन्न जनसंख्या प्रतिस्थापन पिंजरे परीक्षण प्रोटोकॉल के लिए दिखाया गया है। परिणामों ने सात पीढ़ियों में DsRed मार्कर फेनोटाइप के साथ लार्वा के रैखिक बढ़ते अनुपात को दिखाया। एक से एक गैर-ड्राइव रिलीज सात पीढ़ियों के भीतर 80% ट्रांसजीन परिचय से थोड़ा अधिक तक पहुंच गया।जीन ड्राइव प्रोटोकॉल ने इसे तीन से चार पीढ़ियों के भीतर हासिल किया। इस प्रकार यह सत्यापित करना कि जीन ड्राइव सिस्टम की एक एकल रिलीज ट्रांसजीन परिचय के लिए अधिक कुशल हो सकती है। अवलोकन के अंत में, ट्रांसजीन का प्रसार जीन ड्राइव सिस्टम में लगभग पूर्ण परिचय तक पहुंच गया था।महत्वपूर्ण पैरामीटर, जैसे रिलीज अनुपात जनसंख्या आयु-संरचना, पिंजरे का आकार, और अन्य प्रयोग के उद्देश्य और विशिष्ट उद्देश्यों के आधार पर भिन्न होंगे। प्रजनन क्षमता और प्रजनन जैसे फिटनेस मापदंडों का आकलन करने के लिए प्रयोग किए जा सकते हैं। पिंजरे के परीक्षणों से आगे अधिक अनुभवजन्य डेटा का उपयोग जनसंख्या गतिशीलता के गणितीय मॉडल को पैरामीटर करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा के रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाओं के प्रवाह-छंटनी और एक्जी सेक्शनिंग

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए प्रक्रिया एक Chemostat का प्रयोग

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

उच्च throughput रोबोट-समर्थित में तापमान के प्रति संवेदनशील घातक म्यूटेंट के अलगाव<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

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तेज़ न्यूट्रॉन-प्रेरित मेडिकागो truncatula म्यूटेंट में प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों के कुशल डिटेक्शन के लिए एक सरणी-आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण प्लेटफ़ॉर्म

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

विवो न्यूरोआर्किटेक्चर स्टडीज के लिए इंजीनियर न्यूरोनल प्रवर्तकों का इंट्रावेंट्रिकल ट्रांसप्लांटेशन

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

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Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

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तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं में CRISPR/Cas9 Ribonucleoप्रोटीन द्वारा एक RUNX1 Intronic साइलेंसर की ट्रांसक्रिप्शनल भूमिका की जांच

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...