Name: small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Siamo grati a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell e Madeline Nottoli per l'allevamento delle zanzare. Il finanziamento è stato fornito dalla University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ è donald bren professor presso l'Università della California, Irvine.

Dichiarazione di etica animale Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. I protocolli sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California (Animal Welfare Assurance Numbers A3416.01).
1. Studi di rilascio inundativo su zanzare non gene drive (Figura 1)
<ol><li>Configurazione e manutenzione della gabbia<ol>
<li>Impostare tre serie di gabbie triplicate da 0,216 m3 aggiungendo 60 larve wild-type (WT) second-instar in ogni gabbia per tre settimane consecutive. NOTA: Non è possibile determinare il sesso delle larve di seconda stella con la microscopia ottica, quindi i campioni aggiunti a ciascuna gabbia saranno composti da maschi e femmine.</li>
		<li>Ad ogni settimana, fornire alle femmine adulte in ogni gabbia topi anestetizzati come fonte di farina di sangue (Figura 2A) e un contenitore di ovodeposizione 3 giorni dopo la farina di sangue. NOTA: mentre è possibile utilizzare un apparato di alimentazione artificiale alternativo, fornire topi vivi anestetizzati per le farine di sangue si traduce in migliori prestazioni di alimentazione delle zanzare in questi grandi formati di gabbia (0,216 m3). Ciò richiede un protocollo approvato per l'uso degli animali e l'approvazione pertinente (ad esempio, Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) per l'uso dei topi. NOTA: I singoli topi sono anestetizzati con una miscela di 4 mg / ketamina HCl del topo e 0,4 mg / xilazina del topo. Gli animali vengono iniettati con tra 0,1 - 0,5 ml di questa miscela.</li>
		<li>Schiudere le uova da ogni gabbia settimanalmente e selezionare 60 larve di seconda stella (L2) a caso da restituire alle rispettive gabbie per compensare la mortalità (settimane 4-8). NOTA: le fasi da 1.1.1 a 1.1.3 sono necessarie per stabilire una popolazione stabile e distribuita strutturata per età nelle gabbie, denominata "fase iniziale".</li>
		<li>Alla settimana 9, assegnare le gabbie assemblate nel passaggio 1.1.1 in modo casuale in triplicati per il rilascio del rapporto di rilascio maschile desiderato.<ol>
<li>Designare una serie di gabbie triplicate come controlli per valutare la coerenza durante l'esperimento.</li>
			<li>Designare un set di triplicati per ogni rapporto di rilascio desiderato (ad esempio, 1:1 o 1:0.1 transgenico:WT maschi). NOTA: Questo punto è indicato come "Fase sperimentale".</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Replica e rapporti di rilascio<ol>
<li>Aggiungi 60 pupe WT (30 maschi e 30 femmine) alle gabbie di controllo settimanalmente.</li>
		<li>Per mantenere un rapporto 1:1, aggiungere settimanalmente 30 pupe maschili transgeniche insieme a 60 (30 maschi e 30 femmine) pupe WT in ogni rispettiva gabbia.</li>
		<li>Per mantenere un rapporto 1:0,1, aggiungere settimanalmente 300 pupe maschili transgeniche insieme a 60 (30 maschi e 30 femmine) pupe WT in ogni rispettiva gabbia. NOTA: L'aggiunta continua di zanzare selvatiche alle gabbie mantiene la densità della gabbia, che dovrebbe diminuire settimanalmente a causa della mortalità adulta legata all'età.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Screening dei fenotipi<ol>
<li>Seleziona un totale di 300 larve da ogni gabbia a caso. Con l'uso di uno stereomicroscopio dotato di filtri a fluorescenza, schermare l'espressione del marcatore dominante fluorescente negli stadi larvale e pupale e segnare il sesso degli adulti risultanti (Figura 3). NOTA: Lo screening fenotipico dipenderà dal marcatore dominante incluso nel costrutto transgenico integrato nelle zanzare (ad esempio, Discosoma sp. proteina fluorescente rossa [DsRed], proteina fluorescente ciano [CFP], proteina fluorescente verde [GFP]), e dal promotore che guida la sua espressione (il più usato nella transgenesi delle zanzare è il promotore 3xP3 che guida l'espressione negli occhi e nel cordone nervoso).</li>
		<li>Seguire questo protocollo per tutte le generazioni richieste dai parametri di risultato definiti nel progetto sperimentale. NOTA: Lo studio viene solitamente terminato quando tutte le zanzare hanno almeno una copia del transgene (determinato dalla presenza del marcatore fluorescente dominante) o il rapporto tra zanzare transgeniche e WT in una gabbia è stabilizzato e non fluttua notevolmente dopo poche (3-5) generazioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Prove di generazione sovrapposte di zanzare gene-drive (Figura 4)
NOTA: le zanzare che trasportano sistemi di guida genetica richiedono protocolli scritti e rivisti e devono essere approvate da un Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC) o equivalente, e altri ove richiesto. Il contenimento delle zanzare (livello ACL 2+) deve seguire le procedure raccomandate5,6,7. In particolare, gli esperimenti di gene drive dovrebbero impiegare due rigorose strategie di confinamento. Il primo è di solito barriere fisiche (Barrier Strategy) tra gli organismi e l'ambiente. Ciò richiede di avere un insetto sicuro e procedure operative standard (incluso il monitoraggio) per garantire che le zanzare non possano sfuggire. La seconda strategia di confinamento può essere molecolare, ecologica o riproduttiva5.
<ol><li>Configurazione della gabbia<ol>
<li>Impostare due serie di gabbie triplicate da 0,216 m3 per ogni rapporto di rilascio maschile transgenico:WT desiderato.<ol>
<li>Per ottenere un rapporto di rilascio maschile di 1: 1, aggiungere 120 maschi transgenici, 120 maschi WT e 120 femmine WT allo stadio di pupa a ciascuna gabbia replicata.</li>
			<li>Per ottenere un rapporto di rilascio di 1:10, aggiungere 12 maschi transgenici, 120 maschi WT e 120 femmine WT allo stadio di pupa a ciascuna gabbia replicata. NOTA: è possibile testare diversi rapporti di rilascio (1:1, 1:3, 1:10, ecc.) e il numero di zanzare utilizzate per avviare gli esperimenti varia di conseguenza. Tuttavia, è importante considerare gli effetti dei numeri bassi sulla valutazione statistica dei dati.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenimento e screening della popolazione<ol>
<li>Fornire alle femmine di 4-7 giorni in ogni gabbia un pasto di sangue usando topi anestetizzati (Figura 2A).</li>
		<li>Tre giorni dopo il pasto di sangue, inserire un contenitore di deposizione delle uova in ogni gabbia.</li>
		<li>Schiudere le uova in un vassoio larvale, selezionare ~ 240 prime larve instar (L1) a caso da ogni gabbia, allevarle fino all'età adulta e riportarle alle rispettive gabbie.</li>
		<li>Fornire ulteriori (2-3) pasti di sangue ogni 3-4 giorni per gli adulti appena emersi come descritto nel passaggio 2.2.1. NOTA: Nessun maschio transgenico aggiuntivo viene aggiunto durante nessuna delle generazioni successive.</li>
		<li>Seleziona un totale di 300 larve da ogni gabbia a caso e selezionale per la presenza del fenotipo marcatore dominante negli stadi larvale e pupale usando uno stereomicroscopio a fluorescenza e segna gli adulti emergenti per il sesso (Figura 3). NOTA: Come prima, lo screening fenotipico dipenderà dal marcatore dominante e dal promotore inclusi nel sistema di gene-drive e integrati nelle zanzare transgeniche (ad esempio, DsRed, CFP o GFP). Se le interruzioni omozigoti o eteroalleliche dei geni bersaglio provocano un fenotipo visibile (ad esempio, geni correlati alla pigmentazione oculare), lo screening di questo tratto dipenderà da quale stadio è più facile visualizzare il fenotipo alterato.</li>
		<li>Seguire questo protocollo per tutte le generazioni richieste dai parametri di risultato definiti nel progetto sperimentale. NOTA: Ogni generazione (delimitata dal pasto di sangue) richiede ~ tre settimane. Lo studio di solito termina quando tutte le zanzare sono considerate omozigoti per il costrutto gene-drive o le popolazioni si stabilizzano ad una percentuale massima di zanzare che trasportano almeno una copia del costrutto gene-drive.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Prove di generazione non sovrapposte di zanzare gene-drive (Figura 5).
<ol><li>Configurazione della gabbia<ol>
<li>Impostare popolazioni di gabbie triplicate di 0,005 m3 per ogni specifico rapporto di rilascio di transgenici ai maschi WT da studiare (ad esempio, tre serie di gabbie triplicate ciascuna impostata con rapporti di rilascio 1:1, 1:3, 1:10). Imposta tutte le gabbie con un numero totale uguale di maschi e femmine. NOTA: Il file supplementare è un video che dimostra la costruzione della gabbia della colonia di 0,005 m3 .<ol>
<li>Aggiungi 50 maschi transgenici, 50 maschi WT e 100 femmine WT a ciascuna delle tre gabbie replicate per ottenere un rapporto di rilascio maschile 1: 1.</li>
			<li>Aggiungi 25 maschi transgenici, 75 maschi WT e 100 femmine WT a ciascuna delle tre gabbie replicate per ottenere un rapporto di rilascio maschile 1: 3.</li>
			<li>Aggiungi 9 maschi transgenici, 90 maschi WT e 100 femmine WT a ciascuna delle tre gabbie replicate per ottenere un rapporto di rilascio maschile 1:10. NOTA: Diversi rapporti di rilascio possono essere testati e il numero di zanzare utilizzate per avviare gli esperimenti può variare di conseguenza. Tuttavia, è importante considerare l'impatto del basso numero di zanzare sulle analisi statistiche. Si tratta di singoli rilasci; nessun maschio transgenico aggiuntivo viene aggiunto in nessuna generazione successiva.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenimento e screening della popolazione<ol>
<li>Fornire alle femmine di 4-7 giorni in ogni gabbia pasti di sangue utilizzando un apparato di alimentazione artificiale (Figura 2B) per due giorni consecutivi. NOTA: i pasti di sangue di routine per le femmine sono costituiti da una fonte di sangue disponibile in commercio (ad esempio, sangue di vitello) fornita da un apparato di alimentazione. I topi anestetizzati vivi vengono utilizzati solo per fornire farina di sangue in formati di gabbia più grandi (0,216 m3) per migliorare le prestazioni di alimentazione.</li>
		<li>Aggiungere un contenitore di deposizione ovaiole 3 giorni dopo la seconda farina di sangue. Dopo tre giorni, rimuovere i contenitori di deposizione delle uova. NOTA: In questa fase, 5-10 femmine possono essere selezionate a caso da ogni gabbia e posizionate individualmente in fiale per valutare ulteriori parametri di fitness, come fertilità e fecondità, se necessario.</li>
		<li>Punteggio per sesso tutti gli adulti (vivi e morti) che rimangono nella gabbia e conservarli a -80 ° C per l'analisi molecolare.</li>
		<li>Schiudere le uova e selezionare casualmente 200 larve L1 dalle gabbie con rapporto 1:1 e 1:3 per popolare nuove gabbie per la prossima generazione. NOTA: A causa della bassa frequenza di partenza dell'individuo transgenico nelle gabbie con rapporto 1:10, il campionamento casuale può portare a un'eccessiva perdita di progenie transgenica nella generazione successiva per portare avanti la popolazione.</li>
		<li>Per garantire un campionamento accurato per le gabbie 1:10 e un numero sufficiente di zanzare transgeniche, selezionare tutte le larve per il marcatore dominante e selezionare 200 larve che riflettono la frequenza transgenica osservata per popolare le nuove gabbie. NOTA: Le gabbie 1:10 possono essere mantenute in modo identico alle gabbie 1:1 e 1:3 quando raggiungono una frequenza transgenica di ≥80%.</li>
		<li>Seleziona 500 larve da ogni gabbia a caso per un'analisi approfondita. Screening sotto stereomicroscopio a fluorescenza per i fenotipi marcatori attesi negli stadi larvale e pupale e punteggio del sesso degli adulti (Figura 3). NOTA: Fenotipi "eccezionali" possono essere selezionati per essere ulteriormente incrociati e analizzati molecolarmente per monitorare la formazione di alleli resistenti.</li>
		<li>Questo protocollo può essere seguito per tutte le generazioni richieste dai parametri di risultato definiti nel progetto sperimentale. NOTA: Ogni generazione è delimitata dalla farina di sangue e richiede ~ tre settimane. Lo studio viene solitamente terminato quando tutte le zanzare sono considerate omozigoti per il costrutto gene-drive o le popolazioni si stabilizzano ad una prevalenza massima di zanzare transgeniche. E come prima, lo screening per i fenotipi dipenderà dai marcatori dominanti e dal promotore integrato nelle zanzare transgeniche (ad esempio, DsRed, CFP, GFP) o nei geni bersaglio se presentano un fenotipo visibile (ad esempio, geni legati alla pigmentazione oculare).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).</li><li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory.">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods.">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li><li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing.">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li><li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms.">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li><li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector.">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70 (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

Le zanzare geneticamente modificate che hanno capacità di bloccare gli agenti patogeni o portano geni di sterilità costituiscono nuovi strumenti per controllare le malattie trasmesse da vettori. Data la molteplicità dei parametri che compongono questi approcci alternativi, un passo critico nella loro ricerca consiste in valutazioni sperimentali confinate in laboratorio che consentono una previsione rapida e sicura dei potenziali risultati di un rilascio di transgeni sintetici a fini di controllo1.
Poiché il monitoraggio delle dinamiche transgeniche nelle popolazioni in gabbia può estendersi per diversi mesi, uno degli aspetti centrali dei protocolli è la coerenza nella progettazione sperimentale tra le repliche (tra cui l'allevamento delle zanzare, le dimensioni della gabbia, le popolazioni strutturate per età, i rapporti di rilascio fissi, le fonti stabili di farina di sangue e le procedure di screening minimamente invasive).
I rilasci solo maschili sono considerati ideali perché le zanzare maschio non trasmettono agenti patogeni né si nutrono di esseri umani, quindi possono tranquillamente introdurre caratteristiche ereditabili nelle popolazioni selvatiche. Negli esperimenti in gabbia di laboratorio, è possibile rilevare ceppi transgenici con ridotta competitività dell'accoppiamento maschile e altri carichi di fitness associati all'integrazione transgenica. Tuttavia, esperimenti diretti e specifici, come quelli condotti in gabbie di grandi dimensioni10, possono essere condotti per analizzare correttamente la competitività maschile, così come la fecondità femminile in densità di zanzare più naturali2. Inoltre, i dati empirici delle prove in gabbia possono essere utilizzati per parametrizzare modelli di dinamica della popolazione in gabbia, compresa la formazione di alleli resistenti, e fornire informazioni utili sull'efficacia e sui possibili aggiustamenti nella tecnologia proposta.
I protocolli qui descritti possono essere facilmente adattati ad altri progetti sperimentali come richiesto, con requisiti minimi per quanto riguarda le infrastrutture e le condizioni regolari degli insetti. Inoltre, ad eccezione delle gabbie commerciali e dei microscopi, la maggior parte dei materiali sono economici e consentono repliche multiple e iterazioni a basso costo delle prove. In particolare, ciò consente anche di pre-selezionare più ceppi transgenici in studi su piccole gabbie al fine di dare la priorità ai candidati con le migliori prestazioni da spostare in avanti nel percorso di test graduale e di sospendere i test su quelli che mostrano prestazioni non ottimali.
Infine, la preoccupazione per l'uso di organismi geneticamente modificati motiva l'elaborazione di quadri per lo sviluppo, la valutazione e l'applicazione di strategie genetiche per la prevenzione delle malattie trasmesse dalle zanzare5,8,9. La rilevanza e l'esecuzione dei protocolli qui definiti sono coerenti con queste linee guida.

Si stanno perseguendo strategie basate su zanzare geneticamente modificate per controllare la trasmissione di agenti patogeni trasmessi da vettori come quelli che causano la malaria1. Questi includono tecnologie 1) volte a ridurre il numero e la densità delle zanzare Anopheles (soppressione della popolazione), o 2) volte a compromettere la capacità dei vettori di trasmettere parassiti responsabili di malattie umane (modifica della popolazione, sostituzione o alterazione) in cui ceppi di vettori sono progettati per esprimere geni effettori che impediscono la trasmissione di agenti patogeni. Questi approcci genetici sono stati rafforzati dall'avvento dei gene drive basati su CRISPR / Cas9, con prove di concetto nelle zanzare che trasmettono parassiti di un'efficace diffusione dei tratti del carico utile e delle molecole effettrici antiparassitarie nelle popolazioni in gabbia.
Le piccole prove in gabbia di laboratorio rappresentano un primo passo per valutare le caratteristiche dei ceppi transgenici come parte di un approccio graduale al loro ulteriore sviluppo verso applicazioni sul campo2. Considerazioni specifiche sui risultati includono l'ereditabilità del DNA introdotto in un ambiente competitivo, la penetranza e l'espressività del fenotipo e la stabilità. Le caratteristiche di progettazione sperimentale rilevanti includono le dimensioni delle gabbie, le densità delle zanzare, il numero di repliche, le generazioni sovrapposte o non sovrapposte, le popolazioni target strutturate per età, i rilasci singoli o multipli di ceppi ingegnerizzati, i rilasci solo maschili, solo femminili o misti, i rapporti di rilascio, le fonti di farina di sangue (animali artificiali o vivi) e le procedure di screening.
Descriviamo qui i protocolli utilizzati per valutare i ceppi di zanzare anofeline per le emissioni inondate (nessun sistema di gene-drive) e quelli che trasportano sistemi autonomi di gene-drive mediati da endonucleasi Cas9 e RNA guida (gRNA). Le applicazioni di questi protocolli appaiono in Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, e Adolfi et al. (2020) 4.
Gli studi di rilascio inundativo valutano il tasso di diffusione di un transgene progettato sotto eredità mendeliana a seguito di rilasci multipli di un gran numero di zanzare transgeniche in una popolazione selvatica. Senza l'attaccamento del transgene a un sistema di azionamento, i dati degli studi di rilascio inundativo forniscono informazioni sull'idoneità e la dinamica del transgene di interesse in una popolazione stabilizzata.
Quando le popolazioni di zanzare contengono un sistema autonomo di guida genetica, le piccole prove in gabbia sono progettate per valutare le dinamiche della diffusione del transgene desiderato determinando il tasso di aumento del marcatore dominante a seguito di una singola introduzione di maschi transgenici. Gli elementi autonomi del gene-drive trasportano i geni che codificano per la nucleasi Cas9, il gRNA e il marcatore dominante collegati in modo tale da essere attivi nelle generazioni successive.
Le generazioni "sovrapposte" si riferiscono alla presenza simultanea di più generazioni nella stessa gabbia per creare una popolazione continua strutturata per età, mentre per "non sovrapposte" si intendono singole generazioni discrete in ciascuna popolazione in gabbia consecutiva2. Gli esperimenti di gabbia gene-drive possono essere terminati una volta determinata la dinamica iniziale del tasso di guida (conversione) (8-10 generazioni a seconda del costrutto) e, sebbene forniscano informazioni sulla stabilità a breve termine del transgene all'interno della popolazione di zanzare, potrebbero non rivelare cosa succede quando e se le frequenze dei marcatori dominanti raggiungono o sono vicine alla piena introduzione (ogni zanzara che trasporta almeno una copia del sistema di gene-drive).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial feeders</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>SP6W1-3</td>
			<td>Starter pack &#8211; 6 feeders with 3ml reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage, commercial</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1450D</td>
			<td>Collapsible Cage, 24 X 24 X 24&#34; - 0.216 m3 (60 cm3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage tub (popcorn)</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>VP170-0006</td>
			<td>0.005 m3 (170 fl oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with fluorescence light and filters</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue sticks</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>88646598807</td>
			<td>Gluesticks 40 pk,&#160; 0.4X4&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Woodwards Ace</td>
			<td>2382513</td>
			<td>Stanley, 40 watt, GR20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon screen (netting)</td>
			<td>Joann.com</td>
			<td>1102912</td>
			<td>Tulle 108&#34; Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oviposition cups</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>259126</td>
			<td>Beaker PP grad 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor cutting tool</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>487899</td>
			<td>Box cutters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>978561</td>
			<td>Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>908194</td>
			<td>Swingline Commercial Desk Stapler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sleeve (stockinette)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56612-664</td>
			<td>~48 cm (19&#8221;) cut from bolt ~15 cm (6&#8221;) X ~23 m (25y)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>295715</td>
			<td>Pk of 100, 14&#8221; cable ties - 35.6 cm (14 in)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes

Il controllo dei patogeni trasmessi dalle zanzare utilizzando vettori geneticamente modificati è stato proposto come uno strumento promettente per integrare le strategie di controllo convenzionali. I sistemi di guida genica homing basati su CRISPR hanno reso le tecnologie transgeniche più accessibili all'interno della comunità scientifica. La valutazione delle prestazioni delle zanzare transgeniche e i confronti con le controparti wild-type in piccoli studi in gabbie di laboratorio forniscono dati preziosi per la progettazione di successivi esperimenti in gabbia sul campo e valutazioni sperimentali per perfezionare le strategie per la prevenzione delle malattie. Qui, presentiamo tre diversi protocolli utilizzati in laboratorio per valutare la diffusione transgenica nei vettori di malaria delle zanzare anofeline. Questi includono rilasci inundativi (nessun sistema di gene-drive) e studi di generazione sovrapposti e non sovrapposti di gene-drive. Le tre prove variano in una serie di parametri e possono essere adattate alle impostazioni sperimentali desiderate. Inoltre, gli studi insetticidi in piccole gabbie fanno parte della progressiva transizione degli insetti ingegnerizzati dal laboratorio ai rilasci in campo aperto. Pertanto, i protocolli qui descritti rappresentano strumenti inestimabili per fornire valori empirici che alla fine aiuteranno l'implementazione sul campo di nuove tecnologie per l'eliminazione della malaria.

Le zanzare anofeline transgeniche generate per sopportare modifiche non gene-drive o autonome del gene-drive sono impostate per le prove in gabbia come descritto nella sezione Protocolli. I risultati rappresentativi mostrati qui descrivono la dinamica fenotipica delle repliche più performanti di ciascuno degli esperimenti di prove in gabbia eseguiti da Pham et al. (2019) 2 per le zanzare Anopheles stephensi . I tre studi (1 - 3, rispettivamente: unità non genica inondata, unità genetica sovrapposta e unità genetica non sovrapposta) variavano in diversi parametri, come la dimensione della gabbia (0,216 m3 vs 0,005 m3), se la popolazione target fosse strutturata per età, fonte di farina di sangue (topi o alimentatore artificiale) e rapporti di rilascio. Come mezzo di rappresentazione, la Figura 6 mostra i dati osservati selezionati dallo stesso rapporto di rilascio (1:1) per tutti e tre i protocolli utilizzati, nel corso di sette generazioni.
Il rilascio non drive 1:1 raggiunge >80% di introduzione transgenica entro 6-7 generazioni. Per gli studi in gabbia transgenica gene-drive, i rilasci 1: 1 in entrambi i protocolli non sovrapposti e sovrapposti raggiungono questo livello entro 3-4 generazioni, convalidando così l'aspettativa che un singolo rilascio di un sistema di gene drive possa essere più efficiente dei rilasci inundativi non drive per l'introduzione di transgeni. La traiettoria più veloce può anche essere confermata dalla pendenza delle linee di tendenza. Entrambi i protocolli di gene-drive, nonostante le diverse configurazioni, presentano angoli e tendenze di pendenza simili. Alla fine dell'osservazione, le gabbie non drive raggiungono circa l'80% degli individui portatori del transgene, mentre le gabbie con individui gene-drive raggiungono l'introduzione completa (o quasi completa). I dati completi e i dettagli di elaborazione sui risultati dei singoli esperimenti utilizzando i protocolli descritti qui possono essere trovati nelle figure 1-3 di Pham et al. (2019) 2, Figure 2-3 di Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3 e Figura 3 di Adolfi et al. (2020) 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig01.jpg"> Figura 1. Schema di prova di rilascio inundativo non unità.  Nove gabbie da 0,216 m3 sono allestite con 60 larve di seconda stella (sesso misto) di tipo selvatico aggiunte a ciascuna. A partire dalla settimana 3, alle femmine viene fornita una farina di sangue settimanale e le uova vengono raccolte e schiuse. Fino alla settimana 8, 60 larve vengono selezionate a caso e restituite settimanalmente alle rispettive gabbie per creare una popolazione strutturata per età nelle gabbie (fase iniziale). A partire dalla settimana 9, le nove gabbie sono assegnate in modo casuale in triplice copia in base ai loro rapporti di rilascio maschile transgenico:wild-type (fase sperimentale). Le gabbie A (Controllo) non hanno pupe transgeniche aggiunte. Alle femmine viene fornita una farina di sangue settimanale e le uova vengono raccolte, schiuse e allevate a pupe. 30 pupe di tipo selvatico maschio e 30 femmine vengono aggiunte di nuovo alle loro gabbie. Le gabbie 1:1 hanno aggiunto altre 30 pupe maschili transgeniche. Le gabbie 1:0.1 hanno aggiunto altre 300 pupe maschili transgeniche. 300 larve di ciascuna delle 9 gabbie vengono selezionate in modo casuale e sottoposte a screening per il marcatore fluorescente. Questa procedura è stata ripetuta settimanalmente fino alla fissazione transgenica (rapporto stabilizzato di zanzare transgeniche-wildtype dopo alcune generazioni). Adattato da Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig02.jpg"> Figura 2. Alimentazione del sangue delle popolazioni in gabbia.  (A) I topi anestetizzati o (B) gli alimentatori di sangue Hemotek sono offerti per l'alimentazione del sangue delle zanzare femmine sulle gabbie da 0,216 m3 o dalle piccole gabbie da 0,005 m3 , rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig03.jpg"> Figura 3. Fenotipi di screening per studi su gabbie di gene-drive non-drive, sovrapposizione e gene-drive non sovrapposti.  Immagini fluorescenti di una larva, pupa e adulto di fenotipi transgenici o wild-type. In questo esempio, gli individui di An. stephensi sono stati sottoposti a screening per il marcatore DsRed guidato dal promotore 3xP3 negli occhi (DsRed+ o DsRed-), visibile in tutte e tre le fasi, e gli adulti sono stati sottoposti a screening per il sesso ( ♀ o ♂ ). Si noti la fluorescenza di fondo nelle larve di tipo selvatico associate al bolo alimentare nel midgut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig04.jpg"> Figura 4. Schema di prova della gabbia di guida genica sovrapposta.  Sei gabbie da 0,216 m3 sono disposte in triplice copia in base ai loro rapporti di rilascio gene-drive:wild-type maschile. 120 maschi selvatici e 120 femmine selvatiche sono stati aggiunti a ciascuna gabbia. Le gabbie con un rapporto di rilascio maschile gene-drive 1: 1 hanno avuto un ulteriore 120 maschi transgenici aggiunti. Le gabbie con un rapporto di rilascio maschile di 1:10 hanno avuto altri 12 maschi transgenici aggiunti. Fino alla piena introduzione del transgene, ogni 3 settimane, le femmine adulte vengono fornite di farina di sangue e le uova vengono raccolte e schiuse. Un totale di 240 larve sono state selezionate in modo casuale e restituite alle rispettive gabbie. Trecento (300) larve vengono selezionate in modo casuale e sottoposte a screening per il marcatore dominante. In seguito vengono proiettati come pupe e adulti per il colore degli occhi e il sesso. Nessun maschio transgenico aggiuntivo viene aggiunto alle gabbie originali. Adattato da Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig05.jpg"> Figura 5. Schema di prova in gabbia gene-drive non sovrapposta.  Nove piccole gabbie da 0,005 m3 sono disposte in triplice copia in base ai loro rapporti di rilascio gene-drive:wild-type maschile. Le gabbie con un rapporto di rilascio maschile 1: 1 hanno 100 femmine selvatiche, 50 maschi selvatici e 50 maschi gene-drive aggiunti. Le gabbie con un rapporto di rilascio maschile 1: 3 hanno 100 femmine selvatiche, 75 maschi selvatici e 25 maschi gene-drive aggiunti. Le gabbie 1:10 rapporto di rilascio maschile hanno 100 femmine selvatiche, 90 maschi selvatici e 9 maschi gene-drive aggiunti. Alle femmine viene fornito un pasto di sangue e uova raccolte e schiuse. Per le gabbie 1:1 e 1:3, 200 larve vengono selezionate a caso e utilizzate per popolare nuove gabbie, separate da quelle dei loro genitori, per la generazione successiva. Altre 500 larve vengono selezionate in modo casuale e allevate a pupe, quando vengono sottoposte a screening per il gene marcatore dominante. Le 500 pupe vengono poi allevate agli adulti e valutate per sesso. Tutte le larve rimanenti vengono sottoposte a screening per il marcatore. Per le gabbie 1:10, tutte le larve sono segnate nelle generazioni 1-12 e 200 larve che riflettono la frequenza transgenica esistente vengono utilizzate per popolare nuove gabbie. A partire dalla generazione 13, queste gabbie sono allestite in modo identico alle gabbie 1:1 e 1:3. Adattato da Pham et al. (2019) 2 e Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig06.jpg"> Figura 6. Dinamiche di fissazione transgenica previste per i diversi studi di sostituzione della popolazione in gabbia.  Rappresentazione della dinamica fenotipica attesa delle repliche più performanti per ciascuno degli esperimenti di prove in gabbia eseguiti da Pham et al. (2019) 2, monitorato per oltre 7 generazioni. Le impostazioni degli esperimenti sono descritte nei Protocolli. Le previsioni si basano sui dati di tutti e 9 gli esperimenti sui modelli di rilascio 1:1 (triplicati replicati per ciascuno dei tre diversi protocolli di prova in gabbia). L'asse X è il numero di generazione dopo l'introduzione iniziale e l'asse Y è la proporzione di larve che mostrano il fenotipo marcatore DsRed (DsRed+) nel tempo. Le linee tratteggiate rappresentano linee di tendenza lineari dei dati. Il fenotipo DsRed+ deriva dall'avere almeno una copia dell'allele modificato. Quindi i risultati riflettono la diffusione del transgene, accelerato nel sistema di gene drive, raggiungendo (quasi) la piena introduzione alla fine dell'osservazione. Per la variabilità tra le repliche e i dati dettagliati completi sugli esperimenti, fare riferimento a Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú R et al. (2020)3 e Adolfi A et al. (2020)4. Immagini adattate da Pham TB et al. (2019) Modifica sperimentale della popolazione della zanzara vettore della malaria, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Efficiente sistema di salvataggio gene-drive di modifica della popolazione nella zanzara della malaria Anopheles stephensi. Nat Commun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 e Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Guida genica di nuova generazione per la modifica della popolazione della zanzara vettore della malaria, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. DOI: 10.1073/pnas.2010214117. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare: La costruzione della gabbia della colonia di 0,005 m3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588%20Supplementalvideo-1.m4v" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

I protocolli qui riportati illustrano tre modi alternativi per valutare le prestazioni delle zanzare geneticamente modificate destinate al controllo dei vettori in studi in piccole gabbie contenute in laboratorio. Ogni protocollo è adattato alla modifica specifica che il ceppo di zanzara porta (gene drive o non gene drive) e ai tipi di parametri misurati.

Prove di laboratorio su piccole gabbie di zanzare anofelino geneticamente modificate

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Il protocollo qui descritto è appropriato per valutare le prestazioni delle zanzare transgeniche e i confronti con le controparti selvatiche in una piccola gabbia di laboratorio. Le prove a gabbia piccola sono importanti per fornire valori empirici che aiuteranno a riempire l'implementazione di nuove tecnologie per l'eliminazione della malaria. Le prove in gabbia possono essere adattate ad altri progetti sperimentali e sono adatte a valutare la dinamica di una minaccia di un trans-gene del desiderio.A seguire l'introduzione di individui transgenici. Inizia la fase iniziale dell'esperimento allestendo tre gabbie da 0,216 metri cubi in triplicati. E aggiungendo 60 larve di tipo selvatico second-instar a ciascuna gabbia per tre settimane consecutive.Ogni settimana, fornire femmine adulte in ogni gabbia con topi anestetizzati come fonte di farina di sangue. E un contenitore di deposizione delle uova tre giorni dopo il pasto di sangue. Schiudere le uova da ogni gabbia settimanalmente.Dalla quarta all'ottava settimana, selezionare a caso 60 larve L2 seconde instar per tornare alle rispettive gabbie. Alla nona settimana, assegna in modo casuale un set di gabbie triplicate come controlli e un set per ogni rapporto di rilascio desiderato. Aggiungi 60 pupe selvatiche con 30 maschi e 30 femmine alle gabbie di controllo settimanalmente.Mantenere un rapporto uno a uno in ogni rispettiva gabbia aggiungendo settimanalmente 30 pupe maschili transgeniche insieme a 60 pupe selvatiche. Per un rapporto da uno a 0,1, aggiungere 300 pupe maschili transgeniche alla settimana in ogni rispettiva gabbia insieme a 60 pupe selvatiche. Ripeti aggiungendo pupe di zanzara nella gabbia, fornendo farina di sangue e uova da cova ogni settimana.Seleziona un totale di 300 larve da ogni gabbia a caso per lo screening. Schermare le larve al microscopio stereo con filtri a fluorescenza per l'espressione del marcatore fluorescente dominante a stadi larvali e pupali. Segna il sesso delle pupe risultanti.Nell'esperimento di gene drive, impiegare una strategia di barriera mantenendo le zanzare in un insetto sicuro e seguendo procedure operative standard con monitoraggio regolare. Preparare una gabbia allestita con due set di gabbie triplicate da 0,216 metri cubi per ogni rapporto di rilascio tra maschio transgenico e selvaggio desiderato. Per ottenere un rapporto di rilascio maschile di uno a uno, aggiungere 120 maschi transgenici, 120 maschi e femmine selvatici allo stadio di pupa a ciascuna gabbia replicata.Fornire un pasto di sangue usando topi anestetizzati a femmine di quattro o sette giorni in ogni gabbia. Dopo aver covato le uova in un vassoio larvale, selezionare circa 240 prime larve di instar L1 a caso da ogni gabbia e allevarle in pupe prima di tornare alle rispettive gabbie. Selezionare e selezionare le larve per il marcatore oculare e il fenotipo sessuale come descritto in precedenza.Assemblare una configurazione a gabbia di gabbie triplicate da 0,005 metri cubi con un numero uguale di maschi e femmine per ogni specifico rapporto di rilascio di transgenici a maschi selvatici. Utilizzando un apparato di alimentazione artificiale, fornire pasti di sangue alle femmine di quattro-sette giorni in ogni gabbia per due giorni consecutivi. Tre giorni dopo il secondo pasto di sangue, aggiungere un contenitore di deposizione ovidezione e rimuovere i contenitori dopo tre giorni.Dopo aver valutato tutti i morti e gli adulti vivi rimasti nella gabbia per sesso, conservali a meno 80 gradi Celsius per l'analisi molecolare. Schiudere le uova ed eseguire selezionare 200 larve L1 e mettere da parte le larve per popolare nuove gabbie per la prossima generazione. Quindi seleziona casualmente altre 500 larve da ogni gabbia messa da parte per lo screening.Allevare le 200 larve selezionate a pupa e 500 larve allo stadio L4 instar. Ritorna pupa da 200 vassoi per popolare la nuova gabbia. Schermare le larve selezionate casualmente per il marcatore oculare e il fenotipo sessuale Come prima.Nell'analisi rappresentativa, le dinamiche fenotipiche attese delle repliche più performanti sono mostrate per i diversi protocolli di sperimentazione delle gabbie di sostituzione della popolazione. I risultati hanno mostrato la percentuale lineare crescente di larve con fenotipo marcatore DsRed nell'arco di sette generazioni. Il rilascio uno a uno non-drive ha raggiunto poco più dell'80% di introduzione transgenica entro sette generazioni.I protocolli di gene drive hanno raggiunto questo obiettivo entro tre o quattro generazioni. Convalidando così che un singolo rilascio di un sistema di gene drive può essere più efficiente per l'introduzione di transgenici. Alla fine dell'osservazione, la diffusione del transgene aveva raggiunto un'introduzione quasi completa nei sistemi di gene drive.Parametri importanti, come il rapporto di rilascio della struttura per età della popolazione, le dimensioni della gabbia e altri, varieranno a seconda dello scopo dell'esperimento e degli obiettivi specifici. Si possono fare esperimenti per valutare parametri di fitness come fertilità e fecondità. Ulteriori dati più empirici delle prove in gabbia possono essere utilizzati per parametrizzare modelli matematici di dinamica della popolazione.

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