Name: small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Vi er takknemlige til Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell og Madeline Nottoli for mygghold. Finansieringen ble gitt av University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er professor i Donald Bren ved University of California, Irvine.

Dyreetisk uttalelse Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health. Protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees ved University of California (Animal Welfare Assurance Numbers A3416.01).
1. Inundative frigjøringsforsøk på ikke-gendrevne mygg (figur 1)
<ol><li>Oppsett og vedlikehold av merd<ol>
<li>Sett opp tre sett med triplikat 0,216 m3 bur ved å legge til 60 andre-istar wild-type (WT) larver i hvert bur over tre påfølgende uker. MERK: Det er ikke mulig å bestemme kjønn av andre-instar larver ved lys mikroskopi, så prøvene som legges til hvert bur vil bestå av både menn og kvinner.</li>
		<li>Ved hver uke, gi voksne kvinner i hvert bur med bedøvede mus som blodmelkilde (figur 2A) og en oviposisjonsbeholder 3 dager etter blodmelet. MERK: Selv om et alternativt kunstig fôringsapparat kan brukes, gir levende bedøvede mus til blodmelaler bedre myggfôringsytelse i disse store (0,216 m3) burformatene. Dette krever en godkjent dyrebruksprotokoll og relevant (f.eks. institusjonell dyrepleie- og brukskomité, IACUC) godkjenning for bruk av mus. MERK: Individuelle mus bedøves med en blanding av 4 mg/mus ketamin HCl og 0,4 mg/mus xylazin. Dyr injiseres med mellom 0,1 - 0,5 ml av denne blandingen.</li>
		<li>Hatch egg fra hvert bur ukentlig og velg 60 second-instar (L2) larver tilfeldig for å bli returnert til sine respektive bur for å kompensere dødelighet (uke 4-8). MERK: Trinn 1.1.1 til 1.1.3 er nødvendige for å etablere en stabil og fordelt aldersstrukturert befolkning i merdene - referert til som "Innledende fase".</li>
		<li>I uke 9 tilordner du merder samlet i trinn 1.1.1 tilfeldig i triplikater for utgivelser av ønsket mannlig frigjøringsforhold.<ol>
<li>Angi ett sett med triplikate merder som kontroller for å vurdere konsistens gjennom hele eksperimentet.</li>
			<li>Angi ett sett med triplikater for hvert ønsket frigjøringsforhold (for eksempel 1:1 eller 1:0.1 transgene:WT-menn). MERK: Dette punktet på kalles 'Eksperimentell fase'.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Replikerer og slipper relasjoner<ol>
<li>Tilsett 60 WT pupper (30 menn og 30 kvinner) til kontrollburene ukentlig.</li>
		<li>For å opprettholde et 1: 1-forhold, legg til ukentlig 30 transgene mannlige pupper sammen med 60 (30 mann og 30 kvinner) WT-pupper i hvert respektive bur.</li>
		<li>For å opprettholde et forhold på 1:0.1, legg til ukentlig 300 transgen mannlige pupper sammen med 60 (30 mann og 30 kvinner) WT-pupper i hvert respektive bur. MERK: Fortsatt tilsetning av ville mygg til burene opprettholder burtettheten, som forventes å avta ukentlig på grunn av aldersrelatert voksendødelighet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Screening av fenotyper<ol>
<li>Velg totalt 300 larver fra hvert bur tilfeldig. Ved bruk av et stereomikroskop utstyrt med fluorescensfiltre, skjerm for uttrykk for den fluorescerende dominerende markøren på larval- og puppetrinstadiene og score kjønnet til de resulterende voksne (figur 3). MERK: Fenotypisk screening vil avhenge av den dominerende markøren som er inkludert i transgene konstruksjonen integrert i myggene (for eksempel Discosoma sp. rødt fluorescerende protein [DsRed], cyan fluorescerende protein [CFP], grønt fluorescerende protein [GFP]), og på promotoren som driver sitt uttrykk (den mest brukte i myggtransgenese er 3xP3 promotørkjøringsuttrykket i øynene og nerveledningen).</li>
		<li>Følg denne protokollen i så mange generasjoner som kreves av resultatparameterne som er definert i eksperimentell design. MERK: Studien avsluttes vanligvis når alle mygg har minst en kopi av transgene (bestemt av tilstedeværelsen av den dominerende fluorescerende markøren) eller forholdet mellom transgene-til-WT mygg i et bur stabiliseres og svinger ikke sterkt etter noen få (3-5) generasjoner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Overlappende generasjonsstudier av gendrevne mygg (figur 4)
MERK: Mygg som bærer gendriftssystemer krever skriftlige og gjennomgåtte protokoller og bør godkjennes av en institusjonell biosikkerhetskomité (IBC) eller tilsvarende, og andre der det er nødvendig. Mygg inneslutning (ACL 2 + nivå) bør følge anbefalte prosedyrer5,6,7. Spesielt bør gendriftseksperimentene bruke to strenge innesperringsstrategier. Den første er vanligvis fysiske barrierer (Barrierestrategi) mellom organismer og miljøet. Dette krever å ha en sikker insekt og standard driftsprosedyrer (inkludert overvåking) for å sikre at mygg ikke kan unnslippe. Den andre innesperringsstrategien kan være Molekylær, Økologisk eller Reproduktiv5.
<ol><li>Oppsett av bur<ol>
<li>Sett opp to sett med triplikat 0,216 m3 bur for hvert ønsket transgent: WT mannlig frigjøringsforhold.<ol>
<li>For å oppnå et mannlig frigjøringsforhold på 1: 1, legg til 120 transgene menn, 120 WT menn og 120 WT kvinner på puppetrinnet til hvert replikeringsbur.</li>
			<li>For å oppnå et frigjøringsforhold på 1:10, legg til 12 transgene menn, 120 WT menn og 120 WT kvinner på puppetrinnet for å gjenskape buret. MERK: Ulike frigjøringsforhold kan testes (1:1, 1:3, 1:10, etc.) og antall mygg som brukes til å starte forsøkene varierer tilsvarende. Det er imidlertid viktig å vurdere effekten av lave tall på den statistiske evalueringen av dataene.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Befolkningsvedlikehold og screening<ol>
<li>Gi 4-7 dager gamle kvinner i hvert bur et blodmåltid ved hjelp av bedøvede mus (figur 2A).</li>
		<li>Tre dager etter blodmelet, sett inn en oviposisjonsbeholder i hvert bur.</li>
		<li>Hatch egg i en larvalbrett, velg ~ 240 første instar (L1) larver tilfeldig fra hvert bur, bak dem til voksen alder, og returner dem til sine respektive bur.</li>
		<li>Gi ytterligere (2-3) blodmåltider hver 3-4 dager for de nyoppdagede voksne som beskrevet i trinn 2.2.1. MERK: Ingen flere transgene hanner tilsetts i noen av de påfølgende generasjonene.</li>
		<li>Velg totalt 300 larver fra hvert bur tilfeldig og screen dem for tilstedeværelsen av den dominerende markørfenotypen på larval- og pupalstadiene ved hjelp av et fluorescenssterekroskop og score nye voksne for sex (figur 3). MERK: Som tidligere vil fenotypisk screening avhenge av den dominerende markøren og promotoren som er inkludert i gendriftssystemet og integrert i de transgene myggene (f.eks. DsRed, CFP eller GFP). Hvis homozygote eller heteroallelic forstyrrelser av de målrettede genene resulterer i en synlig fenotype (for eksempel gener relatert til øyepigmentering), vil screening av dette trekket avhenge av hvilket stadium det er enklest å visualisere den endrede fenotypen.</li>
		<li>Følg denne protokollen i så mange generasjoner som kreves av resultatparameterne som er definert i eksperimentell design. MERK: Hver generasjon (avgrenset av blodmelet) tar ~ tre uker. Studien avsluttes vanligvis når alle mygg anses som homozygote for gendriftskonstruksjonen eller populasjonene stabiliserer seg med en maksimal prosentandel mygg som bærer minst en kopi av gendriftskonstruksjonen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ikke-overlappende generasjonsforsøk av gendrevne mygg (figur 5).
<ol><li>Oppsett av bur<ol>
<li>Sett opp triplikat 0,005 m3 merdpopulasjoner for hvert spesifikke frigjøringsforhold mellom transgener og WT-menn som skal undersøkes (for eksempel tre sett med triplikatburer som hver er satt opp med 1:1, 1:3, 1:10 utgivelsesforhold). Sett opp alle bur med et likt totalt antall menn og kvinner. MERK: Den supplerende filen er en video som demonstrerer byggingen av 0,005 m3 koloniburet.<ol>
<li>Tilsett 50 transgene menn, 50 WT-hanner og 100 WT-kvinner til hver av tre replikerer bur for å oppnå et 1: 1 mannlig frigjøringsforhold.</li>
			<li>Tilsett 25 transgene hanner, 75 WT-hanner og 100 WT-kvinner til hver av tre replikerer bur for å oppnå et 1:3 mannlig frigjøringsforhold.</li>
			<li>Tilsett 9 transgene menn, 90 WT-menn og 100 WT-kvinner til hver av tre replikerer bur for å oppnå et 1:10 mannlig frigjøringsforhold. MERK: Ulike frigjøringsforhold kan testes, og antall mygg som brukes til å starte forsøkene kan variere tilsvarende. Det er imidlertid viktig å vurdere effekten av lavt antall mygg på de statistiske analysene. Dette er enkeltutgivelser; Ingen flere transgene menn legges til ved noen etterfølgende generasjon.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Befolkningsvedlikehold og screening<ol>
<li>Gi de 4-7 dagene gamle hunnene i hvert bur blodmåltider ved hjelp av et kunstig fôringsapparat (figur 2B) på to påfølgende dager. MERK: Rutinemessige blodmåltider for kvinner består av en kommersielt tilgjengelig blodkilde (f.eks. kalveblod) fra et fôringsapparat. Levende bedøvede mus brukes bare til å gi blodmel i større (0,216 m3) burformater for bedre fôringsytelse.</li>
		<li>Tilsett en oviposisjonsbeholder 3 dager etter det andre blodmelet. Etter tre dager, fjern oviposisjonsbeholderne. MERK: På dette trinnet kan 5-10 kvinner velges tilfeldig fra hvert bur og plasseres individuelt i hetteglass for å vurdere flere treningsparametere, for eksempel fruktbarhet og fecundity, om nødvendig.</li>
		<li>Skår etter kjønn alle voksne (døde og levende) som er igjen i buret og lagre dem ved -80 °C for molekylær analyse.</li>
		<li>Hatch egg og tilfeldig velge 200 L1 larver fra 1:1 og 1:3 forholdet bur for å fylle nye bur for neste generasjon. MERK: På grunn av den lave frekvensen av å starte transgent individ i 1:10-forholdsmerdene, kan tilfeldig prøvetaking føre til overdreven tap av transgent avkom i neste generasjon for å fortsette befolkningen.</li>
		<li>For å sikre en nøyaktig prøvetaking for 1:10-burene og tilstrekkelig antall transgene mygg, screen alle larver for den dominerende markøren og velg 200 larver som reflekterer den observerte transgene frekvensen for å fylle de nye burene. MERK: 1:10-burene kan opprettholdes identisk med 1:1 og 1:3 bur når de når en transgene frekvens på ≥80%.</li>
		<li>Velg 500 larver fra hvert bur tilfeldig for en grundig analyse. Skjerm under et fluorescenssterekroskop for de forventede markørfenotypene på larval- og puppetrinstadiene og skår sex hos voksne (figur 3). MERK: 'Eksepsjonelle' fenotyper kan velges for å krysses og analyseres molekylært for å overvåke resistent alleleformasjon.</li>
		<li>Denne protokollen kan følges i så mange generasjoner som kreves av resultatparameterne som er definert i eksperimentell design. MERK: Hver generasjon er avgrenset av blodmelet og tar ~ tre uker. Studien avsluttes vanligvis når alle mygg anses som homozygote for gendriftskonstruksjonen eller populasjoner stabiliserer seg ved maksimal utbredelse av transgene mygg. Og som før vil screening for fenotyper avhenge av de dominerende markørene og promotoren integrert i de transgene myggene (for eksempel DsRed, CFP, GFP) eller i de målrettede genene hvis de presenterer en synlig fenotype (for eksempel gener relatert til øyepigmentering).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).</li><li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory.">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods.">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li><li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing.">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li><li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms.">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li><li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector.">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingen avsløringer.

Genetisk konstruerte mygg som har patogenblokkeringsevne eller bjørnsterilitetsgener utgjør nye verktøy for å kontrollere vektorbårne sykdommer. Gitt mangfoldet av parametere som består av disse alternative tilnærmingene, består et kritisk skritt i forskningen deres av laboratoriebegrensede eksperimentelle evalueringer som tillater en rask og sikker prediksjon av de potensielle resultatene av en syntetisk transgenefrigjøring for kontrollformål1.
Fordi overvåkingen av den transgene dynamikken i burpopulasjoner kan strekke seg i flere måneder, er en av de sentrale aspektene ved protokollene konsistensen i eksperimentell design mellom replikering (inkludert myggoppdrett, burstørrelse, aldersstrukturerte populasjoner, faste frigjøringsforhold, stabile blodmelkilder og minimalt invasive screeningprosedyrer).
Mannlige utgivelser anses som ideelle fordi mannlige mygg verken overfører patogener eller spiser på mennesker, derfor kan de trygt introdusere arvelige egenskaper i ville populasjoner. I laboratoriebureksperimenter er det mulig å oppdage transgene stammer med redusert mannlig parring konkurranseevne og andre treningsbelastninger forbundet med transgene integrasjon. Imidlertid kan direkte og spesifikke eksperimenter, som de som utføres i store bur10, utføres for å analysere mannlig konkurranseevne riktig, samt kvinnelig fecundity i mer naturlige myggtettheter2. Videre kan empiriske data fra merdforsøkene brukes til å parameterisere modeller av merdpopulasjonsdynamikk, inkludert resistent alleldannelse, og gi nyttig informasjon om effektivitet og mulige justeringer i den foreslåtte teknologien.
Protokollene beskrevet her kan enkelt tilpasses andre eksperimentelle design etter behov, med minimale krav til vanlig insektinfrastruktur og forhold. I tillegg, bortsett fra de kommersielle merdene og mikroskopene, er de fleste materialene billige og tillater billige flere replikeringer og gjentakelser av forsøkene. Spesielt tillater dette også at flere transgene stammer kan forhåndsscreenes i små burforsøk for å prioritere best presterende kandidater som skal flyttes fremover i faset testvei og å suspendere testing på de som viser sub-optimale forestillinger.
Til slutt motiverer bekymring for bruk av genmodifiserte organismer utarbeidelsen av rammeverk for utvikling, evaluering og anvendelse av genetiske strategier for forebygging av myggbårne sykdommer5,8,9. Relevansen og utførelsen av protokollene som er definert her, er i samsvar med disse retningslinjene.

Strategier basert på genetisk konstruerte mygg forfølges for å kontrollere overføring av vektorbårne patogener som de som forårsaker malaria1. Disse inkluderer teknologier 1) rettet mot å redusere antall og tettheter av Anopheles mygg (befolkningsundertrykking), eller 2) med sikte på å svekke vektorens evne til å overføre parasitter som er ansvarlige for menneskelig sykdom (befolkningsmodifisering, erstatning eller endring) der vektorstammer er konstruert for å uttrykke effektorgener som forhindrer patogenoverføring. Disse genetiske tilnærmingene har blitt styrket av fremkomsten av CRISPR / Cas9-baserte genstasjoner, med konseptbevis i parasittoverførings mygg med effektiv spredning av nyttelastegenskaper samt anti-parasittiske effektormolekyler i burpopulasjoner.
Små laboratoriemerdforsøk representerer et første skritt for å evaluere karakteristikken for transgene stammer som en del av en faset tilnærming til deres videre utvikling mot feltapplikasjoner2. Spesifikke utfallshensyn inkluderer arvelighet av det introduserte DNA i et konkurransedyktig miljø, penetrans og uttrykksevne av fenotypen og stabilitet. Relevante eksperimentelle designfunksjoner inkluderer størrelsen på merdene, myggtetthet, antall replikeringer, overlappende eller ikke-overlappende generasjoner, aldersstrukturerte målpopulasjoner, enkelt- eller flere utgivelser av konstruerte stammer, kun for menn, ren kvinne- eller blandet kjønn-utgivelser, frigjøringsforhold, blodmelkilder (kunstige eller levende dyr) og screeningprosedyrer.
Vi beskriver her protokoller som brukes til å evaluere stammer av anopheline mygg for inundative utgivelser (ingen gen-drive system) og de som bærer autonome gen-drive systemer mediert av Cas9 endonucleases og guide RNAs (gRNA). Anvendelser av disse protokollene vises i Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, og Adolfi et al. (2020) 4.
Inundative utgivelsesforsøk evaluerer spredningshastigheten til en designet transgene under Mendelian arv etter flere utgivelser av et stort antall transgene mygg til en vill befolkning. Uten vedlegg av transgene til et drivsystem, gir data fra inundative utgivelsesforsøk informasjon om kondisjon og dynamikk av transgene av interesse i en stabilisert befolkning.
Når myggpopulasjoner inneholder et autonomt gendriftssystem, er små burforsøk designet for å vurdere dynamikken i spredningen av ønsket transgene ved å bestemme graden av dominerende markørøkning etter en enkelt introduksjon av transgene menn. Autonome gen-drivelementer bærer genene som koder Cas9-kjernen, gRNA og dominerende markør knyttet på en slik måte at de er aktive i etterfølgende generasjoner.
"Overlappende" generasjoner refererer til samtidig tilstedeværelse av flere generasjoner i samme bur for å skape en aldersstrukturert kontinuerlig befolkning, mens "ikke-overlappende" refererer til enkelt diskrete generasjoner i hver påfølgende burpopulasjon2. Gene-drive bur eksperimenter kan avsluttes når den første dynamikken i stasjonen (konvertering) hastigheten kan bestemmes (8-10 generasjoner avhengig av konstruksjonen), og mens de gir informasjon om kortsiktig stabilitet av transgene i myggpopulasjonen, kan de ikke avsløre hva som skjer når og hvis de dominerende markørfrekvensene når eller er nær full introduksjon (hver mygg som bærer minst en kopi av gen-stasjonen systemet).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial feeders</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>SP6W1-3</td>
			<td>Starter pack &#8211; 6 feeders with 3ml reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage, commercial</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1450D</td>
			<td>Collapsible Cage, 24 X 24 X 24&#34; - 0.216 m3 (60 cm3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage tub (popcorn)</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>VP170-0006</td>
			<td>0.005 m3 (170 fl oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with fluorescence light and filters</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue sticks</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>88646598807</td>
			<td>Gluesticks 40 pk,&#160; 0.4X4&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Woodwards Ace</td>
			<td>2382513</td>
			<td>Stanley, 40 watt, GR20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon screen (netting)</td>
			<td>Joann.com</td>
			<td>1102912</td>
			<td>Tulle 108&#34; Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oviposition cups</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>259126</td>
			<td>Beaker PP grad 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor cutting tool</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>487899</td>
			<td>Box cutters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>978561</td>
			<td>Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>908194</td>
			<td>Swingline Commercial Desk Stapler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sleeve (stockinette)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56612-664</td>
			<td>~48 cm (19&#8221;) cut from bolt ~15 cm (6&#8221;) X ~23 m (25y)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>295715</td>
			<td>Pk of 100, 14&#8221; cable ties - 35.6 cm (14 in)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes

Kontroll av myggbårne patogener ved hjelp av genetisk modifiserte vektorer har blitt foreslått som et lovende verktøy for å utfylle konvensjonelle kontrollstrategier. CRISPR-baserte homing gendrivsystemer har gjort transgene teknologier mer tilgjengelige i det vitenskapelige samfunnet. Evaluering av transgen myggytelse og sammenligninger med ville motparter i små laboratorieburforsøk gir verdifulle data for utformingen av påfølgende feltbureksperimenter og eksperimentelle vurderinger for å avgrense strategiene for sykdomsforebygging. Her presenterer vi tre forskjellige protokoller som brukes i laboratoriemiljøer for å evaluere transgene spredning i anopheline myggvektorer av malaria. Disse inkluderer inundative utgivelser (ingen gen-drive system), og gen-drive overlappende og ikke-overlappende generasjonsforsøk. De tre studiene varierer i en rekke parametere og kan tilpasses ønsket eksperimentelle innstillinger. Videre er insektstudier i små bur en del av den progressive overgangen av konstruerte insekter fra laboratoriet til åpne feltutgivelser. Derfor representerer protokollene beskrevet her uvurderlige verktøy for å gi empiriske verdier som til slutt vil hjelpe feltimplementering av ny teknologi for malaria eliminering.

Transgene anopheline mygg generert for å bære ikke-gendrift eller autonome gen-drive modifikasjoner er satt opp for burforsøk som beskrevet i Protokoller-delen. De representative resultatene som vises her skildrer fenotypedynamikken til de best presterende replikeringene av hvert av burforsøksforsøkene utført av Pham et al. (2019) 2 for Anopheles stephensi mygg. De tre studiene (henholdsvis 1 - 3: inundativ ikke-gendrift, overlappende gendrift og ikke-overlappende gendrift) varierte i forskjellige parametere, for eksempel størrelsen på buret (0,216 m3 vs 0,005 m3), om målpopulasjonen var aldersstrukturert, kilde til blodmel (mus eller kunstig mater) og frigjøringsforhold. Som et representasjonsmiddel viser figur 6 de observerte dataene som er valgt fra samme utgivelsesforhold (1:1) for alle tre protokollene som brukes, i løpet av syv generasjoner.
1:1-utgaven uten stasjon når >80 % transgene introduksjon innen 6–7 generasjoner. For gendrevne transgene merdforsøk når 1:1-utgivelsene i både ikke-overlappende og overlappende protokoller dette nivået innen 3-4 generasjoner, og validerer dermed forventningen om at en enkelt utgivelse av et gendriftssystem kan være mer effektiv enn ikke-drive inundative utgivelser for transgene introduksjon. Den raskere banen kan også bekreftes av skråningen av trendlinjene. Begge gen-drive protokollene, til tross for forskjellige oppsett, presenterer lignende vinkler og skråningstrender. På slutten av observasjonen oppnår ikke-drivbur ~ 80% av individer som bærer transgene, mens bur med gendrevne individer når fullstendig (eller nær fullstendig) introduksjon. Fullstendige data og behandlingsdetaljer om individuelle eksperimentresultater ved hjelp av protokollene som er beskrevet her, finner du i figur 1-3 i Pham et al. (2019) 2, Figur 2-3 av Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3 og figur 3 av Adolfi et al. (2020) 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig01.jpg"> Figur 1. Ikke-stasjon inundativ utgivelse prøveskjematisk.  Ni 0,216 m3 bur er satt opp med 60 wild-type second-instar (mixed-sexes) larver lagt til hver. Fra og med uke 3 får kvinner et blodmel ukentlig og egg samles og klekkes. Inntil uke 8 velges 60 larver tilfeldig og returneres til sine respektive bur ukentlig for å skape en aldersstrukturert befolkning i burene (innledende fase). Fra og med uke 9 tildeles de ni merdene tilfeldig i triplikat i henhold til deres transgene: wild-type mannlige frigjøringsforhold (eksperimentell fase). Cages A (Kontroll) har ingen transgen valp lagt til. Hunnene får en blodmel ukentlig og egg samles, klekkes og oppdras til pupper. 30 mannlige og 30 kvinnelige vill-type pupper legges tilbake til burene sine. Cages 1:1 har ytterligere 30 transgene mannlige pupper lagt til. Cages 1:0.1 har ytterligere 300 transgen mannlige pupper lagt til. 300 larver fra hver av de 9 burene velges tilfeldig og screenes for fluorescerende markør. Denne prosedyren ble gjentatt ukentlig til transgene fiksering (stabilisert forhold mellom transgene-wildtype mygg etter noen få generasjoner). Tilpasset fra Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig02.jpg"> Figur 2. Blodfôring av burpopulasjoner.  (A) Bedøvede mus eller (B) Hemotek blodmatere tilbys for blodfôring av kvinnelige mygg på henholdsvis 0,216 m3 bur eller de små 0,005 m3 burene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig03.jpg"> Figur 3. Screening fenotyper for ikke-drivende, overlappende gen-drive og ikke-overlappende gen-drive burforsøk.  Fluorescerende bilder av en larve, pupa og voksen av transgene eller ville fenotyper. I dette eksemplet ble An. stephensi-individer screenet for DsRed-markøren drevet av 3xP3-promotoren i øynene (DsRed + eller DsRed-), synlig i alle tre stadier, og voksne ble screenet for sex ( ♀ eller ♂ ). Legg merke til bakgrunnen fluorescens i ville larver forbundet med matbolus i midgut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig04.jpg"> Figur 4. Overlappende gen-drive bur prøve skjematisk.  Seks 0,216 m3 bur er satt opp i triplikat i henhold til deres gene-drive: wild-type mannlige frigjøringsforhold. 120 ville menn og 120 villtype kvinner ble lagt til hvert bur. Bure med et 1:1 gen-drive mannlig frigjøringsforhold hadde ytterligere 120 transgene menn lagt til. Bure med et 1:10 mannlig frigjøringsforhold hadde ytterligere 12 transgene menn lagt til. Inntil full introduksjon av transgene, hver tredje uke, er voksne kvinner utstyrt med blodmelaler og egg samles og klekkes. Totalt 240 larver ble valgt tilfeldig og returnert til sine respektive bur. Tre hundre (300) larver velges tilfeldig og screenes for den dominerende markøren. De blir senere vist som pupper og voksne for øyenfarge og sex. Ingen flere transgene menn legges til de opprinnelige burene. Tilpasset fra Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig05.jpg"> Figur 5. Ikke-overlappende gen-drive bur prøve skjematisk.  Ni små 0,005 m3 bur er satt opp i triplikat i henhold til deres gene-drive:wild-type mannlige frigjøringsforhold. Bure med et 1:1 mannlig frigjøringsforhold har 100 villtype kvinner, 50 ville menn og 50 gendrevne menn lagt til. Bure med et 1:3 mannlig frigjøringsforhold har 100 villtype kvinner, 75 ville menn og 25 gendrevne menn lagt til. Cages 1:10 mannlige frigjøringsforhold har 100 villtype kvinner, 90 ville menn og 9 gendrevne menn lagt til. Hunnene får et blodmåltid og egg samlet og klekket ut. For 1:1 og 1:3 bur velges 200 larver tilfeldig og brukes til å fylle nye bur, skilt fra foreldrenes, for neste generasjon. Ytterligere 500 larver velges tilfeldig og oppdras til pupper, når de screenes for det dominerende markørgenet. De 500 puppene blir deretter oppdratt til voksne og scoret etter kjønn. Alle gjenværende larver blir screenet for markøren. For 1:10-burene blir alle larver scoret i generasjoner 1-12 og 200 larver som reflekterer den eksisterende transgene frekvensen, brukes til å fylle nye bur. Fra og med generasjon 13 er disse burene satt opp identisk med 1:1 og 1:3 burene. Tilpasset fra Pham et al. (2019) 2 og Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig06.jpg"> Figur 6. Forutsagt transgene fikseringsdynamikk for de forskjellige populasjonserstatningsmerdforsøkene.  Representasjon av den forventede fenotype dynamikken i de best presterende replikerer for hver av burforsøkene eksperimenter utført av Pham et al. (2019) 2, overvåket over 7 generasjoner. Eksperimenter som er satt opp, er beskrevet i protokollene. Spådommene er basert på data fra alle de 9 eksperimentene på 1:1-utgivelsesmodellene (triplikat replikerer for hver av de tre forskjellige burprøveprotokollene). X-aksen er generasjonsnummeret etter første introduksjon, og Y-aksen er andelen larver som viser DsRed-markøren fenotype (DsRed+) over tid. Stiplede linjer representerer lineære trendlinjer for dataene. DsRed+ fenotypen skyldes at den har minst én kopi av det modifiserte allelet. Resultatene gjenspeiler derfor spredningen av transgene, fremskyndet i gendriftssystemet, og når (nær) full introduksjon på slutten av observasjonen. For variasjonen mellom replikeringer og fullstendige detaljerte data om eksperimentene, se Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú R et al. (2020)3 og Adolfi A et al. (2020)4. Bilder tilpasset fra Pham TB et al. (2019) Eksperimentell befolkningsmodifisering av malariavektormyggen, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Effektiv befolkningsmodifisering gen-drive redningssystem i malaria mygg Anopheles stephensi. Nat kommune 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 og Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Neste generasjons gendrift for befolkningsmodifisering av malariavektor mygg, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. Doi: 10.1073/pnas.2010214117. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplemental File: Byggingen av 0,005 m3 koloniburet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588%20Supplementalvideo-1.m4v" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Protokollene som rapporteres her illustrerer tre alternative måter å vurdere ytelsen til genetisk konstruerte mygg som skal til vektorstyring i laboratorieinformive små burforsøk. Hver protokoll er skreddersydd til den spesifikke modifikasjonen myggstammen bærer (gendrift eller ikke-gendrift) og hvilke typer parametere som måles.

Små bur laboratorieforsøk av genetisk konstruerte anopheline mygg

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Protokollen beskrevet her er hensiktsmessig for å evaluere transgen myggytelse og sammenligninger med ville type kolleger i et lite laboratorieburforsøk. Småmerdsforsøkene er viktige for å gi empiriske verdier som vil bidra til å fylle implementeringen av ny teknologi for malaria eliminering. Merdforsøkene kan tilpasses andre eksperimentelle design og er egnet til å vurdere dynamikken i en trussel om et ønsketransgen.Etter introduksjonen transgene individer. Start den første fasen av eksperimentet ved å sette opp tre 0,216 kubikkmeter bur i triplikater. Og legge til 60 andre-istar vill type larver til hvert bur over tre påfølgende uker.Hver uke, gi voksne kvinner i hvert bur med bedøvede mus som blodmelkilde. Og en oviposisjonsbeholder tre dager etter blodmåltidet. Lukk egg fra hvert bur ukentlig.Fra uke fire til åtte velger du tilfeldig 60 andre-istar L2 larver for å gå tilbake til sine respektive bur. I uke ni tilordner du tilfeldig ett sett med triplikate bur som kontroller og ett sett for hvert ønsket utgivelsesforhold. Tilsett 60 wild type pupper med 30 menn og 30 kvinner til kontrollburene ukentlig.Oppretthold et en-til-en-forhold i hvert respektive bur ved å ukentlig legge til 30 transgene mannlige pupper sammen med 60 wild type pupper. For et forhold på en til 0,1, legg til 300 transgene mannlige pupper ukentlig i hvert respektive bur sammen med 60 wild type pupper. Gjenta å legge til myggpupp i buret, gi blodmel og klekkeegg hver uke.Velg totalt 300 larver fra hvert bur tilfeldig for screening. Screen larvene under et stereomikroskop med fluorescensfiltre for uttrykket av den fluorescerende dominerende markøren ved larv- og puppestadier. Score kjønn av den resulterende pupper.I gendriftseksperimentet bruker du en barrierestrategi ved å holde mygg i et sikkert insekt og følge standard driftsprosedyrer med regelmessig overvåking. Forbered et bur satt opp med to sett med triplikat 0,216 kubikkmeter bur for hvert ønsket transgent til vill type mannlig frigjøringsforhold. For å oppnå et mannlig frigjøringsforhold på en til en, legg til 120 transgene menn, 120 vill type menn og kvinner på puppetrinnet til hvert replikeringsbur.Gi et blodmåltid ved hjelp av bedøvede mus til fire til syv dager gamle kvinner i hvert bur. Etter å ha klekket egg i en larvebrett, velg ca 240 første instar L1 larver tilfeldig fra hvert bur og bak dem til pupper før du går tilbake til sine respektive bur. Velg og screen larver for øyemarkør og sex fenotype som beskrevet tidligere.Sett sammen et buroppsett av triplikat 0,005 kubikkmeter bur med like mange menn og kvinner for hvert spesifikke frigjøringsforhold mellom transgener og villtype menn. Bruk et kunstig fôringsapparat, gi blodmåltider til de fire til syv dager gamle kvinnene i hvert bur på to påfølgende dager. Tre dager etter det andre blodmåltidet, legg til en oviposisjonsbeholder og fjern beholderne etter tre dager.Etter å ha scoret alle de døde og de levende voksne som er igjen i buret etter kjønn, lagre dem på minus 80 grader Celsius for molekylær analyse. Hatch egg og kjør utvalgte 200 L1 larver og sett larvene til side for å fylle nye bur for neste generasjon. Velg deretter tilfeldig ytterligere 500 larver fra hvert bur satt til side for screening.Bak de valgte 200 larver til pupa og 500 larver til L4 instar stadium. Returner pupa fra 200 skuffer for å fylle nytt bur. Screen tilfeldig utvalgte larver for øyemarkør og sex fenotype Som før.I den representative analysen vises den forventede fenotypedynamikken til de best presterende replikeringene for de forskjellige protokollene for erstatningsmerd for populasjon. Resultatene viste den lineære økende andelen larver med DsRed markør fenotype over syv generasjoner. Den ene til en ikke-stasjonsutgivelse nådde lite mer enn 80% transgene introduksjon innen syv generasjoner.Gendriftsprotokollene oppnådde dette innen tre til fire generasjoner. Dermed validere at en enkelt utgivelse av et gendriftssystem kan være mer effektivt for transgene introduksjon. På slutten av observasjonen hadde spredningen av transgene nådd nesten fullstendig introduksjon i gendriftssystemer.Viktige parametere, for eksempel frigjøringsforhold befolkningsalderstruktur, merdstørrelse og andre, vil variere avhengig av formålet med eksperimentet og spesifikke mål. Eksperimenter for å vurdere treningsparametere som fruktbarhet og fecundity kan gjøres. Ytterligere mer empiriske data fra merdforsøkene kan brukes til å parameterisere matematiske modeller av populasjonsdynamikk.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-sortering og Exome Sequencing av Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Prosedyre for Adaptive Laboratory Utviklingen av mikroorganismer ved hjelp av en kjemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Høy gjennomstrømming robot pasning Isolering av temperaturfølsomme Lethal Mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En matrise-basert sammenlignende Genomic hybridisering plattform for effektiv påvisning av kopi nummer variasjoner i rask Neutron-indusert Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventricular transplantasjon av konstruerte neuronal forløpere for in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumor Organoids fra genetisk utviklet Mouse modeller av prostatakreft

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifisering av mutasjoner ved høy oppløsning smelting i en TILLING befolkning på Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Modulering av tau Subcellulære lokalisering som et verktøy for å undersøke uttrykk for sykdom-relaterte gener

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generering av definerte genomisk modifikasjoner bruke CRISPR-CAS9 i Human Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Gransking av Transcriptional rolle en RUNX1 Intronic lyddemper av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akutt myelogen leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...