Name: small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Мы благодарны Друзилле Стиллингер, Кионе Паркер, Пэрриш Пауэлл и Мадлен Ноттоли за разведение комаров. Финансирование было предоставлено Инициативой по борьбе с малярией в Ирвине Калифорнийского университета. AAJ является профессором Дональда Брена в Калифорнийском университете в Ирвине.

<ol>
	<li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).</li><li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory.">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods.">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li><li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing.">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li><li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms.">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li><li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector.">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70 (2019).</li></ol>

Авторы не раскрывают информацию.

Генетически модифицированные комары, которые обладают способностью блокировать патогены или несут гены стерильности, представляют собой новые инструменты для борьбы с трансмиссивными болезнями. Учитывая множественность параметров, составляющих эти альтернативные подходы, критическим шагом в их исследованиях являются лабораторные экспериментальные оценки, которые позволяют быстро и безопасно прогнозировать потенциальные результаты высвобождения синтетических трансгенов для целей контроля1.
Поскольку мониторинг динамики трансгенов в популяциях в клетках может длиться в течение нескольких месяцев, одним из центральных аспектов протоколов является согласованность в экспериментальном проектировании между репликами (включая выращивание комаров, размер клетки, возрастные структурированные популяции, фиксированные коэффициенты высвобождения, стабильные источники кровяной муки и минимально инвазивные процедуры скрининга).
Выбросы только для самцов считаются идеальными, потому что самцы комаров не передают патогены и не питаются людьми, поэтому они могут безопасно вводить наследственные характеристики в дикие популяции. В лабораторных клеточных экспериментах можно обнаружить трансгенные штаммы со сниженной соревновательностью самцов при спаривании и другими фитнес-нагрузками, связанными с трансгенной интеграцией. Тем не менее, прямые и конкретные эксперименты, такие как те, которые проводятся в больших клетках10, могут быть проведены для правильного анализа мужской конкурентоспособности, а также женской плодовитости при более естественной плотности комаров2. Кроме того, эмпирические данные испытаний в клетках могут быть использованы для параметризации моделей динамики популяции клеток, включая формирование устойчивых аллелей, и предоставления полезной информации об эффективности и возможных корректировках предлагаемой технологии.
Протоколы, описанные здесь, могут быть легко адаптированы к другим экспериментальным проектам по мере необходимости, с минимальными требованиями в отношении регулярной инсектарной инфраструктуры и условий. Кроме того, за исключением коммерческих клеток и микроскопов, большинство материалов являются недорогими и позволяют недорогие множественные реплики и итерации испытаний. Примечательно, что это также позволяет предварительно проверять несколько трансгенных штаммов в небольших клеточных испытаниях, чтобы определить приоритеты наиболее эффективных кандидатов, которые будут продвигаться вперед по поэтапному пути тестирования, и приостановить тестирование на тех, кто показывает неоптимальные характеристики.
Наконец, озабоченность по поводу использования генетически измененных организмов мотивирует разработку рамок для разработки, оценки и применения генетических стратегий профилактики болезней, переносимых комарами5,8,9. Актуальность и исполнение протоколов, определенных здесь, согласуются с этими руководящими принципами.

Стратегии, основанные на генетически модифицированных комарах, реализуются для борьбы с передачей трансмиссивных патогенов, таких как те, которые вызывают малярию1. К ним относятся технологии 1), направленные на уменьшение численности и плотности комаров Anopheles (подавление популяции), или 2) направленные на снижение способности переносчиков передавать паразитов, ответственных за болезни человека (модификация популяции, замена или изменение), в которых штаммы векторов спроектированы для экспрессии эффекторных генов, предотвращающих передачу патогенов. Эти генетические подходы были подкреплены появлением генных драйвов на основе CRISPR / Cas9, с доказательствами концепции у комаров-паразитов, передающих эффективное распространение признаков полезной нагрузки, а также антипаразитарных эффекторных молекул в популяциях в клетках.
Небольшие лабораторные испытания в клетках представляют собой первый шаг к оценке характеристик трансгенных штаммов в рамках поэтапного подхода к их дальнейшему развитию в полевых условиях2. Конкретные соображения результата включают наследуемость введенной ДНК в конкурентной среде, пенетрантность и экспрессивность фенотипа и стабильность. Соответствующие экспериментальные конструктивные особенности включают размер клеток, плотность комаров, количество реплик, перекрывающиеся или неперекрывающиеся поколения, возрастные целевые популяции, одиночные или множественные выбросы инженерных штаммов, выбросы только для самцов, женщин или смешанных полов, коэффициенты высвобождения, источники кровяной муки (искусственные или живые животные) и процедуры скрининга.
Здесь мы описываем протоколы, используемые для оценки штаммов анофелиновых комаров на предмет затопления (без системы генного драйва) и те, которые несут автономные системы генного драйва, опосредованные эндонуклеазами Cas9 и направляющими РНК (гРНК). Применение этих протоколов приводится в Pham et al. (2019) 2, Карбаллар-Лехарасу и др. (2020) 3, и Адольфи и др. (2020) 4.
Испытания на интопное высвобождение оценивают скорость распространения разработанного трансгена под менделевским наследованием после многократного высвобождения большого количества трансгенных комаров в дикую популяцию. Без прикрепления трансгена к системе привода данные испытаний с индовым высвобождением предоставляют информацию о пригодности и динамике трансгена, представляющего интерес для стабилизированной популяции.
Когда популяции комаров содержат автономную систему генного драйва, небольшие клеточные испытания предназначены для оценки динамики распространения желаемого трансгена путем определения скорости увеличения доминантного маркера после однократного введения трансгенных самцов. Автономные элементы генного драйва несут гены, кодирующие нуклеазу Cas9, гРНК и доминантный маркер, связанные таким образом, чтобы быть активными в последующих поколениях.
«Перекрывающиеся» поколения относятся к одновременному присутствию нескольких поколений в одной клетке для создания возрастной структурированной непрерывной популяции, в то время как «неперекрывающаяся» относится к отдельным дискретным поколениям в каждой последовательной популяции в клетке2. Эксперименты с клеткой генного драйва могут быть прекращены после определения начальной динамики скорости драйва (конверсии) (8-10 поколений в зависимости от конструкции), и, хотя они предоставляют информацию о краткосрочной стабильности трансгена в популяции комаров, они могут не раскрывать, что происходит, когда и если доминирующие частоты маркеров достигают или близки к полному внедрению (каждый комар, несущий по крайней мере одну копию системы генного драйва).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial feeders</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>SP6W1-3</td>
			<td>Starter pack &#8211; 6 feeders with 3ml reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage, commercial</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1450D</td>
			<td>Collapsible Cage, 24 X 24 X 24&#34; - 0.216 m3 (60 cm3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage tub (popcorn)</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>VP170-0006</td>
			<td>0.005 m3 (170 fl oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with fluorescence light and filters</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue sticks</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>88646598807</td>
			<td>Gluesticks 40 pk,&#160; 0.4X4&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Woodwards Ace</td>
			<td>2382513</td>
			<td>Stanley, 40 watt, GR20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon screen (netting)</td>
			<td>Joann.com</td>
			<td>1102912</td>
			<td>Tulle 108&#34; Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oviposition cups</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>259126</td>
			<td>Beaker PP grad 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor cutting tool</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>487899</td>
			<td>Box cutters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>978561</td>
			<td>Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>908194</td>
			<td>Swingline Commercial Desk Stapler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sleeve (stockinette)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56612-664</td>
			<td>~48 cm (19&#8221;) cut from bolt ~15 cm (6&#8221;) X ~23 m (25y)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>295715</td>
			<td>Pk of 100, 14&#8221; cable ties - 35.6 cm (14 in)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes

Борьба с переносимыми комарами патогенами с использованием генетически модифицированных переносчиков была предложена в качестве перспективного инструмента в дополнение к традиционным стратегиям борьбы. Системы самонаведения генов на основе CRISPR сделали трансгенные технологии более доступными в научном сообществе. Оценка эффективности трансгенных комаров и сравнение с аналогами дикого типа в небольших лабораторных испытаниях в клетках дают ценные данные для разработки последующих полевых экспериментов в клетках и экспериментальных оценок для уточнения стратегий профилактики заболеваний. Здесь мы представляем три различных протокола, используемых в лабораторных условиях для оценки распространения трансгенов у анофелиновых комаров-переносчиков малярии. К ним относятся индовые высвобождения (без системы генного драйва) и перекрывающиеся и неперекрывающиеся испытания генерации ген-драйва. Три испытания различаются по ряду параметров и могут быть адаптированы к желаемым экспериментальным условиям. Более того, инсектарные исследования в небольших клетках являются частью прогрессивного перехода инженерных насекомых из лаборатории в открытые полевые выбросы. Таким образом, протоколы, описанные здесь, представляют собой бесценные инструменты для обеспечения эмпирических ценностей, которые в конечном итоге помогут внедрению на местах новых технологий для элиминации малярии.

Трансгенные анофелиновые комары, генерируемые с негенным драйвом или автономными модификациями генного драйва, предназначены для испытаний в клетках, как описано в разделе «Протоколы». Репрезентативные результаты, показанные здесь, отображают динамику фенотипов наиболее эффективных реплик каждого из экспериментов в клетке, выполненных Pham et al. (2019) 2 для комаров Anopheles stephensi . Три испытания (1 - 3, соответственно: индулятивный негенный драйв, перекрывающийся ген-драйв и неперекрывающийся ген-драйв) варьировались по разным параметрам, таким как размер клетки (0,216 м3 против 0,005 м3), была ли целевая популяция структурирована по возрасту, источник кровяной муки (мыши или искусственная кормушка) и коэффициенты высвобождения. В качестве средства представления на рисунке 6 показаны наблюдаемые данные, выбранные из одного и того же коэффициента высвобождения (1:1) для всех трех используемых протоколов в течение семи поколений.
Недисковый выпуск 1:1 достигает >80% введения трансгена в течение 6-7 поколений. Для испытаний трансгенной клетки генного драйва высвобождение 1:1 как в неперекрывающихся, так и в перекрывающихся протоколах достигает этого уровня в течение 3-4 поколений, таким образом, подтверждая ожидание того, что одно высвобождение системы генного драйва может быть более эффективным, чем недисводные индуктивные выбросы для внедрения трансгенов. Более быстрая траектория также может быть подтверждена наклоном линий тренда. Оба протокола генного драйва, несмотря на разные настройки, представляют схожие углы и тенденции наклона. В конце наблюдения неприводные клетки достигают ~ 80% особей, несущих трансген, в то время как клетки с генным драйвом достигают полного (или почти полного) введения. Полные данные и детали обработки отдельных результатов эксперимента с использованием протоколов, описанных здесь, можно найти на рисунках 1-3 Pham et al. (2019) 2, рисунки 2-3 Карбаллара-Лехарасу и др. (2020) 3 и рисунок 3 Адольфи и др. (2020) 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig01.jpg"> Рисунок 1. Схема пробной версии недискового аварийного выпуска.  Девять клеток площадью 0,216 м3 установлены с добавлением к каждой из них 60 личинок второго типа (смешанных полов). Начиная с 3-й недели, самкам еженедельно дают кровожадную муку, а яйца собирают и вылупляют. До 8-й недели 60 личинок выбираются случайным образом и еженедельно возвращаются в свои соответствующие клетки, чтобы создать возрастную популяцию в клетках (начальная фаза). Начиная с 9-й недели, девять клеток случайным образом распределяются в трех экземплярах в соответствии с их трансгенными соотношениями высвобождения самцов дикого типа (экспериментальная фаза). Клетки А (Контроль) не имеют трансгенных куколок. Самкам еженедельно дают кровопускание, а яйца собирают, вылупляют и выращивают до куколок. 30 самцов и 30 самок куколок дикого типа добавляются обратно в свои клетки. Клетки 1:1 имеют дополнительно 30 трансгенных мужских куколок. Клетки 1:0.1 имеют дополнительно 300 трансгенных мужских куколок. 300 личинок из каждой из 9 клеток выбираются случайным образом и проверяются на флуоресцентный маркер. Эту процедуру повторяли еженедельно до фиксации трансгена (стабилизировали соотношение комаров трансгенно-дикого типа через несколько поколений). Адаптировано из Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig02.jpg"> Рисунок 2. Кровоснабжение клеточных популяций.  (A) Обезболенные мыши или (B) Кровососы с кормушками Hemotek предлагаются для кормления кровью самок комаров в клетках площадью 0,216 м3 или небольших клетках площадью 0,005 м3 соответственно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig03.jpg"> Рисунок 3. Скрининг фенотипов для испытаний без драйва, перекрывающегося ген-драйва и неперекрывающейся клетки генного драйва.  Флуоресцентные изображения личинки, куколки и взрослой особи трансгенных или диких фенотипов. В этом примере людей An. stephensi проверяли на наличие маркера DsRed, управляемого промотором 3xP3 в глазах (DsRed+ или DsRed-), видимого на всех трех этапах, а взрослых проверяли на секс ( ♀ или ♂ ). Обратите внимание на фоновую флуоресценцию у личинок дикого типа, связанную с пищевым болюсом в средней кишке. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig04.jpg"> Рисунок 4. Схема испытания перекрывающейся клетки генного драйва.  Шесть клеток размером 0,216 м3 установлены в трех экземплярах в соответствии с их коэффициентами высвобождения самцов диких типов: дикий тип. В каждую клетку было добавлено 120 самцов дикого типа и 120 самок дикого типа. В клетки с соотношением высвобождения самцов генов 1:1 было добавлено дополнительно 120 трансгенных самцов. В клетки с соотношением высвобождения самцов 1:10 было добавлено еще 12 трансгенных самцов. До полного введения трансгена каждые 3 недели взрослым самкам снабжаются кровожадными муками, а яйца собираются и вылупляются. В общей сложности 240 личинок были выбраны случайным образом и возвращены в свои соответствующие клетки. Триста (300) личинок выбираются случайным образом и проверяются на наличие доминирующего маркера. Позже они проверяются как куколки и взрослые особи на цвет глаз и секс. Никакие дополнительные трансгенные самцы не добавляются в оригинальные клетки. Адаптировано из Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig05.jpg"> Рисунок 5. Схема испытания без перекрывающейся клетки генного драйва.  Девять небольших клеток площадью 0,005 м3 установлены в трех экземплярах в соответствии с их коэффициентами генного драйва: высвобождения самцов дикого типа. Клетки с соотношением выпуска самцов 1:1 имеют 100 самок дикого типа, 50 самцов дикого типа и 50 самцов генного драйва. Клетки с соотношением высвобождения самцов 1:3 имеют 100 самок дикого типа, 75 самцов дикого типа и 25 самцов генного драйва. В клетках с соотношением высвобождения самцов 1:10 добавлено 100 самок дикого типа, 90 самцов дикого типа и 9 самцов генного драйва. Самкам обеспечивается кровяная мука, а яйца собираются и вылупляются. Для клеток 1:1 и 1:3 200 личинок выбираются случайным образом и используются для заселения новых клеток, отдельно от клеток их родителей, для следующего поколения. Еще 500 личинок отбираются случайным образом и выращиваются до куколок, когда их проверяют на наличие доминантного маркерного гена. Затем 500 куколок выращиваются во взрослых особях и оцениваются по полу. Все оставшиеся личинки проверяются на маркер. Для клеток 1:10 все личинки забиваются в поколениях 1-12 и 200 личинок, отражающих существующую частоту трансгенов, используются для заселения новых клеток. Начиная с поколения 13, эти клетки установлены идентично клеткам 1:1 и 1:3. Адаптировано из Pham et al. (2019) 2 и Карбаллар-Лехарасу и др. (2020) 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig06.jpg"> Рисунок 6. Предсказана динамика фиксации трансгенов для различных испытаний популяционной замещающей клетки.  Представление ожидаемой динамики фенотипа наиболее эффективных реплик для каждого из экспериментов в клетке, выполненных Pham et al. (2019) 2, контролируется в течение 7 поколений. Поставленные эксперименты описаны в Протоколах. Прогнозы основаны на данных всех 9 экспериментов по моделям выпуска 1:1 (тройные реплики для каждого из трех различных протоколов испытаний в клетке). Ось X — это номер генерации после первоначальной интродукции, а ось Y — это доля личинок, показывающих фенотип маркера DsRed (DsRed+) с течением времени. Пунктирные линии представляют собой линейные линии тренда данных. Фенотип DsRed+ является результатом наличия по крайней мере одной копии модифицированного аллеля. Следовательно, результаты отражают распространение трансгена, ускоренное в системе генного драйва, достигающее (близкого) полного введения в конце наблюдения. Для получения информации о вариативности между репликами и полных подробных данных об экспериментах, пожалуйста, обратитесь к Pham et al. (2019) 2, Карбаллар-Лехарасу Р и др. (2020)3 и Адольфи А и др. (2020)4. Изображения, адаптированные из Pham TB et al. (2019) Экспериментальная популяционная модификация комара-переносчика малярии Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Эффективная система спасения генного драйва модификации популяции у малярийного комара Anopheles stephensi. Nat Commun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 и Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Генный драйв следующего поколения для популяционной модификации комара-переносчика малярии Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci США 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный файл: Строительство колониальной клетки площадью 0,005 м3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588%20Supplementalvideo-1.m4v" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Протоколы, представленные здесь, иллюстрируют три альтернативных способа оценки эффективности генетически модифицированных комаров, предназначенных для борьбы с переносчиками в лабораторных испытаниях в небольших клетках. Каждый протокол адаптирован к конкретной модификации штамма комара (генный драйв или негенный драйв) и типам измеряемых параметров.

Лабораторные испытания генетически модифицированных анофелиновых комаров в малой клетке

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Протокол, описанный здесь, подходит для оценки эффективности трансгенных комаров и сравнения с аналогами дикого типа в небольших лабораторных испытаниях в клетке. Испытания в небольших клетках имеют важное значение для получения эмпирических ценностей, которые помогут внедрить новые технологии элиминации малярии. Испытания в клетке могут быть адаптированы к другим экспериментальным проектам и подходят для оценки динамики угрозы трансгена желания.После интродукции трансгенные особи. Начните начальную фазу эксперимента с установки трех клеток по 0,216 кубических метра в трех экземплярах. И добавление 60 личинок дикого типа в каждую клетку в течение трех последовательных недель.Каждую неделю обеспечьте взрослых самок в каждой клетке обезболенных мышей в качестве источника кровяной муки. И контейнер для яйцекладки через три дня после приема пищи с кровью. Высиживают яйца из каждой клетки еженедельно.С четвертой по восьмую неделю выберите 60 личинок L2 второго звезды случайным образом, чтобы вернуться в свои соответствующие клетки. На девятой неделе случайным образом назначьте один набор тройных клеток в качестве контрольных элементов и один набор для каждого желаемого коэффициента высвобождения. Добавляйте 60 куколок дикого типа с 30 самцами и 30 самками в контрольные клетки еженедельно.Поддерживайте соотношение один к одному в каждой соответствующей клетке, еженедельно добавляя 30 трансгенных самцов куколок вместе с 60 куколками дикого типа. Для соотношения один к 0,1 добавьте 300 трансгенных мужских куколок еженедельно в каждую соответствующую клетку вместе с 60 куколками дикого типа. Повторяйте добавление куколок комаров в клетку, обеспечивая кровавую муку и инкубационные яйца каждую неделю.Выберите в общей сложности 300 личинок из каждой клетки случайным образом для скрининга. Экранирование личинок под стереомикроскопом с флуоресцентными фильтрами для экспрессии флуоресцентного доминантного маркера на личиночной и куколочной стадиях. Оцените пол полученных куколок.В эксперименте по генному драйву используйте барьерную стратегию, удерживая комаров в безопасном инсектарии и следуя стандартным операционным процедурам с регулярным мониторингом. Подготовьте клетку, установленную с двумя наборами тройных клеток по 0,216 кубических метра для каждого желаемого трансгенного и дикого типа мужского высвобождения. Чтобы достичь соотношения высвобождения самцов один к одному, добавьте 120 трансгенных самцов, 120 самцов дикого типа и самок на стадии куколки к каждой реплицированной клетке.Обеспечьте кровавую пищу с помощью анестезированных мышей четырех-семидневным самкам в каждой клетке. После инкубации яиц в личиночном лотке выберите примерно 240 первых личинок L1 случайным образом из каждой клетки и вырастите их до куколок, прежде чем вернуться в соответствующие клетки. Выберите и отсейте личинок на наличие глазного маркера и фенотипа пола, как описано выше.Соберите клеточную установку из тройных клеток объемом 0,005 кубических метра с равным количеством самцов и самок для каждого конкретного соотношения высвобождения трансгенных и диких самцов. Используя аппарат искусственного питания, обеспечьте кровяную пищу четырех-семидневным самкам в каждой клетке в течение двух последовательных дней. Через три дня после второго приема пищи добавьте контейнер для яйцекладки и удалите контейнеры через три дня.После подсчета всех мертвых и живых взрослых особей, оставшихся в клетке по полу, храните их при минус 80 градусах Цельсия для молекулярного анализа. Высиживают яйца и запускают отбор 200 личинок L1 и откладывают личинок в сторону, чтобы заселить новые клетки для следующего поколения. Затем случайным образом выберите еще 500 личинок из каждой клетки, отведенной для скрининга.Вырастите отобранные 200 личинок до куколки и 500 личинок до стадии L4 instar. Верните куколку из 200 лотков для заселения новой клетки. Скрининг случайно выбранных личинок на маркер глаза и фенотип пола Как и раньше.В репрезентативном анализе показана ожидаемая динамика фенотипов наиболее эффективных реплик для различных протоколов испытаний популяционной замещающей клетки. Результаты показали линейное увеличение доли личинок с фенотипом маркера DsRed в течение семи поколений. Выпуск один к одному без привода достиг чуть более 80% внедрения трансгена в течение семи поколений.Протоколы генного драйва достигли этого в течение трех-четырех поколений. Таким образом, подтверждение того, что однократное высвобождение системы генного драйва может быть более эффективным для внедрения трансгенов. В конце наблюдения распространение трансгена достигло почти полного внедрения в системы генного драйва.Важные параметры, такие как коэффициент высвобождения популяции, возрастная структура, размер клетки и другие, будут варьироваться в зависимости от цели эксперимента и конкретных целей. Эксперименты для оценки параметров приспособленности, таких как фертильность и плодовитость, могут быть проведены. Дальнейшие эмпирические данные испытаний в клетке могут быть использованы для параметризации математических моделей динамики популяции.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Поток-сортировка и экзомерная секвенирование клеток Рида-Штернберга классической лимфомы Ходжкина

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Методика адаптивной лабораторной эволюции микроорганизмов с использованием хемостатическую

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Высокопроизводительный роботизированная Изоляция термочувствительных Смертельное Мутанты в<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

На основе массива сравнительной геномной гибридизации платформа для эффективного обнаружения копии номер вариации в быстро нейтрон-индуцированной Люцерна truncatula мутантов

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Внутрижелудочковая трансплантация инженерных нейронных прекурсоров для исследований нейроархитектуры In Vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Поколение опухолевых органоидов из генетически модифицированных моделей мыши рака простаты

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Выявление мутаций путем таяния высокого разрешения в TILLING населения риса

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Модуляция субклеточной локализации Тау как инструмент для исследования экспрессии генов, связанных с болезнями

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...