Name: small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
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Estamos agradecidos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell y Madeline Nottoli por la cría de mosquitos. La financiación fue proporcionada por la Iniciativa de Malaria irvine de la Universidad de California. AAJ es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.

Declaración de ética animal Este estudio se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Los protocolos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California (Números de Garantía de Bienestar Animal A3416.01).
1. Ensayos de liberación de inundaciones en mosquitos no impulsores de genes (Figura 1)
<ol><li>Configuración y mantenimiento de la jaula<ol>
<li>Establezca tres conjuntos de jaulas triplicadas de 0,216 m3 agregando 60 larvas de tipo salvaje (WT) de segundo en cada jaula durante tres semanas sucesivas. NOTA: No es posible determinar el sexo de las larvas de segunda estrella mediante microscopía de luz, por lo que las muestras agregadas a cada jaula consistirán tanto en machos como en hembras.</li>
		<li>Cada semana, proporcione a las hembras adultas en cada jaula ratones anestesiados como fuente de harina de sangre (Figura 2A) y un recipiente de oviposición 3 días después de la harina de sangre. NOTA: Si bien se puede usar un aparato de alimentación artificial alternativo, proporcionar ratones anestesiados vivos para las harinas de sangre da como resultado un mejor rendimiento de alimentación de mosquitos en estos formatos de jaula grande (0.216 m3). Esto requiere un protocolo de uso animal aprobado y la aprobación relevante (por ejemplo, el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, IACUC) para el uso de ratones. NOTA: Los ratones individuales son anestesiados con una mezcla de 4 mg / ketamina de ratón HCl y 0,4 mg / xilazina de ratón. Los animales se inyectan con entre 0,1 y 0,5 ml de esta mezcla.</li>
		<li>Eclosionar huevos de cada jaula semanalmente y seleccionar 60 larvas de segundo instar (L2) al azar para ser devueltas a sus respectivas jaulas para compensar la mortalidad (semanas 4-8). NOTA: Los pasos 1.1.1 a 1.1.3 son necesarios para establecer una población estable y distribuida estructurada por edades en las jaulas, lo que se conoce como "Fase inicial".</li>
		<li>En la semana 9, asigne jaulas ensambladas en el paso 1.1.1 aleatoriamente por triplicado para liberaciones de la proporción de liberación masculina deseada.<ol>
<li>Designe un conjunto de jaulas triplicadas como controles para evaluar la consistencia a lo largo del experimento.</li>
			<li>Designe un conjunto de triplicados para cada relación de liberación deseada (por ejemplo, 1:1 o 1:0.1 transgénicos:WT machos). NOTA: Este punto en se conoce como 'Fase Experimental'.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Replicaciones y ratios de lanzamiento<ol>
<li>Agregue 60 pupas WT (30 machos y 30 hembras) a las jaulas de control semanalmente.</li>
		<li>Para mantener una proporción de 1:1, agregue semanalmente 30 pupas macho transgénicos junto con 60 (30 machos y 30 hembras) pupas WT en cada jaula respectiva.</li>
		<li>Para mantener una proporción de 1:0.1, agregue semanalmente 300 pupas machos transgénicos junto con 60 (30 machos y 30 hembras) pupas WT en cada jaula respectiva. NOTA: La adición continua de mosquitos silvestres a las jaulas mantiene la densidad de la jaula, que se espera que disminuya semanalmente debido a la mortalidad adulta relacionada con la edad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cribado de fenotipos<ol>
<li>Seleccione un total de 300 larvas de cada jaula al azar. Con el uso de un microscopio estereoscópico equipado con filtros de fluorescencia, detectar la expresión del marcador fluorescente dominante en las etapas larval y pupal y puntuar el sexo de los adultos resultantes (Figura 3). NOTA: El cribado fenotípico dependerá del marcador dominante incluido en el constructo transgénico integrado en los mosquitos (por ejemplo, Discosoma sp. proteína fluorescente roja [DsRed], proteína fluorescente cian [CFP], proteína fluorescente verde [GFP]), y del promotor que impulsa su expresión (el más utilizado en la transgénesis de mosquitos es el promotor 3xP3 que impulsa la expresión en los ojos y el cordón nervioso).</li>
		<li>Siga este protocolo durante tantas generaciones como lo requieran los parámetros de resultado definidos en el diseño experimental. NOTA: El ensayo generalmente termina cuando todos los mosquitos tienen al menos una copia del transgén (determinado por la presencia del marcador fluorescente dominante) o la proporción de mosquitos transgénicos a WT en una jaula se estabiliza y no fluctúa mucho después de unas pocas (3-5) generaciones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ensayos de generación superpuesta de mosquitos impulsores de genes (Figura 4)
NOTA: Los mosquitos portadores de sistemas de impulsores genéticos requieren protocolos escritos y revisados y deben ser aprobados por un Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) o equivalente, y otros cuando sea necesario. La contención de mosquitos (nivel de LCA 2+) debe seguir los procedimientos recomendados5,6,7. Específicamente, los experimentos de impulsor genético deberían emplear dos estrategias de confinamiento estrictas. La primera suele ser la barrera física (Estrategia barrera) entre los organismos y el medio ambiente. Esto requiere tener un insectario seguro y procedimientos operativos estándar (incluido el monitoreo) para garantizar que los mosquitos no puedan escapar. La segunda estrategia de confinamiento puede ser Molecular, Ecológica o Reproductiva5.
<ol><li>Configuración de la jaula<ol>
<li>Instale dos juegos de jaulas triplicadas de 0,216 m3 para cada relación de liberación de machos transgénicos:WT deseados.<ol>
<li>Para lograr una relación de liberación masculina de 1:1, agregue 120 machos transgénicos, 120 machos WT y 120 hembras WT en la etapa de pupa a cada jaula replicada.</li>
			<li>Para lograr una relación de liberación de 1:10, agregue 12 machos transgénicos, 120 machos WT y 120 hembras WT en la etapa de pupa a cada jaula replicada. NOTA: Se pueden probar diferentes proporciones de liberación (1: 1, 1: 3, 1: 10, etc.) y el número de mosquitos utilizados para iniciar los experimentos varía en consecuencia. Sin embargo, es importante considerar los efectos de los números bajos en la evaluación estadística de los datos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenimiento y cribado de la población<ol>
<li>Proporcione a las hembras de 4-7 días de edad en cada jaula una comida de sangre utilizando ratones anestesiados (Figura 2A).</li>
		<li>Tres días después de la comida de sangre, inserte un recipiente de oviposición en cada jaula.</li>
		<li>Eclosionar huevos en una bandeja larvaria, seleccionar ~ 240 primeras larvas instar (L1) al azar de cada jaula, criarlas hasta la edad adulta y devolverlas a sus respectivas jaulas.</li>
		<li>Proporcione comidas de sangre adicionales (2-3) cada 3-4 días para los adultos recién surgidos como se describe en el paso 2.2.1. NOTA: No se agregan machos transgénicos adicionales durante ninguna de las generaciones posteriores.</li>
		<li>Seleccionar un total de 300 larvas de cada jaula al azar y examinarlas para detectar la presencia del fenotipo marcador dominante en las etapas larvaria y pupal utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia y puntuar a los adultos emergentes para el sexo (Figura 3). NOTA: Como antes, el cribado fenotípico dependerá del marcador y promotor dominante incluido en el sistema de impulsor genético e integrado en los mosquitos transgénicos (por ejemplo, DsRed, CFP o GFP). Si las alteraciones homocigotas o heteroalélicas de los genes dirigidos dan lugar a un fenotipo visible (por ejemplo, genes relacionados con la pigmentación ocular), el cribado de este rasgo dependerá de en qué etapa sea más fácil visualizar el fenotipo alterado.</li>
		<li>Siga este protocolo durante tantas generaciones como lo requieran los parámetros de resultado definidos en el diseño experimental. NOTA: Cada generación (delimitada por la comida de sangre) toma ~ tres semanas. El ensayo generalmente termina cuando todos los mosquitos se consideran homocigotos para la construcción de impulsor genético o las poblaciones se estabilizan en un porcentaje máximo de mosquitos que portan al menos una copia de la construcción de impulsor genético.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ensayos de generación no superpuesta de mosquitos impulsores de genes (Figura 5).
<ol><li>Configuración de la jaula<ol>
<li>Establecer poblaciones de jaulas triplicadas de 0,005 m3 para cada proporción específica de liberación de transgénicos a machos WT que se investigará (por ejemplo, tres conjuntos de jaulas triplicadas cada uno configurado con proporciones de liberación 1:1, 1:3, 1:10). Establezca todas las jaulas con un número total igual de machos y hembras. NOTA: El Archivo Complementario es un video que demuestra la construcción de la jaula de colonia de 0.005 m3 .<ol>
<li>Agregue 50 machos transgénicos, 50 machos WT y 100 hembras WT a cada una de las tres jaulas replicadas para lograr una proporción de liberación masculina de 1:1.</li>
			<li>Agregue 25 machos transgénicos, 75 machos WT y 100 hembras WT a cada una de las tres jaulas replicadas para lograr una proporción de liberación masculina de 1:3.</li>
			<li>Agregue 9 machos transgénicos, 90 machos WT y 100 hembras WT a cada una de las tres jaulas replicadas para lograr una proporción de liberación masculina de 1:10. NOTA: Se pueden probar diferentes proporciones de liberación y el número de mosquitos utilizados para iniciar los experimentos puede variar en consecuencia. Sin embargo, es importante considerar el impacto del bajo número de mosquitos en los análisis estadísticos. Estos son lanzamientos individuales; no se agregan machos transgénicos adicionales en ninguna generación posterior.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenimiento y cribado de la población<ol>
<li>Proporcione a las hembras de 4-7 días de edad en cada jaula comidas de sangre utilizando un aparato de alimentación artificial (Figura 2B) en dos días consecutivos. NOTA: Las comidas de sangre de rutina para las hembras consisten en una fuente de sangre disponible comercialmente (por ejemplo, sangre de ternero) proporcionada por un aparato de alimentación. Los ratones anestesizados vivos se utilizan solo para proporcionar harinas de sangre en formatos de jaula más grandes (0,216 m3) para un mejor rendimiento de alimentación.</li>
		<li>Agregue un recipiente de oviposición 3 días después de la segunda harina de sangre. Después de tres días, retire los recipientes de oviposición. NOTA: En este paso, se pueden seleccionar de 5 a 10 hembras al azar de cada jaula y colocarlas individualmente en viales para evaluar parámetros de aptitud adicionales, como la fertilidad y la fecundidad, si es necesario.</li>
		<li>Puntúe por sexo a todos los adultos (vivos y muertos) que permanezcan en la jaula y guárdelos a -80°C para su análisis molecular.</li>
		<li>Eclosionar huevos y seleccionar aleatoriamente 200 larvas L1 de las jaulas de proporción 1:1 y 1:3 para poblar nuevas jaulas para la próxima generación. NOTA: Debido a la baja frecuencia de inicio de individuos transgénicos en las jaulas de proporción 1:10, el muestreo aleatorio puede conducir a una pérdida excesiva de la progenie transgénica en la próxima generación para continuar con la población.</li>
		<li>Para garantizar un muestreo preciso para las jaulas 1:10 y un número suficiente de mosquitos transgénicos, examine todas las larvas en busca del marcador dominante y seleccione 200 larvas que reflejen la frecuencia de transgenes observada para poblar las nuevas jaulas. NOTA: Las jaulas 1:10 se pueden mantener de manera idéntica a las jaulas 1:1 y 1:3 cuando alcanzan una frecuencia transgénica de ≥80%.</li>
		<li>Seleccione 500 larvas de cada jaula al azar para un análisis en profundidad. Cribado bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia para los fenotipos marcadores esperados en las etapas larvaria y pupal y puntuación de sexo de adultos (Figura 3). NOTA: Se pueden seleccionar fenotipos "excepcionales" para ser cruzados y analizados molecularmente para monitorear la formación de alelos resistentes.</li>
		<li>Este protocolo se puede seguir durante tantas generaciones como lo requieran los parámetros de resultado definidos en el diseño experimental. NOTA: Cada generación está delimitada por la harina de sangre y toma ~ tres semanas. El ensayo generalmente termina cuando todos los mosquitos se consideran homocigotos para la construcción de impulsores genéticos o las poblaciones se estabilizan en una prevalencia máxima de mosquitos transgénicos. Y como antes, el cribado de fenotipos dependerá de los marcadores dominantes y promotor integrados en los mosquitos transgénicos (por ejemplo, DsRed, CFP, GFP) o en los genes diana si presentan un fenotipo visible (por ejemplo, genes relacionados con la pigmentación ocular).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).</li><li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory.">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods.">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li><li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing.">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li><li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms.">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li><li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector.">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70 (2019).</li></ol>

Los autores no tienen revelaciones.

Los mosquitos genéticamente modificados que tienen capacidad de bloqueo de patógenos o tienen genes de esterilidad constituyen nuevas herramientas para controlar las enfermedades transmitidas por vectores. Dada la multiplicidad de parámetros que comprenden estos enfoques alternativos, un paso crítico en su investigación consiste en evaluaciones experimentales confinadas en laboratorio que permiten una predicción rápida y segura de los resultados potenciales de una liberación de transgenes sintéticos con fines de control1.
Debido a que el monitoreo de la dinámica de los transgenes en las poblaciones enjauladas puede extenderse durante varios meses, uno de los aspectos centrales de los protocolos es la consistencia en el diseño experimental entre las réplicas (incluida la cría de mosquitos, el tamaño de la jaula, las poblaciones estructuradas por edad, las proporciones de liberación fijas, las fuentes estables de harina de sangre y los procedimientos de detección mínimamente invasivos).
Las liberaciones solo para machos se consideran ideales porque los mosquitos machos no transmiten patógenos ni se alimentan de humanos, por lo tanto, pueden introducir de manera segura características hereditarias en las poblaciones silvestres. En experimentos de jaulas de laboratorio, es posible detectar cepas transgénicas con una competitividad de apareamiento masculina reducida y otras cargas de aptitud asociadas con la integración de transgenes. Sin embargo, se pueden realizar experimentos directos y específicos, como los realizados en jaulas grandes10, para analizar adecuadamente la competitividad masculina, así como la fecundidad femenina en densidades de mosquitos más naturales2. Además, los datos empíricos de los ensayos en jaulas se pueden utilizar para parametrizar modelos de la dinámica de la población de jaulas, incluida la formación de alelos resistentes, y proporcionar información útil sobre la efectividad y los posibles ajustes en la tecnología propuesta.
Los protocolos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente a otros diseños experimentales según sea necesario, con requisitos mínimos con respecto a la infraestructura y las condiciones insectarias regulares. Además, a excepción de las jaulas comerciales y los microscopios, la mayoría de los materiales son baratos y permiten múltiples réplicas e iteraciones de bajo costo de los ensayos. En particular, esto también permite que múltiples cepas transgénicas sean preseleccionadas en ensayos de jaulas pequeñas para priorizar que los candidatos de mejor rendimiento avancen en la vía de prueba por fases y suspender las pruebas en aquellos que muestran rendimientos subóptimos.
Finalmente, la preocupación por el uso de organismos genéticamente modificados motiva la elaboración de marcos para el desarrollo, evaluación y aplicación de estrategias genéticas para la prevención de enfermedades transmitidas por mosquitos5,8,9. La pertinencia y ejecución de los protocolos definidos aquí son coherentes con estas directrices.

Se están aplicando estrategias basadas en mosquitos modificados genéticamente para controlar la transmisión de patógenos transmitidos por vectores, como los que causan la malaria1. Estas incluyen tecnologías 1) destinadas a disminuir el número y las densidades de mosquitos Anopheles (supresión de la población), o 2) destinadas a afectar la capacidad de los vectores para transmitir parásitos responsables de enfermedades humanas (modificación, reemplazo o alteración de la población) en las que las cepas de vectores están diseñadas para expresar genes efectores que previenen la transmisión de patógenos. Estos enfoques genéticos se han visto reforzados por el advenimiento de los impulsores genéticos basados en CRISPR / Cas9, con pruebas de concepto en mosquitos transmisores de parásitos de propagación efectiva de rasgos de carga útil, así como moléculas efectoras antiparasitarias en poblaciones enjauladas.
Los ensayos en jaulas de laboratorio pequeñas representan un primer paso para evaluar las características de las cepas transgénicas como parte de un enfoque gradual para su desarrollo posterior hacia aplicaciones de campo2. Las consideraciones específicas de los resultados incluyen la heredabilidad del ADN introducido en un entorno competitivo, la penetrancia y la expresividad del fenotipo y la estabilidad. Las características de diseño experimental relevantes incluyen el tamaño de las jaulas, las densidades de mosquitos, el número de réplicas, las generaciones superpuestas o no superpuestas, las poblaciones objetivo estructuradas por edad, las liberaciones únicas o múltiples de cepas modificadas, las liberaciones solo para machos, solo para mujeres o de sexo mixto, las proporciones de liberación, las fuentes de harina de sangre (animales artificiales o vivos) y los procedimientos de detección.
Describimos aquí los protocolos utilizados para evaluar cepas de mosquitos anofelinos para liberaciones por inundación (sin sistema de impulsor genético) y aquellos que portan sistemas autónomos de impulsores genéticos mediados por endonucleasas Cas9 y ARN guía (ARNg). Las aplicaciones de estos protocolos aparecen en Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, y Adolfi et al. (2020) 4.
Los ensayos de liberación por inundación evalúan la tasa de propagación de un transgén diseñado bajo herencia mendeliana después de múltiples liberaciones de un gran número de mosquitos transgénicos en una población silvestre. Sin la unión del transgén a un sistema de accionamiento, los datos de los ensayos de liberación por inundación proporcionan información sobre la aptitud y la dinámica del transgén de interés en una población estabilizada.
Cuando las poblaciones de mosquitos contienen un sistema autónomo de impulsores genéticos, los ensayos en jaulas pequeñas están diseñados para evaluar la dinámica de la propagación del transgén deseado mediante la determinación de la tasa de aumento del marcador dominante después de una sola introducción de machos transgénicos. Los elementos impulsores genéticos autónomos llevan los genes que codifican la nucleasa Cas9, el ARNg y el marcador dominante vinculados de tal manera que están activos en las generaciones posteriores.
Las generaciones "superpuestas" se refieren a la presencia simultánea de múltiples generaciones en la misma jaula para crear una población continua estructurada por edades, mientras que las "no superpuestas" se refieren a generaciones discretas individuales en cada población enjaulada consecutiva2. Los experimentos de jaulas de accionamiento genético se pueden terminar una vez que se puede determinar la dinámica inicial de la tasa de accionamiento (conversión) (8-10 generaciones dependiendo de la construcción), y aunque proporcionan información sobre la estabilidad a corto plazo del transgén dentro de la población de mosquitos, es posible que no revelen qué sucede cuando y si las frecuencias de los marcadores dominantes alcanzan o están cerca de la introducción completa (cada mosquito que lleva al menos una copia del sistema de impulsor genético).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial feeders</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>SP6W1-3</td>
			<td>Starter pack &#8211; 6 feeders with 3ml reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage, commercial</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1450D</td>
			<td>Collapsible Cage, 24 X 24 X 24&#34; - 0.216 m3 (60 cm3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage tub (popcorn)</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>VP170-0006</td>
			<td>0.005 m3 (170 fl oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with fluorescence light and filters</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue sticks</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>88646598807</td>
			<td>Gluesticks 40 pk,&#160; 0.4X4&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Woodwards Ace</td>
			<td>2382513</td>
			<td>Stanley, 40 watt, GR20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon screen (netting)</td>
			<td>Joann.com</td>
			<td>1102912</td>
			<td>Tulle 108&#34; Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oviposition cups</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>259126</td>
			<td>Beaker PP grad 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor cutting tool</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>487899</td>
			<td>Box cutters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>978561</td>
			<td>Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>908194</td>
			<td>Swingline Commercial Desk Stapler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sleeve (stockinette)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56612-664</td>
			<td>~48 cm (19&#8221;) cut from bolt ~15 cm (6&#8221;) X ~23 m (25y)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>295715</td>
			<td>Pk of 100, 14&#8221; cable ties - 35.6 cm (14 in)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes

El control de patógenos transmitidos por mosquitos utilizando vectores modificados genéticamente se ha propuesto como una herramienta prometedora para complementar las estrategias de control convencionales. Los sistemas de impulsores genéticos basados en CRISPR han hecho que las tecnologías transgénicas sean más accesibles dentro de la comunidad científica. La evaluación del rendimiento de los mosquitos transgénicos y las comparaciones con contrapartes de tipo silvestre en pequeños ensayos de jaulas de laboratorio proporcionan datos valiosos para el diseño de experimentos posteriores de jaulas de campo y evaluaciones experimentales para refinar las estrategias de prevención de enfermedades. Aquí, presentamos tres protocolos diferentes utilizados en entornos de laboratorio para evaluar la propagación de transgenes en mosquitos anofelinos vectores de malaria. Estos incluyen liberaciones inundativas (sin sistema de impulsor genético) y ensayos de generación superpuestos y no superpuestos por impulsores genéticos. Los tres ensayos varían en una serie de parámetros y se pueden adaptar a los entornos experimentales deseados. Además, los estudios insectarios en jaulas pequeñas son parte de la transición progresiva de los insectos modificados del laboratorio a las liberaciones de campo abierto. Por lo tanto, los protocolos descritos aquí representan herramientas invaluables para proporcionar valores empíricos que, en última instancia, ayudarán a la implementación de nuevas tecnologías para la eliminación de la malaria.

Los mosquitos anofelinos transgénicos generados para soportar modificaciones no genéticas o de impulsor genético autónomo se establecen para ensayos en jaulas como se describe en la sección Protocolos. Los resultados representativos que se muestran aquí representan la dinámica del fenotipo de las réplicas de mejor rendimiento de cada uno de los experimentos de ensayos en jaulas realizados por Pham et al. (2019) 2 para mosquitos Anopheles stephensi . Los tres ensayos (1 a 3, respectivamente: impulsor no genético inundativo, impulsor genético superpuesto y impulsor genético no superpuesto) variaron en diferentes parámetros, como el tamaño de la jaula (0,216 m3 frente a 0,005 m3), si la población objetivo estaba estructurada por edad, la fuente de harina de sangre (ratones o comedero artificial) y las proporciones de liberación. Como medio de representación, la Figura 6 muestra los datos observados seleccionados de la misma relación de liberación (1:1) para los tres protocolos utilizados, en el transcurso de siete generaciones.
La liberación sin unidad 1:1 alcanza >80% de introducción de transgenes en 6-7 generaciones. Para los ensayos de jaulas transgénicas impulsadas por genes, las liberaciones 1: 1 en los protocolos no superpuestos y superpuestos alcanzan este nivel dentro de 3-4 generaciones, lo que valida la expectativa de que una sola liberación de un sistema de impulsor genético puede ser más eficiente que las liberaciones inundativas sin impulso para la introducción de transgenes. La trayectoria más rápida también puede ser confirmada por la pendiente de las líneas de tendencia. Ambos protocolos de impulsor genético, a pesar de las diferentes configuraciones, presentan ángulos y tendencias de pendiente similares. Al final de la observación, las jaulas sin accionamiento alcanzan ~ 80% de los individuos que portan el transgén, mientras que las jaulas con individuos impulsores de genes alcanzan la introducción completa (o casi completa). Los datos completos y los detalles de procesamiento sobre los resultados de experimentos individuales utilizando los protocolos descritos aquí se pueden encontrar en las Figuras 1-3 de Pham et al. (2019) 2, Figuras 2-3 de Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3 y Figura 3 de Adolfi et al. (2020) 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig01.jpg"> Figura 1. Esquema de prueba de liberación inundativa sin unidad.  Se instalan nueve jaulas de 0,216 m3 con 60 larvas de segunda estrella (sexos mixtos) de tipo salvaje agregadas a cada una. A partir de la semana 3, a las hembras se les proporciona una harina de sangre semanalmente y los huevos se recolectan y eclosionan. Hasta la semana 8, 60 larvas son seleccionadas al azar y devueltas a sus respectivas jaulas semanalmente para crear una población estructurada por edades en las jaulas (fase inicial). A partir de la semana 9, las nueve jaulas se asignan aleatoriamente por triplicado de acuerdo con sus proporciones de liberación de machos transgénicos: salvajes (fase experimental). Las jaulas A (Control) no tienen pupas transgénicas añadidas. A las hembras se les proporciona una harina de sangre semanalmente y los huevos se recolectan, eclosionan y crían para pupas. 30 pupas macho y 30 hembras de tipo salvaje se agregan de nuevo a sus jaulas. Las jaulas 1:1 tienen 30 pupas macho transgénicas adicionales añadidas. Las jaulas 1:0.1 tienen 300 pupas machos transgénicos adicionales añadidas. 300 larvas de cada una de las 9 jaulas se seleccionan al azar y se examinan para detectar el marcador fluorescente. Este procedimiento se repitió semanalmente hasta la fijación de transgenes (proporción estabilizada de mosquitos transgénicos-silvestres después de unas pocas generaciones). Adaptado de Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig02.jpg"> Figura 2. Alimentación de sangre de poblaciones de jaulas.  (A) Se ofrecen ratones anestesiados o (B) comederos de sangre Hemotek para la alimentación sanguínea de mosquitos hembra en las jaulas de 0,216 m3 o las pequeñas jaulas de 0,005 m3 , respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig03.jpg"> Figura 3. Detección de fenotipos para ensayos de jaulas sin impulso, superpuestas de impulsor genético y no superpuestas.  Imágenes fluorescentes de una larva, pupa y adulto de fenotipos transgénicos o de tipo silvestre. En este ejemplo, los individuos de An. stephensi fueron examinados para detectar el marcador DsRed impulsado por el promotor 3xP3 en los ojos (DsRed + o DsRed-), visible en las tres etapas, y los adultos fueron examinados para detectar sexo ( ♀ o ♂ ). Tenga en cuenta la fluorescencia de fondo en larvas de tipo silvestre asociadas con el bolo alimenticio en el intestino medio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig04.jpg"> Figura 4. Esquema de ensayo de jaula de impulsor genético superpuesto.  Seis jaulas de 0,216 m3 se instalan por triplicado de acuerdo con sus proporciones de liberación de machos de tipo genético:salvaje. Se agregaron 120 machos de tipo salvaje y 120 hembras de tipo salvaje a cada jaula. A las jaulas con una proporción de liberación de machos impulsados por genes de 1: 1 se les agregaron 120 machos transgénicos adicionales. A las jaulas con una proporción de liberación masculina de 1:10 se les agregaron 12 machos transgénicos adicionales. Hasta la introducción completa del transgén, cada 3 semanas, las hembras adultas reciben harinas de sangre y los huevos se recolectan y eclosionan. Un total de 240 larvas fueron seleccionadas al azar y devueltas a sus respectivas jaulas. Trescientas (300) larvas se seleccionan al azar y se examinan para detectar el marcador dominante. Más tarde se examinan como pupas y adultos para el color de los ojos y el sexo. No se agregan machos transgénicos adicionales a las jaulas originales. Adaptado de Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig05.jpg"> Figura 5. Esquema de ensayo de jaula de impulsor genético no superpuesto.  Nueve pequeñas jaulas de 0,005 m3 se instalan por triplicado de acuerdo con sus proporciones de liberación de machos de tipo genético:salvaje. Las jaulas con una proporción de liberación de machos de 1: 1 tienen 100 hembras de tipo salvaje, 50 machos de tipo salvaje y 50 machos impulsores de genes agregados. Las jaulas con una proporción de liberación de machos de 1: 3 tienen 100 hembras de tipo salvaje, 75 machos de tipo salvaje y 25 machos impulsores de genes agregados. La proporción de liberación de machos de las jaulas 1:10 tiene 100 hembras de tipo salvaje, 90 machos de tipo salvaje y 9 machos impulsores de genes agregados. A las hembras se les proporciona una comida de sangre y huevos recolectados y eclosionados. Para las jaulas 1:1 y 1:3, 200 larvas se seleccionan al azar y se utilizan para poblar nuevas jaulas, separadas de las de sus padres, para la próxima generación. Otras 500 larvas se seleccionan al azar y se crían en pupas, cuando se examinan para detectar el gen marcador dominante. Las 500 pupas se crían a adultos y se puntúan por sexo. Todas las larvas restantes se examinan para detectar el marcador. Para las jaulas 1:10, todas las larvas se puntúan en las generaciones 1-12 y se utilizan 200 larvas que reflejan la frecuencia de transgenes existente para poblar nuevas jaulas. A partir de la generación 13, estas jaulas se configuran de manera idéntica a las jaulas 1:1 y 1:3. Adaptado de Pham et al. (2019) 2 y Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig06.jpg"> Figura 6. Dinámica de fijación transgénica predicha para los diferentes ensayos de jaulas de reemplazo de poblaciones.  Representación de la dinámica de fenotipo esperada de las réplicas de mejor rendimiento para cada uno de los experimentos de ensayos en jaulas realizados por Pham et al. (2019) 2, monitoreado durante 7 generaciones. Las configuraciones de experimentos se describen en los Protocolos. Las predicciones se basan en datos de los 9 experimentos en los modelos de liberación 1: 1 (réplicas triplicadas para cada uno de los tres protocolos de prueba de jaula diferentes). El eje X es el número de generación después de la introducción inicial y el eje Y es la proporción de larvas que muestran el fenotipo del marcador DsRed (DsRed +) a lo largo del tiempo. Las líneas discontinuas representan líneas de tendencia lineales de los datos. El fenotipo DsRed+ resulta de tener al menos una copia del alelo modificado. Por lo tanto, los resultados reflejan la propagación del transgén, acelerada en el sistema de impulsores genéticos, alcanzando (casi) la introducción completa al final de la observación. Para conocer la variabilidad entre las réplicas y los datos detallados completos sobre los experimentos, consulte Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú R et al. (2020)3 y Adolfi A et al. (2020)4. Imágenes adaptadas de Pham TB et al. (2019) Modificación experimental de la población del mosquito vector de la malaria, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nat Commun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 y Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Expediente Complementario: La construcción de la jaula de colonia de 0.005 m3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588%20Supplementalvideo-1.m4v" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Los protocolos reportados aquí ilustran tres formas alternativas de evaluar el rendimiento de los mosquitos genéticamente modificados destinados al control de vectores en ensayos de jaulas pequeñas contenidos en laboratorio. Cada protocolo se adapta a la modificación específica que tiene la cepa del mosquito (impulsor genético o no impulsor genético) y los tipos de parámetros medidos.

Ensayos de laboratorio en jaulas pequeñas de mosquitos anofelinos genéticamente modificados

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

El protocolo descrito aquí es apropiado para evaluar el rendimiento de los mosquitos transgénicos y las comparaciones con contrapartes de tipo silvestre en un pequeño ensayo de jaula de laboratorio. Los ensayos en jaulas pequeñas son importantes para proporcionar valores empíricos que ayuden a completar la implementación de nuevas tecnologías para la eliminación de la malaria. Los ensayos en jaulas se pueden adaptar a otros diseños experimentales y son adecuados para evaluar la dinámica de una amenaza de un transgen de deseo.Tras la introducción individuos transgénicos. Comience la fase inicial del experimento instalando tres jaulas de 0,216 metros cúbicos por triplicado. Y agregando 60 larvas de tipo salvaje de segundo enstar a cada jaula durante tres semanas sucesivas.Cada semana, proporcione a las hembras adultas en cada jaula ratones anestesiados como fuente de comida de sangre. Y un recipiente de oviposición tres días después de la comida de sangre. Eclosionar huevos de cada jaula semanalmente.De la cuarta a la octava semana, seleccione 60 larvas L2 de segunda entrada al azar para regresar a sus respectivas jaulas. En la semana nueve, asigne aleatoriamente un conjunto de jaulas triplicadas como controles y un conjunto para cada relación de liberación deseada. Agregue 60 pupas de tipo silvestre con 30 machos y 30 hembras a las jaulas de control semanalmente.Mantenga una proporción de uno a uno en cada jaula respectiva agregando semanalmente 30 pupas machos transgénicos junto con 60 pupas de tipo silvestre. Para una proporción de uno a 0.1, agregue 300 pupas machos transgénicos semanalmente en cada jaula respectiva junto con 60 pupas de tipo silvestre. Repita la adición de pupas de mosquitos en la jaula, proporcionando harina de sangre y huevos para incubar cada semana.Seleccione un total de 300 larvas de cada jaula al azar para su detección. Examinar las larvas bajo un microscopio estereoscópico con filtros de fluorescencia para la expresión del marcador fluorescente dominante en las etapas larvaria y pupal. Puntúa el sexo de las pupas resultantes.En el experimento de impulsor genético, emplee una estrategia de barrera manteniendo a los mosquitos en un insectario seguro y siguiendo los procedimientos operativos estándar con monitoreo regular. Prepare una jaula configurada con dos juegos de jaulas triplicadas de 0.216 metros cúbicos para cada proporción deseada de liberación de machos transgénicos a salvajes. Para lograr una proporción de liberación masculina de uno a uno, agregue 120 machos transgénicos, 120 machos y hembras de tipo salvaje en la etapa de pupa a cada jaula replicada.Proporcione una comida de sangre con ratones anestesiados a las hembras de cuatro a siete días de edad en cada jaula. Después de incubar los huevos en una bandeja larvaria, seleccione aproximadamente 240 primeras larvas instar L1 al azar de cada jaula y críelas a pupas antes de regresar a sus respectivas jaulas. Seleccione y examine las larvas para detectar marcadores oculares y fenotipo sexual como se describió anteriormente.Armar una configuración de jaula de jaulas triplicadas de 0.005 metros cúbicos con un número igual de machos y hembras para cada proporción de liberación específica de transgénicos a machos de tipo silvestre. Usando un aparato de alimentación artificial, proporcione comidas de sangre a las hembras de cuatro a siete días de edad en cada jaula en dos días consecutivos. Tres días después de la segunda comida de sangre, agregue un recipiente de oviposición y retire los recipientes después de tres días.Después de anotar a todos los muertos y adultos vivos que permanecen en la jaula por sexo, guárdelos a menos 80 grados centígrados para el análisis molecular. Eclosionar huevos y correr selecciona 200 larvas L1 y deja las larvas a un lado para poblar nuevas jaulas para la próxima generación. Luego seleccione al azar otras 500 larvas de cada jaula reservada para la detección.Criar las 200 larvas seleccionadas a pupa y 500 larvas a la etapa L4 instar. Devuelva la pupa de 200 bandejas para poblar la nueva jaula. Criba las larvas seleccionadas al azar para el marcador ocular y el fenotipo sexual como antes.En el análisis representativo, se muestra la dinámica fenotipo esperada de las réplicas de mejor rendimiento para los diferentes protocolos de ensayos de jaulas de reemplazo poblacional. Los resultados mostraron el aumento lineal de la proporción de larvas con fenotipo de marcador DsRed durante siete generaciones. La liberación uno a uno sin unidad alcanzó poco más del 80% de introducción de transgenes en siete generaciones.Los protocolos de impulsor genético lograron esto en tres o cuatro generaciones. Validando así que una sola liberación de un sistema de impulsor genético puede ser más eficiente para la introducción de transgenes. Al final de la observación, la propagación del transgén había alcanzado una introducción casi completa en los sistemas de impulsores genéticos.Los parámetros importantes, como la relación de liberación entre la estructura de edad de la población, el tamaño de la jaula y otros, variarán según el propósito del experimento y los objetivos específicos. Se pueden realizar experimentos para evaluar parámetros de aptitud física como la fertilidad y la fecundidad. Se pueden utilizar más datos empíricos de los ensayos en jaulas para parametrizar modelos matemáticos de la dinámica de la población.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Clasificación de flujo y secuenciación exome de las células Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin clásico

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Investigación

Genética

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

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De alto rendimiento de aislamiento robótica asistida sensible a la temperatura del letal mutantes en<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

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Una basada en arreglos comparativo genómica hibridación plataforma eficiente detección de copia número de las variaciones en mutantes rápido neutrón-inducida de Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Trasplante Intraventricular de Precursores Neuronales Deingidos para Estudios de Neuroarquitectura In Vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

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Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identificación de mutaciones por fusión de alta resolución en una población de arroz

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Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

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Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

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Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

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Investigación del papel transcripcional de un silenciador intrónico RUNX1 por RIBonucleoprotein CRISPR/Cas9 en células de leucemia mieloide aguda

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...