Name: small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes
Uploaded: 2021-05-01T15:00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell och Madeline Nottoli för mygghållning. Finansieringen tillhandahölls av University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ är professor i Donald Bren vid University of California, Irvine.

Djuretiskt uttalande Denna studie utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i guiden för vård och användning av laboratoriedjur vid De nationella hälsoinstituten. Protokoll godkändes av institutional animal care and use committees vid University of California (Animal Welfare Assurance Numbers A3416.01).
1. Översvämmade frisättningsförsök på myggor som inte är gendrivna (figur 1)
<ol><li>Installation och underhåll av burar<ol>
<li>Sätt upp tre uppsättningar tredubbla 0,216 m3 burar genom att tillsätta 60 andra instar wild-typ (WT) larver i varje bur under tre på varandra följande veckor. OBS: Det är inte möjligt att bestämma könet på andra-instar larver genom lätt mikroskopi, så de prover som läggs till varje bur kommer att bestå av både män och kvinnor.</li>
		<li>Vid varje vecka, ge vuxna kvinnor i varje bur bedövade möss som blodmjölskälla (figur 2A) och en ovipositionsbehållare 3 dagar efter blodmjölet. OBS: Medan en alternativ konstgjord utfodringsapparat kan användas, ger levande sövda möss för blodmjöl bättre myggmatningsprestanda i dessa stora (0,216 m3) burformat. Detta kräver ett godkänt djuranvändningsprotokoll och relevant (t.ex. Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) godkännande för användning av möss. OBS: Enskilda möss bedövas med en blandning av 4 mg/musketamin HCl och 0,4 mg/mus xylazin. Djur injiceras med mellan 0,1 - 0,5 ml av denna blandning.</li>
		<li>Kläck ägg från varje bur varje vecka och välj 60 näst-instar (L2) larver slumpmässigt för att returneras till sina respektive burar för att kompensera dödligheten (vecka 4-8). ANMÄRKNING: Steg 1.1.1-1.1.3 är nödvändiga för att upprätta en stabil och fördelad åldersstrukturerad population i burarna - kallad "inledande fas".</li>
		<li>Vid vecka 9 tilldelar du burar monterade i steg 1.1.1 slumpmässigt i tre exemplar för utsläpp av önskat manligt frisättningsförhållande.<ol>
<li>Ange en uppsättning tre exemplar som kontroller för att bedöma konsekvens under hela experimentet.</li>
			<li>Ange en uppsättning tre exemplar för varje önskat frisläppandeförhållande (till exempel 1:1 eller 1:0.1 transgena:WT-hanar). OBS: Denna punkt på kallas "experimentell fas".</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Replikerar och frigörr förhållanden<ol>
<li>Tillsätt 60 WT-puppar (30 hanar och 30 honor) till kontrollburarna varje vecka.</li>
		<li>För att bibehålla ett 1:1-förhållande, tillsätt veckovis 30 transgena manliga puppar tillsammans med 60 (30 manliga och 30 kvinnliga) WT-puppar i varje bur.</li>
		<li>För att bibehålla ett förhållande på 1:0,1, tillsätt veckovis 300 transgena manliga puppar tillsammans med 60 (30 manliga och 30 kvinnliga) WT-puppar i respektive bur. OBS: Fortsatt tillsats av vilda myggor till burarna bibehåller burtätheten, som förväntas minska varje vecka på grund av åldersrelaterad vuxendödlighet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Screening av fenotyper<ol>
<li>Välj totalt 300 larver från varje bur slumpmässigt. Med hjälp av ett stereomikroskop utrustat med fluorescensfilter, skärm för uttryck av den fluorescerande dominerande markören vid larv- och pupalstadierna och poängsätta de resulterande vuxnas kön (figur 3). OBS: Den fenotypiska screeningen beror på den dominerande markör som ingår i transgenkonstruktionen integrerad i myggorna (till exempel Discosoma sp. rött fluorescerande protein [DsRed], cyan fluorescerande protein [CFP], grönt fluorescerande protein [GFP]), och på promotorn som driver sitt uttryck (den mest använda i myggtransgenes är 3xP3 promotordrivande uttryck i ögon och nervkabel).</li>
		<li>Följ det här protokollet i så många generationer som krävs av de utfallsparametrar som definieras i den experimentella designen. OBS: Försöket avslutas vanligtvis när alla myggor har minst en kopia av transgenen (bestämd av närvaron av den dominerande fluorescerande markören) eller förhållandet mellan transgena till WT-myggor i en bur stabiliseras och fluktuerar inte kraftigt efter några (3-5) generationer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Överlappande generationsförsök av gendrivna myggor (figur 4)
OBS: Myggor som bär gendrivar system kräver skriftliga och granskade protokoll och bör godkännas av en institutionell biosäkerhetskommitté (IBC) eller motsvarande, och andra vid behov. Mygginneslutning (ACL 2+ nivå) bör följa rekommenderade procedurer5,6,7. Specifikt bör gendrivarexperimenten använda två stränga inneslutningsstrategier. Den första är vanligtvis fysiska barriärer (barriärstrategi) mellan organismer och miljön. Detta kräver att man har en säker insekts- och standardrutiner (inklusive övervakning) för att säkerställa att myggor inte kan fly. Den andra inneslutningsstrategin kan vara molekylär, ekologisk eller reproduktiv5.
<ol><li>Installation av bur<ol>
<li>Ställ in två uppsättningar tredubbla 0,216 m3 burar för varje önskat transgent: WT manligt frisättningsförhållande.<ol>
<li>För att uppnå ett manligt frisättningsförhållande på 1:1, tillsätt 120 transgena män, 120 WT-hanar och 120 WT-honor i pupastadiet till varje replikerad bur.</li>
			<li>För att uppnå ett frisättningsförhållande på 1:10, tillsätt 12 transgena män, 120 WT-hanar och 120 WT-honor i pupastadiet till varje replikerad bur. OBS: Olika frisättningsförhållanden kan testas (1:1, 1:3, 1:10, etc.) och antalet myggor som används för att initiera experimenten varierar i enlighet därmed. Det är dock viktigt att beakta effekterna av låga tal på den statistiska utvärderingen av uppgifterna.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Underhåll och screening av befolkningen<ol>
<li>Ge 4-7 dagar gamla kvinnor i varje bur en blodmåltid med sövda möss (figur 2A).</li>
		<li>Tre dagar efter blodmjölet, sätt in en ovipositionbehållare i varje bur.</li>
		<li>Kläck ägg i en larvbricka, välj ~ 240 första instar (L1) larver slumpmässigt från varje bur, upp dem till vuxen ålder och returnera dem till sina respektive burar.</li>
		<li>Ge ytterligare (2-3) blodmåltider var 3-4 dagar för de nyuppkomna vuxna enligt beskrivningen i steg 2.2.1. OBS: Inga ytterligare transgena hanar tillsätts under någon av de följande generationerna.</li>
		<li>Välj totalt 300 larver från varje bur slumpmässigt och screena dem för närvaron av den dominerande markören fenotyp vid larv- och pupalstegen med hjälp av ett fluorescensstereomikroskop och poäng framväxande vuxna för sex (figur 3). OBS: Liksom tidigare kommer den fenotypiska screeningen att bero på den dominerande markör och promotor som ingår i gendrivsystemet och integreras i de transgena myggorna (t.ex. DsRed, CFP eller GFP). Om homozygous eller heteroallelic störningar av de riktade generna resulterar i en synlig fenotyp (till exempel gener relaterade till ögonpigmentering), kommer screening av detta drag att bero på vilket stadium det är lättast att visualisera den förändrade fenotypen.</li>
		<li>Följ det här protokollet i så många generationer som krävs av de utfallsparametrar som definieras i den experimentella designen. OBS: Varje generation (avgränsad av blodmåltiden) tar ~ tre veckor. Studien avslutas vanligtvis när alla myggor anses homozygous för gendriftskonstruktionen eller populationerna stabiliseras vid en maximal andel myggor som bär minst en kopia av gendrivskonstruktionen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Icke-överlappande generationsförsök av gendrivna myggor (figur 5).
<ol><li>Installation av bur<ol>
<li>Ställ in tredubbla burpopulationer på 0,005 m3 för varje specifikt frisättningsförhållande mellan transgena och WT-hanar som ska undersökas (till exempel tre uppsättningar tre uppsättningar tre tredelsburar som var och en har ställts in med 1:1, 1:3, 1:10 frisättningsförhållanden). Ställ in alla burar med lika totalt antal män och kvinnor. OBS: Tilläggsfilen är en video som visar byggandet av koloniburen på 0,005 m3 .<ol>
<li>Lägg till 50 transgena hanar, 50 WT-hanar och 100 WT-honor till var och en av tre replikera burar för att uppnå ett 1:1 manligt frisättningsförhållande.</li>
			<li>Lägg till 25 transgena hanar, 75 WT-hanar och 100 WT-honor till var och en av tre replikera burar för att uppnå ett 1:3 manligt frisättningsförhållande.</li>
			<li>Tillsätt 9 transgena hanar, 90 WT-hanar och 100 WT-honor till var och en av tre replikera burar för att uppnå ett 1:10 manligt frisättningsförhållande. OBS: Olika frisättningsförhållanden kan testas och antalet myggor som används för att initiera experimenten kan variera i enlighet därmed. Det är dock viktigt att överväga effekten av lågt antal myggor på de statistiska analyserna. Det här är enskilda utgåvor; inga ytterligare transgena hanar tillsätts vid någon efterföljande generation.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Underhåll och screening av befolkningen<ol>
<li>Förse de 4-7 dagar gamla honorna i varje bur med blodmåltider med hjälp av en konstgjord matningsapparat (figur 2B) två dagar i följd. OBS: Rutinmässiga blodmåltider för kvinnor består av en kommersiellt tillgänglig blodkälla (t.ex. kalvblod) från en matningsapparat. Levande bedövade möss används endast för att ge blodmjöl i större (0,216 m3) burformat för bättre utfodringsprestanda.</li>
		<li>Tillsätt en ovipositionsbehållare 3 dagar efter det andra blodmjölet. Efter tre dagar, ta bort ovipositionsbehållarna. OBS: I detta steg kan 5-10 honor väljas slumpmässigt från varje bur och placeras individuellt i injektionsflaska för att bedöma ytterligare konditionsparametrar, såsom fertilitet och fecundity, om det behövs.</li>
		<li>Poäng efter kön alla vuxna (döda och levande) kvar i buren och lagra dem vid -80 °C för molekylär analys.</li>
		<li>Kläck ägg och välj slumpmässigt 200 L1 larver från 1:1 och 1:3-förhållandet burar för att fylla nya burar för nästa generation. OBS: På grund av den låga frekvensen av start transgen individ i 1:10-förhållandet burar, slumpmässig provtagning kan leda till överdriven förlust av transgena avkomma i nästa generation för att fortsätta populationen.</li>
		<li>För att säkerställa en noggrann provtagning för 1:10-burarna och tillräckligt många transgena myggor, screena alla larver för den dominerande markören och välj 200 larver som återspeglar den observerade transgenefrekvensen för att fylla de nya burarna. OBS: 1:10 burarna kan bibehållas identiskt med 1:1 och 1:3 burar när de når en transgene frekvens på ≥80%.</li>
		<li>Välj 500 larver från varje bur slumpmässigt för en djupgående analys. Skärm under ett fluorescensstereomikroskop för de förväntade markörfenotyperna vid larv- och pupalstadierna och poängkön hos vuxna (figur 3). OBS: "Exceptionella" fenotyper kan väljas för att korsas ytterligare och analyseras molekylärt för att övervaka resistent allelbildning.</li>
		<li>Detta protokoll kan följas i så många generationer som krävs av de utfallsparametrar som definieras i den experimentella designen. OBS: Varje generation avgränsas av blodmjölet och tar ~ tre veckor. Studien avslutas vanligtvis när alla myggor anses homozygous för gendriften eller populationer stabiliseras vid en maximal prevalens av transgena myggor. Och som tidigare kommer screening för fenotyper att bero på de dominerande markörer och promotor som är integrerade i de transgena myggorna (till exempel DsRed, CFP, GFP) eller i de riktade generna om de presenterar en synlig fenotyp (till exempel gener relaterade till ögonpigmentering).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLOS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi.">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11 (1), 5553 (2020).</li><li>Akbari, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safeguarding+gene+drive+experiments+in+the+laboratory.">Safeguarding gene drive experiments in the laboratory.</a> Science. 349 (6251), 927-929 (2015).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+Laboratory+Containment+and+Management+of+Gene+Drive+Systems+in+Arthropods.">Recommendations for Laboratory Containment and Management of Gene Drive Systems in Arthropods.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 18 (1), 2-13 (2018).</li><li>Adelman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+the+road+for+insect+gene+drive+research+and+testing.">Rules of the road for insect gene drive research and testing.</a> Nature Biotechnology. 35 (8), 716-718 (2017).</li><li>Long, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+commitments+for+field+trials+of+gene+drive+organisms.">Core commitments for field trials of gene drive organisms.</a> Science. 370 (6523), 1417-1419 (2021).</li><li>Facchinelli, L., North, A. R., Collins, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-cage+assessment+of+a+transgenic+sex-ratio+distortion+strain+on+populations+of+an+African+malaria+vector.">Large-cage assessment of a transgenic sex-ratio distortion strain on populations of an African malaria vector.</a> Parasites Vectors. 12, 70 (2019).</li></ol>

Författarna har inga avslöjanden.

Genetiskt konstruerade myggor som har patogenblockeringsförmåga eller bär sterilitetsgener utgör nya verktyg för att kontrollera vektorburna sjukdomar. Med tanke på den mångfald av parametrar som omfattar dessa alternativa metoder består ett kritiskt steg i deras forskning av laboratoriebegränsade experimentella utvärderingar som möjliggör en snabb och säker förutsägelse av de potentiella resultaten av en syntetisk transgenfrisättning för kontrolländamål1.
Eftersom övervakningen av transgendynamiken i burpopulationer kan sträcka sig i flera månader, är en av de centrala aspekterna av protokollen konsekvensen i experimentell design mellan replikat (inklusive mygguppfödning, burstorlek, åldersstrukturerade populationer, fasta frisättningsförhållanden, stabila blodmjölskällor och minimalt invasiva screeningförfaranden).
Manliga utsläpp anses vara idealiska eftersom manliga myggor varken överför patogener eller matar på människor, därför kan de säkert införa ärftliga egenskaper i vilda populationer. I laboratoriebursexperiment är det möjligt att upptäcka transgena stammar med minskad manlig parningskonkurrenskraft och andra fitnessbelastningar i samband med transgene integration. Direkta och specifika experiment, som de som utförs i stora burar10, kan dock utföras för att korrekt analysera manlig konkurrenskraft, liksom kvinnlig fecundity i mer naturliga myggtätheter2. Dessutom kan empiriska data från burförsöken användas för att parametrisera modeller av burpopulationsdynamik, inklusive resistent allelbildning, och ge användbar information om effektivitet och möjliga justeringar i den föreslagna tekniken.
De protokoll som beskrivs här kan enkelt anpassas till andra experimentella konstruktioner efter behov, med minimala krav på regelbunden insektsinfrastruktur och förhållanden. Dessutom, förutom de kommersiella burarna och mikroskopen, är de flesta material billiga och tillåter billiga flera replikat och iterationer av försöken. Detta gör det också möjligt att förkontrollera flera transgena stammar i små burförsök för att prioritera att bäst presterande kandidater kan flyttas framåt i den stegvisa testvägen och avbryta testningen av dem som visar suboptimala prestanda.
Slutligen motiverar oron för användningen av genetiskt modifierade organismer utarbetandet av ramar för utveckling, utvärdering och tillämpning av genetiska strategier för förebyggande av myggburna sjukdomar5,8,9. Relevansen och genomförandet av de protokoll som definieras här överensstämmer med dessa riktlinjer.

Strategier baserade på genetiskt konstruerade myggor eftersträvas för att kontrollera överföringen av vektorburna patogener som de som orsakar malaria1. Dessa inkluderar teknik 1) som syftar till att minska antalet och densiteterna hos Anopheles myggor (populationsdämpning), eller 2) som syftar till att försämra vektorernas förmåga att överföra parasiter som är ansvariga för mänsklig sjukdom (populationsmodifiering, ersättning eller förändring) där stammar av vektorer är konstruerade för att uttrycka effektorgener som förhindrar patogenöverföring. Dessa genetiska metoder har stärkts av tillkomsten av CRISPR/ Cas9-baserade gendrivare, med proofs-of-concept i parasitöverföringsmyggor av effektiv spridning av nyttolastegenskaper samt anti-parasitiska effektormolekyler i burpopulationer.
Små laboratoriebursförsök utgör ett första steg för att utvärdera egenskaperna hos transgena stammar som en del av en stegvis strategi för deras vidare utveckling mot fälttillämpningar2. Specifika resultat överväganden inkluderar ärftlighet av det introducerade DNA i en konkurrensutsatt miljö, penetrance och expressivitet av fenotyp och stabilitet. Relevanta experimentella designfunktioner inkluderar storleken på burarna, myggtätheter, antal replikat, överlappande eller icke-överlappande generationer, åldersstrukturerade målpopulationer, enstaka eller flera utsläpp av konstruerade stammar, endast manliga, kvinnliga eller blandade könsutgivningar, frisättningsförhållanden, blodmjölskällor (artificiella eller levande djur) och screeningförfaranden.
Vi beskriver här protokoll som används för att utvärdera stammar av anofenin myggor för översvämmade utsläpp (inget gendrivsystem) och de som bär autonoma gendrivsystem medierade av Cas9 endonucleases och vägleda RNAs (gRNA). Tillämpning av dessa protokoll förekommer i Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, och Adolfi et al. (2020) 4.
Översvämmade frisättningsförsök utvärderar spridningshastigheten för en designad transgen under Mendelian arv efter flera utsläpp av ett stort antal transgena myggor i en vild population. Utan att transgenen fästs vid ett drivsystem ger data från översvämmade utgivningsförsök information om lämpligheten och dynamiken hos transgenen av intresse för en stabiliserad befolkning.
När myggpopulationer innehåller ett autonomt gendrivsystem är små burförsök utformade för att bedöma dynamiken i spridningen av önskad transgen genom att bestämma graden av dominerande markörökning efter en enda introduktion av transgena män. Autonoma gendrivarelement bär de gener som kodar Cas9-nukleas, gRNA och dominerande markör som är kopplade på ett sådant sätt att de är aktiva i efterföljande generationer.
Överlappande generationer avser samtidig förekomst av flera generationer i samma bur för att skapa en åldersstrukturerad kontinuerlig population, medan "icke-överlappande" avser enstaka diskreta generationer i varje på varandra följande population i bur2. Gendrivna burexperiment kan avslutas när den ursprungliga dynamiken i enheten (omvandlings) kan bestämmas (8-10 generationer beroende på konstruktionen), och medan de ger information om transgenens kortsiktiga stabilitet inom myggpopulationen, får de inte avslöja vad som händer när och om de dominerande markörfrekvenserna når eller är nära full introduktion (varje mygga som bär minst en kopia av gendrivsystemet).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Artificial feeders</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>SP6W1-3</td>
			<td>Starter pack &#8211; 6 feeders with 3ml reservoirs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage, commercial</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1450D</td>
			<td>Collapsible Cage, 24 X 24 X 24&#34; - 0.216 m3 (60 cm3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage tub (popcorn)</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>VP170-0006</td>
			<td>0.005 m3 (170 fl oz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope with fluorescence light and filters</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue sticks</td>
			<td>Michaels</td>
			<td>88646598807</td>
			<td>Gluesticks 40 pk,&#160; 0.4X4&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun</td>
			<td>Woodwards Ace</td>
			<td>2382513</td>
			<td>Stanley, 40 watt, GR20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon screen (netting)</td>
			<td>Joann.com</td>
			<td>1102912</td>
			<td>Tulle 108&#34; Wide x 50 Yds - ~35.6 cm2 (14 in2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oviposition cups</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>259126</td>
			<td>Beaker PP grad 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor cutting tool</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>487899</td>
			<td>Box cutters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>978561</td>
			<td>Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stapler</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>908194</td>
			<td>Swingline Commercial Desk Stapler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical sleeve (stockinette)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56612-664</td>
			<td>~48 cm (19&#8221;) cut from bolt ~15 cm (6&#8221;) X ~23 m (25y)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td>295715</td>
			<td>Pk of 100, 14&#8221; cable ties - 35.6 cm (14 in)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes

Kontroll av myggburna patogener med hjälp av genetiskt modifierade vektorer har föreslagits som ett lovande verktyg för att komplettera konventionella kontrollstrategier. CRISPR-baserade homing gendrivsystem har gjort transgen teknik mer tillgänglig inom det vetenskapliga samfundet. Utvärdering av transgen myggprestanda och jämförelser med vilda motsvarigheter i små laboratoriebursförsök ger värdefulla data för utformningen av efterföljande fältbursexperiment och experimentella bedömningar för att förfina strategierna för förebyggande av sjukdomar. Här presenterar vi tre olika protokoll som används i laboratoriemiljöer för att utvärdera transgene spridning i anopheline mygg vektorer av malaria. Dessa inkluderar översvämmade utgåvor (inget gendrivsystem) och gendrift överlappande och icke-överlappande generationsförsök. De tre försöken varierar i ett antal parametrar och kan anpassas till önskade experimentella inställningar. Dessutom är insektsstudier i små burar en del av den progressiva övergången av konstruerade insekter från laboratoriet till öppna fältutsläpp. Därför utgör de protokoll som beskrivs här ovärderliga verktyg för att tillhandahålla empiriska värden som i slutändan kommer att bidra till genomförandet av ny teknik för malariaeliminering.

Transgena anofeninmyggor som genereras för att bära icke-gendrift eller autonoma gendrivarmodifieringar ställs in för burförsök enligt beskrivningen i avsnittet Protokoll. De representativa resultaten som visas här visar fenotypdynamiken hos de bäst presterande replikaten av var och en av burförsöksexperimenten som utförs av Pham et al. (2019) 2 för Anopheles stephensi myggor. De tre studierna (1 - 3: inundativ icke-gendrift, överlappande gendrift och icke-överlappande gendrift) varierade i olika parametrar, såsom burets storlek (0,216 m3 vs 0,005 m3), oavsett om målpopulationen var åldersstrukturerad, blodmjölskälla (möss eller konstgjord matare) och frisättningsförhållanden. Som ett sätt att representera visar figur 6 de observerade data som valts ut från samma frisläppandeförhållande (1:1) för alla tre protokoll som används, under sju generationer.
1:1-versionen som inte är enhet når >80% transgene-introduktion inom 6-7 generationer. För gendrivna transgena burförsök når 1:1-utgåvorna i både de icke-överlappande och överlappande protokollen denna nivå inom 3-4 generationer, vilket validerar förväntan att en enda frisättning av ett gendrivsystem kan vara effektivare än icke-drive inundative releaser för transgene introduktion. Den snabbare banan kan också bekräftas av trendlinjernas lutning. Båda gendrivarprotokollen, trots olika upplägg, presenterar liknande vinklar och lutningstrender. I slutet av observationen uppnår icke-drivna burar ~ 80% av individer som bär transgenen, medan burar med gendrivna individer når fullständig (eller nästan komplett) introduktion. Fullständiga data och behandlingsuppgifter om enskilda experimentresultat med hjälp av de protokoll som beskrivs här finns i figur 1-3 i Pham et al. (2019) 2, Figurerna 2-3 i Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3 och figur 3 av Adolfi et al. (2020) 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig01.jpg"> Figur 1. Icke-enhet inundative release trial schematic.  Nio 0,216 m3 burar ställs in med 60 vilda andra-instar (blandade kön) larver som läggs till var och en. Från och med vecka 3 får kvinnor ett blodmjöl varje vecka och ägg samlas in och kläcks. Fram till vecka 8 väljs 60 larver slumpmässigt ut och återförs till sina respektive burar varje vecka för att skapa en åldersstrukturerad population i burarna (inledande fas). Från och med vecka 9 tilldelas de nio burarna slumpmässigt i tre exemplar enligt deras transgena: vilda manliga frisättningsförhållanden (experimentell fas). Burar A (Kontroll) har inga transgena puppar tillsatta. Kvinnor tillhandahålls ett blodmjöl varje vecka och ägg samlas in, kläcks och föds upp till puppar. 30 manliga och 30 kvinnliga vild-typ puppar läggs tillbaka till sina burar. Burar 1:1 har ytterligare 30 transgena hanvalpar tillsatta. Burar 1:0.1 har ytterligare 300 transgena hanvalpar tillsatta. 300 larver från var och en av de 9 burarna väljs slumpmässigt och screenas för fluorescerande markör. Denna procedur upprepades varje vecka till transgene fixering (stabiliserat förhållande av transgenic-wildtype myggor efter några generationer). Anpassad från Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig02.jpg"> Figur 2. Blodmatning av burpopulationer.  (A) Bedövade möss eller B) Hemotek-blodmatare erbjuds för blodmatande kvinnliga myggor på 0,216 m3 burar respektive de små 0,005 m3 burarna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig03.jpg"> Figur 3. Screening fenotyper för icke-enhet, överlappande gen-drive och icke-överlappande gen-driva burförsök.  Fluorescerande bilder av en larva, pupa och vuxen av transgena eller vilda fenotyper. I det här exemplet screenades An. stephensi-individer för DsRed-markören som drevs av 3xP3-promotorn i ögonen (DsRed + eller DsRed-), synlig i alla tre stadierna, och vuxna screenades för sex ( ♀ eller ♂ ). Observera bakgrundfluorescensen i vilda larver i samband med matbolus i midguten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig04.jpg"> Figur 4. Överlappande gen-drive cage rättegång schematisk.  Sex 0,216 m3 burar sätts upp i tre exemplar enligt deras gendrift: vilda manliga frisättningsförhållanden. 120 vildtyp män och 120 vilda kvinnor lades till varje bur. Burar med en 1:1 gen-drive manliga release förhållandet hade ytterligare 120 transgena män tillags. Burar med ett 1:10 manliga release förhållande hade ytterligare 12 transgena män tillagd. Fram till full introduktion av transgenen, var tredje vecka, är vuxna kvinnor försedda med blodmjöl och ägg samlas in och kläcks. Totalt 240 larver valdes slumpmässigt och återvände till sina respektive burar. Trehundra (300) larver väljs slumpmässigt och screenas för den dominerande markören. De screenas senare som puppar och vuxna för ögonfärg och sex. Inga ytterligare transgena män läggs till de ursprungliga burarna. Anpassad från Pham et al. (2019) 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig05.jpg"> Figur 5. Icke-överlappande gen-driva bur rättegång schematic.  Nio små 0,005 m3 burar är uppsatta i tre exemplar enligt deras gendrift: vilda manliga frisättningsförhållanden. Burar med ett 1:1 manligt frisättningsförhållande har 100 vilda honor, 50 vilda hanar och 50 gendrivna män tillsatta. Burar med ett 1:3 manligt frisättningsförhållande har 100 vilda honor, 75 vilda hanar och 25 gendrivna män tillsatta. Burar 1:10 manliga frisättningsförhållande har 100 vilda honor, 90 vilda män och 9 gendrivna män tillsatta. Kvinnor får en blodmåltid och ägg som samlas in och kläcks. För 1:1 och 1:3 burar väljs 200 larver slumpmässigt och används för att fylla nya burar, åtskilda från sina föräldrars, för nästa generation. Ytterligare 500 larver väljs slumpmässigt och föds upp till puppar, när de screenas för den dominerande markörgenen. De 500 popparna föds sedan upp till vuxna och poängsatts efter kön. Alla återstående larver screenas för markören. För 1:10-burarna poängsätts alla larver i generation 1-12 och 200 larver som återspeglar den befintliga transgenefrekvensen används för att fylla nya burar. Från och med generation 13 ställs dessa burar upp identiskt med burarna 1:1 och 1:3. Anpassad från Pham et al. (2019) 2 och Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62588/62588fig06.jpg"> Figur 6. Förutspådd transgene fixering dynamik för de olika population ersätter burförsök.  Representation av den förväntade fenotypdynamiken hos de bäst presterande replikaten för var och en av de burförsöksexperiment som utförs av Pham et al. (2019) 2, övervakas över 7 generationer. Experimentuppsättningar beskrivs i protokollen. Förutsägelserna baseras på data från alla 9 experiment på 1:1-versionsmodellerna (tre exemplar för var och en av de tre olika burförsöksprotokollen). X-axeln är generationsnumret efter den första introduktionen och Y-axeln är andelen larver som visar DsRed-markörfenotypen (DsRed+) över tid. Streckade linjer representerar linjära trendlinjer för data. DsRed+ fenotyp är resultatet av att ha minst en kopia av den modifierade allelen. Resultaten återspeglar därför spridningen av transgenen, påskyndad i gendrivsystemet, och når (nära) fullständig introduktion i slutet av observationen. För variationen mellan replikat och fullständiga detaljerade data om experimenten, se Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú R et al. (2020)3 och Adolfi A et al. (2020)4. Bilder anpassade från Pham TB et al. (2019) Experimentell populationsmodifiering av malariavektormyggan, Anopheles stephensi. PLOS Genet 15(12): e1008440. doi: 10.1371/journal.pgen.1008440, Adolfi A et al. (2020) Effektiv populationsmodifiering gendrivningssystem i malariamyggan Anopheles stephensi. Nat kommun 11(1): 5553. doi: 10.1038/s41467-020-19426-0 och Carballar-Lejarazú R et al. (2020) Nästa generations gendrift för populationsmodifiering av malariavektormyggan, Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci USA 117(37):22805-22814. doi: 10.1073/pnas.2010214117. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande fil: Konstruktionen av koloniburen på 0,005 m3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62588/62588%20Supplementalvideo-1.m4v" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes at JoVE.com

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Protokollen som rapporteras här illustrerar tre alternativa sätt att bedöma prestandan hos genetiskt konstruerade myggor avsedda för vektorkontroll i laboratorieinnehållade små burförsök. Varje protokoll är skräddarsytt för den specifika modifieringen som myggstammen bär (gendrift eller icke-gendrift) och de typer av parametrar som mäts.

Småburslaboratoriumförsök av genetiskt konstruerade anofenmyggor

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Protokollet som beskrivs här är lämpligt för att utvärdera transgen myggprestanda och jämförelser med vilda typ motsvarigheter i ett litet laboratorie burförsök. Försöken med små burar är viktiga för att ge empiriska värden som kommer att bidra till att fylla genomförandet av ny teknik för eliminering av malaria. Burförsöken kan anpassas till andra experimentella mönster och är lämpliga för att bedöma dynamiken i ett hot om en önskan transgen.Efter introduktionen transgena individer. Börja experimentets inledande fas genom att sätta upp tre 0,216 kubikmeter burar i tre exemplar. Och lägga till 60 andra-instar vilda typ larver till varje bur under tre på varandra följande veckor.Varje vecka, ge vuxna kvinnor i varje bur med sövda möss som en blodmjölskälla. Och en ovipositionsbehållare tre dagar efter blodmåltiden. Kläck ägg från varje bur varje vecka.Från vecka fyra till åtta väljer du 60 andra-instar L2 larver slumpmässigt för att återvända till sina respektive burar. Vid vecka nio tilldelar du slumpmässigt en uppsättning tredubbla burar som kontroller och en uppsättning för varje önskat frisättningsförhållande. Tillsätt 60 vilda typ puppar med 30 män och 30 honor till kontrollburarna varje vecka.Håll ett förhållande i varje bur genom att varje vecka lägga till 30 transgena manliga puppar tillsammans med 60 vilda typ puppar. För ett förhållande på 1 till 0,1, tillsätt 300 transgena manliga puppar varje vecka i varje bur tillsammans med 60 vilda typ puppar. Upprepa att tillsätta myggpuppar i buret, ge blodmjöl och kläckägg varje vecka.Välj totalt 300 larver från varje bur slumpmässigt för screening. Screena larverna under ett stereomikroskop med fluorescensfilter för uttryck av den fluorescerande dominerande markören vid larv- och pupalstadier. Poäng könet på den resulterande puppar.I gendrivarexperimentet, använd en barriärstrategi genom att hålla myggor i ett säkert insektsfel och följa standardrutiner med regelbunden övervakning. Förbered en bur som är inställd med två uppsättningar tredubbla 0,216 kubikmeter burar för varje önskat transgent till vilt typ hanfrisättningsförhållande. För att uppnå ett manligt frisättningsförhållande på en till en, tillsätt 120 transgena män, 120 vilda män och kvinnor i poppstadiet till varje replikera bur.Ge en blodmåltid med sövda möss till fyra till sju dagar gamla honor i varje bur. Efter kläckning av ägg i en larvbricka väljer du cirka 240 första instar L1-larver slumpmässigt från varje bur och lyfter dem till puppar innan du återvänder till sina respektive burar. Välj och screena larver för ögonmarkör och könsfenotyp enligt beskrivningen tidigare.Montera en burinställning av tredubbla 0,005 kubikmeter burar med lika många män och kvinnor för varje specifikt frisättningsförhållande av transgenik till vild typ hanar. Använd en konstgjord utfodringsapparat, ge blodmåltider till de fyra till sju dagar gamla kvinnorna i varje bur två dagar i följd. Tre dagar efter den andra blodmåltiden, tillsätt en ovipositionsbehållare och ta bort behållarna efter tre dagar.Efter att ha poäng alla döda och de levande vuxna som är kvar i buret efter kön, lagra dem på minus 80 grader Celsius för molekylär analys. Kläck ägg och kör välj 200 L1 larver och lägg larverna åt sidan för att fylla nya burar för nästa generation. Välj sedan slumpmässigt ytterligare 500 larver från varje bur som avsatts för screening.Upp de valda 200 larverna till pupa och 500 larver till L4 instar-scenen. Returnera puppar från 200 brickor för att fylla ny bur. Screen slumpmässigt utvalda larver för ögonmarkör och könsfenotyp som tidigare.I den representativa analysen visas den förväntade fenotypdynamiken hos de bäst presterande replikaten för de olika testprotokollen för populationsersättningsburar. Resultaten visade den linjär ökande andelen larver med DsRed markör fenotyp över sju generationer. Den en till ena icke-enhet release nådde lite mer än 80% transgene introduktion inom sju generationer.Gendrivarprotokollen uppnådde detta inom tre till fyra generationer. Således validera att en singel frigörare av ett gendrivsystem kan vara effektivare för transgeneintroduktion. I slutet av observationen hade spridningen av transgen nått nästan fullständig introduktion i gendrivsystem.Viktiga parametrar, såsom frisättningsförhållande befolkningsåldersstruktur, burstorlek och andra kommer att variera beroende på syftet med experimentet och specifika mål. Experiment för att bedöma konditionsparametrar som fertilitet och fecundity kan göras. Ytterligare mer empiriska data från burförsöken kan användas för att parametrisera matematiska modeller av populationsdynamik.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flödessortering och Exome-sekvensering av Reed-Sternberg-cellerna av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Förfarande för adaptiv Laboratory Evolution av mikroorganismer med hjälp av en kemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Hög genomströmning Robotsvetsad Assisted Isolering av temperaturkänslig dödliga mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En Array-baserad jämförande genomisk hybridisering plattform för effektiv upptäckt av kopia antalet variationer i snabbt Neutron-inducerad Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventrikulär transplantation av konstruerade neuronala prekursorer för in vivo Neuroarkitekturstudier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Generering av tumör Organoider från genetiskt modifierade musmodeller av prostata cancer

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Identifiera mutationer genom högupplöst smältning i en TILLING population av ris

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Modulering av Tau-subcellulär lokalisering som ett verktyg för att undersöka uttrycket av sjukdomsrelaterade gener

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generering av definierade genomiska modifikationer med CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...