Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

نشكر أنوجا كيبي و جون البروفيسور ريدموند سميث على المراجعة النقدية للمخطوطة. نشكر تاتيانا كوخ على المساعدة التقنية الخبيرة. نشكر كريستينا بيكاركوفا على المساعدة في تسجيل مقاطع الفيديو التجريبية. يتم دعم العمل في مختبرنا من قبل جمعية هيلمهولتز وتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) غرانت nr. 948636 (إلى NC).

1. إعداد العينة
<ol><li>استنساخ تسلسل الاهتمام في المتجه الذي يحتوي على شظايا الحمض النووي لامبدا، والتي هي بمثابة تسلسل مقبض (الشكل 2)43،50.</li>
	<li>أولا توليد قالب الحمض النووي للنسخ اللاحق في المختبر عن طريق PCR (الشكل 2B</str...

هنا، ونحن نظهر استخدام الملاقط البصرية المفلورة إلى جانب لدراسة التفاعلات والسلوك الديناميكي لجزيئات الحمض النووي الريبي مع مختلف ليغاندس. فيما يلي، تتم مناقشة الخطوات والقيود الهامة لهذه التقنية.
الخطوات الهامة في البروتوكول أما بالنسبة للعديد من الطرق الأخر...

نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي إلى البروتينات من خلال الحمض النووي الريبي هو عملية كيميائية حيوية معقدة، والتي يتم تنظيمها بدقة على جميع المستويات من خلال التفاعلات الجزيئية الكلية داخل الخلايا. للتنظيم الترجمي، تمنح التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين دورا حاسما للتفاعل بسرعة مع مختلف المحفزات والإشارات1,2. تؤثر بعض التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين على استقرار الحمض النووي الريبي وبالتالي تغير الوقت الذي يكون فيه الحمض النووي الريبي نشطا بشكل ترجمي. وترتبط التفاعلات الأخرى بين الحمض النووي الريبي والبروتين بآليات إعادة ترميز مثل إعادة معاينة وقف كودون، أو تجاوز، أو برمجة الريبوسومات frameshifting (PRF)3،4،5،6،7. في الآونة الأخيرة، تم إثبات عدد من البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs) للتفاعل مع عناصر مرنا التحفيزية وآلية الترجمة لإملاء متى وكم إعادة ترميز سيحدث في الخلية7،8،9،10،11. وهكذا، لتشريح دور البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي في الترجمة وكيف تعدل هيكل الجيش الملكي النيبالي والاستقرار، فمن المحوري لدراسة مبادئ التفاعل والخصائص الميكانيكية لهذه المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين بالتفصيل.
وقد أرست عقود من العمل الأساس لدراسة عملية الترجمة متعددة الخطوات والمتعددة المكونات، والتي تعتمد على التواصل المعقد بين الحمض النووي الريبي ومكونات البروتين في آلية الترجمة لتحقيق السرعة والدقة12,13,14. وتتمثل الخطوة الحاسمة التالية في فهم الأحداث التنظيمية المعقدة في تحديد القوى والجداول الزمنية والمحددات الهيكلية أثناء الترجمة بدقة عالية12,15,16,17. وقد تم تسليط الضوء على دراسة الديناميات تشكيل الحمض النووي الريبي وخاصة كيف تعمل العوامل المساعدة عبر المفعول على هيكل الجيش الملكي النيبالي أثناء الترجمة من خلال ظهور أدوات جزيء واحد، بما في ذلك ملاقط بصرية أو أدلة موجة وضع الصفر16،17،18،19،20،21،22،23،24 25,26
تمثل الملاقط البصرية (OT) تقنية جزيء واحد دقيقة للغاية ، والتي تم تطبيقها لدراسة أنواع عديدة من العمليات الديناميكية المعتمدة على الحمض النووي الريبي بما في ذلك النسخ والترجمة26،27،28،29،30،31،32. وقد سمح استخدام الملاقط البصرية التحقيق في التفاعلات الجزيئية، وهياكل الحمض النووي، والخصائص الحرارية، والحركية، وحيوية من هذه العمليات بالتفصيل16،17،22،33،34،35،36،37،38،39 . ويستند المقايسة ملاقط البصرية على الفخ من الأجسام المجهرية مع شعاع ليزر مركزة. في تجربة OT النموذجية ، يرتبط جزيء الاهتمام بين حبتين شفافتين (عادة البوليسترين) (الشكل 1A)27. ثم يتم القبض على هذه الخرز من قبل الفخاخ البصرية، والتي تتصرف مثل الينابيع. وهكذا، يمكن حساب القوة المطبقة على الجزيء على أساس إزاحة الخرزة من مركز شعاع الليزر المركز (مركز الفخ). في الآونة الأخيرة، تم الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر الكونفوج (الشكل 1B)، مما مكن من الفلورسينس أو Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) القياسات40،41،42. وهذا يفتح مجالا جديدا كليا للتجارب الممكنة التي تسمح بالقياس المتزامن، وبالتالي الارتباط الدقيق لبيانات التحليل الطيفي للقوة والفلورسينس.
هنا، ونحن نظهر التجارب باستخدام ملاقط بصرية جنبا إلى جنب مع المجهر confocal لدراسة التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي تنظيم تحويل الإطارات المترجمة. بين الهدف والمكثف، خلية تدفق مع خمس قنوات تمكن التطبيق عينة مستمرة مع تدفق صفح. من خلال قنوات microfluidic ، يمكن حقن مكونات مختلفة مباشرة ، مما يقلل من الوقت العملي بالإضافة إلى السماح باستهلاك عينة قليلة جدا طوال التجربة.
أولا ، يقترح مبدأ توجيهي أساسي للمساعدة في تصميم تجارب OT ويتم مناقشة مزايا وكذلك مزالق الأجهزة المختلفة. بعد ذلك، يتم وصف إعداد العينات وسير العمل التجريبي، ويتم توفير بروتوكول لتحليل البيانات. لتمثيل مثال على ذلك، نوضح النتائج التي تم الحصول عليها من تجارب تمديد الحمض النووي الريبي لدراسة عنصر الحمض النووي الريبي المتحول من سارس-CoV-2 (الشكل 2A) مع عامل المفعول العابر للنمط القصير من البروتين المضاد للفيروسات بأصابع الزنك (ZAP)، والذي يغير ترجمة الحمض النووي الريبي الفيروسي من إطار قراءة بديل43. بالإضافة إلى ذلك، فإنه ثبت أن الريبوسومات ذات العلامات الفلورية يمكن استخدامها في هذا الفحص الكونفوجال OT، والتي من شأنها أن تكون مفيدة لرصد عملية وسرعة آلات الترجمة. يمكن استخدام الطريقة المعروضة هنا لاختبار تأثير المخازن المؤقتة المختلفة أو الليجاند أو المكونات الخلوية الأخرى بسرعة لدراسة جوانب مختلفة من الترجمة. وأخيرا، تتم مناقشة المزالق التجريبية الشائعة وكيفية استكشافها وإصلاحها. فيما يلي بعض النقاط الحاسمة في التصميم التجريبي موضحة.
تصميم البناء من حيث المبدأ ، هناك نهجان مشتركان لإنشاء بناء الحمض النووي الريبي المتوافق مع OT. يستخدم النهج الأول جزيء الحمض النووي الريبي الطويل الذي يتم تهجينه مع مقابض الحمض النووي التكميلية ، مما يؤدي إلى بناء يتكون من منطقتين هجينتين من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي يحيطان بتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي التقطعت به السبل في الوسط (الشكل 2B). ويستخدم هذا النهج في معظم التجارب OT الجيش الملكي النيبالي33,44,45.
النهج الثاني يستفيد من مقابض dsDNA مع قصيرة (حوالي 20 NT) يتدلى15,17. ثم يتم تهجين هذه المعلقات مع جزيء الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن أكثر تعقيدا في التصميم، واستخدام مقابض dsDNA يتغلب على بعض القيود المفروضة على الحمض النووي / الجيش الملكي النيبالي الهجين النظام. من حيث المبدأ ، حتى مقابض طويلة جدا (>10kb) يمكن تنفيذها ، وهو أكثر ملاءمة لقياسات confocal. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ربط جزيء الحمض النووي الريبي بمقابض الحمض النووي لزيادة استقرار الحبل.
استراتيجية وضع العلامات النهائية يجب ربط البناء بالخرز عن طريق تفاعل جزيئي قوي. في حين أن هناك نهج متاحة للترابط التكافؤي للمقابض إلى الخرز46 ، فإن التفاعلات القوية ولكن غير التكافؤية مثل streptavidin-biotin و digoxigenin-antibody تستخدم عادة في تجارب OT15،33،35،45. في البروتوكول الموصوف ، يتم تسمية البناء بالبيوتين أو الديجوكسيجينين ، والخرز مغلف بالستريبتافيدين أو الأجسام المضادة ضد الديجوكسيجينين ، على التوالي (الشكل 1A). وسيكون هذا النهج مناسبا لتطبيق القوات التي تصل إلى حوالي 60 pN (لكل حبل)47. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مختلف استراتيجيات وضع العلامات 5 و 3 'تسمح بتحديد اتجاه الحبل شكلت بين الخرز17.
وضع العلامات على البروتين لقياسات الفلورسينس للتصوير الكونفوكوكال، هناك العديد من النهج الشائعة الاستخدام لعلامات الفلورسينس. على سبيل المثال، يمكن ربط الفلوروفوريس بشكل مشترك ببقايا الأحماض الأمينية الموجودة أصلا في البروتينات أو التي يتم إدخالها عن طريق تكوين الطفرات الموجه من الموقع من خلال مجموعة عضوية تفاعلية. يمكن استخدام الأصباغ الثيول أو أمين التفاعلية لتسمية بقايا السيستين واليسين، على التوالي. هناك العديد من طرق الحماية القابلة للعكس لزيادة خصوصية وضع العلامات48,49 ، ولكن عادة ما يتم تصنيف البروتينات الأصلية على بقايا متعددة. على الرغم من أن صغر حجم الفلوروفور قد يمنح ميزة، إلا أن وضع العلامات غير المحددة قد يتعارض مع نشاط البروتين وبالتالي قد تختلف كثافة الإشارة49. أيضا، اعتمادا على كثافة إشارة كفاءة وضع العلامات قد تختلف بين التجارب المختلفة. لذلك، يجب إجراء فحص نشاط قبل التجربة.
في حالة أن البروتين من الفائدة يحتوي على علامة N- أو C-المحطة الطرفية، مثل له العلامة أو بكتيريا العلامة، وسم محددة من هذه العلامات يمثل نهجا آخر شعبية. وعلاوة على ذلك، فإن وضع العلامات المستهدفة يقلل من فرصة تدخل الفلوروفور في نشاط البروتين ويمكن أن يعزز قابلية الذوبان49. ومع ذلك، فإن وضع العلامات الخاصة بالعلامة عادة ما ينتج بروتينات أحادية الفلوروفورية، والتي قد يكون من الصعب اكتشافها. ويمكن تحقيق طريقة أخرى للوسم محددة من خلال استخدام الأجسام المضادة.
إعداد الموائع الدقيقة مزيج من OT مع نظام microfluidics يسمح الانتقال السريع بين الظروف التجريبية المختلفة. وعلاوة على ذلك، تستفيد الأنظمة الحالية من الحفاظ على تدفق صفح داخل خلية التدفق، مما يحول دون خلط السوائل من قنوات أخرى في الاتجاه العامودي بالنسبة لاتجاه التدفق. لذلك ، فإن تدفق صفح مفيد بشكل خاص للتصميم التجريبي. حاليا، يتم استخدام خلايا التدفق مع ما يصل إلى 5 قنوات عادة (الشكل 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

يعتمد الجيش الملكي النيبالي طيات هيكلية متنوعة ، والتي تعتبر ضرورية لوظائفه وبالتالي يمكن أن تؤثر على العمليات المتنوعة في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل بنية ووظيفة الحمض النووي الريبي من خلال عوامل مختلفة عابرة للمفعول ، مثل البروتينات أو الأيض أو الحمض النووي الريبي الآخر. فجزيئات الحمض النووي الريبي المتحولة الإطارية، على سبيل المثال، هي RNAs تنظيمية تقع في مناطق الترميز، والتي تترجم الريبوسومات مباشرة إلى إطار قراءة مفتوح بديل، وبالتالي تعمل كمفاتيح جين. كما أنها قد تعتمد طيات مختلفة بعد ربط البروتينات أو غيرها من العوامل العابرة. لتشريح دور البروتينات الملزمة للجيش الملكي النيبالي في الترجمة وكيفية تعديل هيكل واستقرار الحمض النووي الريبي ، من الأهمية بمكان دراسة التفاعل والسمات الميكانيكية لهذه المجمعات بروتين الحمض النووي الريبي في وقت واحد. يوضح هذا العمل كيفية استخدام ملاقط بصرية مقترنة بجزيء واحد لاستكشاف المناظر الطبيعية التوافقية والديناميكية الحرارية لمجمعات بروتين الحمض النووي الريبي بدقة عالية. وكمثال على ذلك، يتم تفصيل تفاعل عنصر نقل الإطارات الريبوسومية المبرمجة سارس-CoV-2 مع العامل العابر للمفعول القصير isoform من البروتين المضاد للفيروسات بإصبع الزنك. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد الريبوسومات ذات العلامات الفلورية باستخدام الوحدة الكونفوكوكال، التي ستمكن في نهاية المطاف من دراسة استطالة الترجمة. يمكن تطبيق المقايسة الفلورية المقترنة OT على نطاق واسع لاستكشاف مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي المتنوعة أو العوامل العابرة للمفعول التي تنظم الترجمة ويمكن أن تسهل دراسات تنظيم الجينات القائم على الحمض النووي الريبي.

في هذا القسم، يتم التركيز بشكل رئيسي على قياسات التفاعلات بين الحمض النووي الريبي وبروتين/ليغاند بواسطة الملاقط البصرية الفلورية. للحصول على وصف لتجارب ملاقط RNA البصرية العامة والنتائج التمثيلية المقابلة ، انظر32. لمزيد من التفاصيل حول التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والب?...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

يقدم هذا البروتوكول سير عمل تجريبي كامل لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الملاقط البصرية. يتم تحديد العديد من الاجهزة التجريبية المحتملة بما في ذلك الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر confocal.

ملاقط بصرية لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين في تنظيم الترجمة

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

الهدف العام للمادة الطريقة التالية هو إظهار بروتوكول مفيد لدراسة التفاعلات الحمض النووي الريبي مع البروتينات أو عوامل أخرى باستخدام ملاقط بصرية مقرونة المجهر confocal. وعلى مدى العقد الماضي، تم تطوير عدة تقنيات متطورة للتحقيق في خصائص الجزيئات الكبيرة المفردة. واحدة من هذه التقنيات هي ملاقط بصرية جزيء واحد.مع الملقط الضوئي الجديد بمساعدة الفلورسينس ، لا يمكن مراقبة القوات المطلوبة فقط للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي ، وكذلك الأحداث الملزمة أثناء الترجمة بالتفصيل. هنا نركز على القياسات التي تمتد جزيئات الحمض النووي الريبي مع وبدون التعامل مع العوامل التي تنظم الترجمة. كما نوضح كيف يمكن تطبيق هذه التقنية لمراقبة الترجمة باستخدام الريبوسومات المسماة.سيتم عرض البروتوكول من قبل اثنين من طلاب الدراسات العليا في مجموعتي، لوكاس بيكاريك وستيفان بارك. في هذا الفيديو، سوف نرشدك خلال إعداد وتنفيذ تجربة ملاقط بصرية. كما نحدد سير عمل تحليل البيانات البسيط.وميزة هذه التقنية هي أنها واضحة وقوية. يتم ربط جزيء بين حبتين ، مربوطة في تركيز أشعة الليزر ، ويمكن قياس التغيير والقوة عند الإزاحة بدقة في ما يسمى بتجارب منحدر القوة. الهياكل الثانوية داخل الحبل تتكشف في قوة معينة اعتمادا على الطاقة الداخلية للجزيء.ويمكن إجراء مزيد من البحث في هذا الانتقال الدينامي بين هياكل متعددة من خلال قياسات القوة الثابتة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الاستخدام الموازي للتصوير الفلوري لتصور الأحداث الملزمة في الوقت الحقيقي. قد يختلف ملف تعريف مسافة القوة المتميز للربط بعد ربط عوامل التعامل المحتملة التي تؤثر على استقراره.أولا، يجب استنساخ الحمض النووي الريبي ذي الأهمية إلى ناقل الحمض النووي. المنبع والمصب من هذا التسلسل، وهناك حاجة إلى أجزاء إضافية، ومقابض لربط بناء الحمض النووي الحمض النووي الحمض النووي النهائي بين الخرز. وبعد نجاح استنساخ البلازميد وتضخيمه، تجرى ثلاثة ردود فعل مختلفة ل PCR.لكل تفاعل PCR، اخلط الكواشف وفقا للجدول الأول في البروتوكول. تشغيل PCR في 50 ميكرولتر aliquots في دورة الحرارية المناسبة. أول واحد يؤدي إلى الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل من بناء كله مع المروج T7 للنسخ اللاحقة في المختبر.ينتج PCR الثاني مقابض رئيسية خمسة. في حين أن نتائج رد الفعل الأخير في مقابض رئيس الوزراء الثلاثة. كل من رئيس الوزراء 5 و 3 مقابض رئيس الوزراء تحتاج إلى أن تكون وصفت وفقا للخرز المستخدمة.يتم تسمية المقابض الرئيسية الثلاثة أثناء PCR باستخدام التمهيدي العكسي المسمى digoxigenin ، ويجب تسمية المقابض الرئيسية الخمسة في خطوة إضافية من خلال البيوتينيل. يتم تنفيذ البيوتينيل ثلاثية رئيس الوزراء من مقابض رئيس الوزراء الخمسة باستخدام T 40 والبوليميراز. يتم إجراء رد الفعل لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك ، نفذ النسخ في المختبر باستخدام T7 polymerase. احتضان رد الفعل في 37 درجة لمدة ساعتين إلى أربع ساعات، اعتمادا على طول الحمض النووي الريبي. في خطوة أخيرة ، يتم إعادة مقابض مع الجيش الملكي النيبالي من النسخ في المختبر للحصول على بناء الحمض النووي والحمض النووي الريبي النهائي مع منطقة واحدة تقطعت بهم السبل من الفائدة بين مقابض تقطعت بهم السبل مزدوجة.لعلة الهجين الحمض النووي الريبي المطلوب، مزيج مقابض والجيش الملكي النيبالي في العازلة الصلبة. الحرارة، خليط الصلب تصل إلى 85 درجة لمدة 10 دقائق، ومن ثم تبرد ببطء أسفل العينة إلى أربع درجات. مزيج عينة مع 1/10th من حجم ثلاثة خلات الصوديوم الضرس، وثلاثة مجلدات من الإيثانول الجليد الباردة واحتضان ناقص 80 درجة لمدة ساعة على الأقل.طرد العينات في 15، 000 xg لمدة 30 دقيقة في أربع درجات. تجاهل supernatant وتجفيف بيليه تحت فراغ. يتم تجميد aliquots صغيرة من بيليه resuspended في النيتروجين السائل وأبقى في ناقص 80 درجة حتى يتم استخدامها.أولا إزالة التبييض من المحاقن وملء مل واحد من المياه الحرة RNase. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 ثيوسلفات الصوديوم الضرس وغسل النظام مع شريط واحد. كن حذرا من أن النظام microfluidic لا يجف لتجنب فقاعات الهواء في النظام.بعد ذلك ، تجاهل محلول ثيوسلفيت الصوديوم المتبقي واستبدال المحاقن بأخرى جديدة. ثم يغسل مرة أخرى مع ما لا يقل عن 0.5 مل من المياه الحرة RNase. لإعداد النظام البصري للآلة، وضع قطرتين من زيت الغمر على الهدف.وضع الخلية تدفق في مكان وارتفاع الهدف حتى السائل يمس الخلية تدفق. ثم وضع قطرتين من زيت الغمر على رأس الخلية تدفق. الآن بدوره على فخ وحدة التوجيه والليزر محاصرة.يتم تعديل الهدف باستخدام أداة الباحث Z من الكاميرات التشخيصية للجهاز. عن طريق تحويل المسمار الصغير، يتم ضبط محور Z إلى منتصف الغرفة بين الانعكاس الثاني والثالث. حيث حلقات الانكسار هي الأكبر.قم بتبديل كاميرات التشخيص إلى وضع القمر وقلل من الليزر المحاصر إلى حوالي 50٪ ثم خفض المكثف وضبط موضعه حتى ترى ما يقرب من 10 نطاقات ضوئية. تحتوي غرفة القياس على خمس قنوات ، وقبل التجربة ، يجب النظر في إمكانيات إعداد مختلفة. لتجربة بسيطة قوة المنحدر ، والخرز العازلة الخرز هو ترتيب قناة مريحة.بالنسبة للقياسات مع المركب الرابع ، مثل الريبوسومات الفلورية أو عوامل التعامل ، فإن عامل الخرز والخرز العازل هو ترتيب أفضل ، ولكنه يجعل من الصعب التقاط الخرز. يتم احتضان aliquot من بناء مصقول مع تعليق حبة AD ثلاثة ميكرولتر، واحد مثبطات RNase ميكرولتر، وثمانية ميكرولتر من المخزن المؤقت المقايسة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ثم يتم تخفيف العينة في 500 ميكرولتر المقايسة العازلة ووضعها في القناة المعنية.بالنسبة للنوع الثاني من الخرز ، يتم خلط 0.8 ميكرولتر من حبات المقايسة مع مل واحد من المخزن المؤقت للمقايسة ويتم إدارته في القناة المقابلة. يتم فتح القنوات وغسلها بضغط منخفض. الآن تشغيل الليزر محاصرة.للقبض على الخرز ، يتم نقل أشعة الليزر بعيدا عن بعضها البعض ويتم القبض على حبة الزخرف الإعلاني في فخ واحد. بعد ذلك يتم نقل المرحلة إلى قناة حبة SA ويتم القبض على حبة في الفخ الثاني. لتجنب فقدان الخرز، أو للقبض على ثانية واحدة في نفس الفخ، يتم نقل المرحلة إلى قناة المخزن المؤقت ويتم إغلاق جميع القنوات.في المخزن المؤقت، يتم تنفيذ معايرة اعتراض. يجب تعيين الخرز اشتعلت كنماذج مرئية للقياسات اللاحقة. وينبغي أن تبقى درجة التشابه فوق 90٪ بين القياسات لضمان المقارنة.وأخيرا، يتم نقل الخرز أقرب معا، ويمكن للمرء أن يبدأ للقبض على حبل واحد. ويتم ذلك نقل الخرز إغلاق لبضع ثوان ثم يغادر ببطء الخرز مرة أخرى. تشكيل الحبل يؤدي إلى زيادة القوة المقاسة عند سحب الخرزين بعيدا عن بعضها البعض.يمكن التحقق من عدد ونوعية الحبال من خلال العثور على هضبة التمدد الزائد ومقارنة المسار مع السلسلة المشتركة بحرية أو نموذج السلسلة الشبيه بالديدان. يجب أن تكون الهضبة فوق التمدد بين 50 إلى 60 piconewton الحبال واحدة. لإجراء قياسات الفلورسينس، قم بتشغيل الليزر البؤري وعدد الفوتونات على وحدة وآلة ملاقط بصرية.بعد ذلك، قم بتشغيل ليزر الإثارة من الطول الموجي المطلوب وواجهة البرنامج وتعيين قوة الليزر إلى 5٪ أو أعلى، اعتمادا على الفلوروفور. الآن يمكن أن يبدأ التصوير باستخدام وظائف الصورة أو kymograph من البرنامج. من أجل الحصول على صور مركزة بشكل جيد ، تأكد من أن الطائرة المحورية للمجهر confocal والفخاخ البصرية يتم محاذاتها.لهذا الغرض، يمكن استخدام autofluorescence من حبات البوليسترين في قناة الليزر الأزرق. تحرك صعودا وهبوطا مع المستوى البؤري للفخاخ البصرية حتى يصل الفلورة التلقائية للخرزات إلى أعلى قطر لها. في هذا الموقف، يمكن الكشف عن إشارات الفلورسينس التي تحدث في جزيء المربوطة.ومن المهم بالنسبة لكلا الوظيفتين اختيار المناطق المناسبة ذات الاهتمام. يمكن تغيير تكوين المخزن المؤقت للقياس بسهولة إما عن طريق نقل الخرز إلى قنوات مختلفة ، أو عن طريق تغيير المخزن المؤقت المقدم في النظام microfluidic. لتجنب الbleaching الضوئي، دائما إيقاف الليزر الإثارة عند عدم قياس.غالبا ما يحتوي إخراج البيانات الخام من الجهاز على الكثير من الضوضاء. لذلك ، من أجل مواصلة تحليل البيانات المتناثرة ، يجب على المرء أولا معالجتها مسبقا. الخطوة الأولى هي إلى أسفل عينة وتصفية البيانات مع تمريرة منخفضة بتروورث مرشح، تم الحصول على نتائج جيدة.بالنسبة لتجارب منحدر القوة ، يجب وضع علامة على الأحداث التي تتكشف في المناطق المقابلة المطوية والمتكشفت من منحنى المسافة الأولى يمكن تركيبها باستخدام سلسلة تشبه الدودة أو نماذج سلسلة مشتركة بحرية. بالنسبة لبيانات القوة الثابتة، يمكن رسم المسافة مع مرور الوقت ومن المفيد إنشاء مخطط بياني لتحديد الشكل السائد في قوة معينة. هنا يظهر أن معلمات التصفية حاسمة للتمييز بين حالات قابلة للطي المختلفة.لفهم أفضل ما يمكن تحقيقه مع هذه التقنية، وتظهر بعض النتائج التمثيلية. هكذا يبدو منحنى المسافة القياسية للقوة من تجربة منحدر القوة. في هذه الحالة، درسنا عنصر تحويل إطار السارس-كورونا-2.لاحظنا تتكشف في خطوات متعددة حول 15 piconewton. عندما يتم عكس الاتجاه والخرز تقترب مرة أخرى، الحبل يطوي مرة أخرى في قوة أقل قليلا. عندما قمنا بقياس نفس الحمض النووي الريبي في وجود بروتين ZAP المضاد للفيروسات بإصبع الزنك ، لوحظ نمط مماثل من التكشف.ولكن الهيكل الثانوي للجيش الملكي النيبالي لم يطوي من قبل. هذا هو مثال جيد لإظهار ما تأثير كبير ربط البروتين يمكن أن يكون على الحركية الجيش الملكي النيبالي. وبالنظر إلى بيانات القوة الثابتة، يمكن إجراء مزيد من التحقيق في الحركيات الآخذة في التكشف.يتم رسم المسافة مع مرور الوقت لقوى مختلفة ويتم إضافة الرسم البياني للدول المختلفة الملاحظة على اليمين. في 10 piconewton، والجيش الملكي النيبالي هو تماما في حالة مطوية. في 11.5 piconewton فإنه يتحول بين الدول، وفي 13 piconewton الجيش الملكي النيبالي هو بشكل دائم في حالة تتكشف.ومع ذلك ، عندما تم قياس عنصر تحول إطار السارس كورونا -2 جنبا إلى جنب مع ZAP ، كان الجيش الملكي النيبالي تماما في حالة تتكشف في 11 piconewton ، وحتى أظهرت القليل جدا من الانتقال نحو حالة مطوية في 10 piconewton. يشير هذا إلى أن ZAP يربط إلى عنصر تحويل إطار واحد تقطعت بهم السبل ويمنع تشكيل بنية ثانوية. وأخيرا، سننظر في بعض بيانات الملاقط البصرية إلى جانب المجهر البؤري.في هذه التجربة، تم استخدام صبغة فلورية تسميات الأحماض النووية التي تقطعت بها السبل مزدوجة، على وجه التحديد مع زيادة القوة. تظهر الكيموغراف أنه مع انتقال الخرز بعيدا عن بعضها البعض ، تزداد كثافة الفلورسينس وتختفي تماما بمجرد أن يتم تمديد الحبل أكثر من اللازم وفواصله. في الشكل الأخير تمت إضافة الريبوسومات المسماة فلوريا من خلال القناة الرابعة.في هذه التجربة لوحظ ربط الريبوسوم محددة إلى الحبل الجيش الملكي النيبالي. نأمل أن يكون هذا الفيديو قد أعطاك نظرة ثاقبة على الملاقط البصرية وما يمكن القيام به هذه التقنية المذهلة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

الببتيدات اختراق الخلية بيوتينيلاتيد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين داخل الخلايا

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...