Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

我们感谢Anuja Kibe和Jun. Prof. Redmond Smyth对手稿的批判性审查。我们感谢塔季扬娜·科赫的专家技术援助。我们感谢Kristyna Pekarkova帮助录制实验视频。我们实验室的工作得到了亥姆霍兹协会的支持，并得到了欧洲研究理事会（ERC）Grant Nr. 948636（到NC）的资助。

1. 样品制备
<ol><li>将感兴趣的序列克隆到含有Lambda DNA片段的载体中，这些载体用作手柄序列（图2）43，50。</li>
	<li>首先生成DNA模板，用于随后通过PCR 进行体外 转录（图2B;反应1）。在此PCR步骤中，T7启动子被添加到感测DNA分子的5'末端32，33<sup...

在这里，我们展示了使用荧光耦合光学镊子来研究RNA分子与各种配体的相互作用和动态行为。下面，将讨论当前技术的关键步骤和局限性。
协议中的关键步骤 与许多其他方法一样，样品的质量对于获得可靠数据至关重要。因此，为了获得尽可能高质量的样品，值得花时间优化样品制备的程序。优化步骤包括正确的引物设计、退火温度、RNA 和蛋白质纯化步骤。<...

通过mRNA将遗传信息从DNA传递到蛋白质是一个复杂的生化过程，通过细胞内的大分子相互作用在各个层面上进行精确调节。对于翻译调控，RNA-蛋白相互作用赋予了对各种刺激和信号快速反应的关键作用1，2。一些RNA-蛋白质相互作用会影响mRNA的稳定性，从而改变RNA翻译活性的时间。其他RNA-蛋白质相互作用与重新编码机制有关，例如停止密码子读通，旁路或程序化核糖体移码（PRF）3，4，5，6，7。最近，许多RNA结合蛋白（RMP）已被证明与刺激性mRNA元件和翻译机制相互作用，以决定何时以及在细胞中发生多少重新编码7，8，9，10，11。因此，为了剖析RNA结合蛋白在翻译中的作用以及它们如何调节RNA结构和稳定性，详细研究这些RNA-蛋白复合物的相互作用原理和力学性质至关重要。
数十年的工作为研究翻译的多步骤和多组分过程奠定了基础，该过程依赖于翻译机器的RNA和蛋白质组分之间的复杂通信来实现速度和准确性12，13，14。理解复杂调节事件的关键下一步是在高精度平移过程中确定力、时间尺度和结构决定因素12，15，16，17。单分子工具的出现进一步阐明了RNA构象动力学的研究，特别是反式辅助因子在翻译过程中如何作用于RNA结构，这些工具的出现进一步阐明了16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26.
光学镊子（OT）代表了一种高度精确的单分子技术，已被应用于研究多种RNA依赖性动态过程，包括转录和翻译26，27，28，29，30，31，32。光学镊子的使用允许详细探测这些过程的分子相互作用，核酸结构以及热力学性质，动力学和能量学16，17，22，33，34，35，36，37，38，39.光学镊子测定基于用聚焦激光束捕获微观物体。在典型的OT实验中，感兴趣的分子被拴在两个透明（通常是聚苯乙烯）珠子之间（图1A）27。然后，这些珠子被光学陷阱捕获，其行为类似于弹簧。因此，施加在分子上的力可以基于磁珠从聚焦激光束中心（陷阱中心）的位移来计算。最近，光学镊子与共聚焦显微镜相结合（图1B），可实现荧光或Förster共振能量转移（FRET）测量40，41，42。这开辟了一个全新的可能实验领域，允许同时测量，从而精确地将力光谱和荧光数据联系起来。
在这里，我们展示了使用光学镊子结合共聚焦显微镜的实验，以研究调节翻译移帧的蛋白质 - RNA相互作用。在物镜和冷凝器之间，具有五个通道的流通池可实现层流连续的样品应用。通过微流体通道，可以直接注射各种组分，这减少了动手时间，并且在整个实验过程中允许非常少的样品消耗。
首先，提出了辅助OT实验设计的基本指南，并讨论了各种设置的优点和缺点。接下来，描述了样品的制备和实验工作流程，并提供了数据分析方案。为了代表一个例子，我们概述了从RNA拉伸实验中获得的结果，以研究SARS-CoV-2移码RNA元件（图2A）， 其反式因子锌指抗病毒蛋白（ZAP）的短同种型改变了病毒RNA从替代阅读框架的翻译43。此外，还证明荧光标记的核糖体可用于这种OT共聚焦测定，这对于监测翻译机制的处理能力和速度是有用的。这里介绍的方法可用于快速测试不同缓冲液，配体或其他细胞组分的作用，以研究翻译的各个方面。最后，讨论了常见的实验陷阱以及如何排除故障。下面，概述了实验设计中的一些关键点。
施工设计 原则上，有两种常见的方法来创建OT兼容的RNA构建体。第一种方法采用长RNA分子，该分子与互补的DNA手柄杂交，从而产生由两个RNA / DNA杂交区域组成的构建体，中间是单链RNA序列的两侧（图2B）。大多数OT RNA实验都采用了这种方法33，44，45。
第二种方法利用具有短悬伸（约20 nt）的dsDNA句柄15，17。然后将这些悬垂与RNA分子杂交。虽然设计上更复杂，但dsDNA手柄的使用克服了DNA/RNA杂交系统的一些局限性。原则上，即使是非常长的手柄（>10kb）也可以实现，这对于共聚焦测量更方便。此外，RNA分子可以连接到DNA手柄上，以提高系留稳定性。
最终标签策略 该结构必须通过强分子相互作用拴附到珠子上。虽然有一些方法可用于手柄与珠子的共价键合46，但强但非共价的相互作用，如链霉亲和素 - 生物素和地高辛 - 抗体通常用于OT实验15，33，35，45。在所描述的方案中，构建体用生物素或地高丝宁标记，并且珠子分别涂有链霉亲和素或针对地高辛的抗体（图1A）。这种方法适用于施加高达约60 pN（每系绳）的力47。此外，使用不同的5'和3'标记策略可以确定珠子之间形成的系绳的方向17。
用于荧光测量的蛋白质标记 对于共聚焦成像，有几种常用的荧光标记方法。例如，荧光团可以共价附着在蛋白质中的氨基酸残基上，或者通过反应性有机基团通过位点导向诱变引入。硫醇或胺反应性染料可分别用于半胱氨酸和赖氨酸残基的标记。有几种可逆的保护方法可以增加标记的特异性48，49，但是天然蛋白质通常会在多个残基处标记。虽然荧光团的小尺寸可能带来优势，但非特异性标记可能会干扰蛋白质活性，因此信号强度可能会变化49。此外，根据标记效率的不同，不同实验之间的信号强度可能会有所不同。因此，应在实验之前执行活动检查。
如果感兴趣的蛋白质含有N端或C端标签，例如His标签或链球菌标签，则这些标签的特定标记代表了另一种流行的方法。此外，标签靶向标记可降低荧光团干扰蛋白质活性的机会，并可提高溶解度49。然而，标签特异性标记通常产生单荧光团标记的蛋白质，这可能很难检测。另一种特异性标记方法可以通过使用抗体来完成。
微流体设置 OT与微流体系统的结合允许在不同的实验条件之间快速过渡。此外，电流系统利用了维持流通池内部的层流，这排除了相对于流动方向的垂直方向上来自其他通道的液体的混合。因此，层流对于实验设计特别有利。目前，通常使用多达5个通道的流通池（图3）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA采用不同的结构褶皱，这对其功能至关重要，因此可以影响细胞中的不同过程。此外，RNA的结构和功能可以通过各种 反式作用因子（例如蛋白质，代谢物或其他RNA）来调节。例如，移码RNA分子是位于编码区域的调节RNA，它们直接将核糖体翻译成替代的开放阅读框，从而充当基因开关。在与蛋白质或其他 反式因子结合后，它们也可能采用不同的褶皱。为了剖析RNA结合蛋白在翻译中的作用以及它们如何调节RNA结构和稳定性，同时研究这些RNA-蛋白复合物的相互作用和力学特征至关重要。这项工作说明了如何利用单分子荧光耦合光学镊子以高分辨率探索RNA-蛋白质复合物的构象和热力学景观。例如，详细阐述了SARS-CoV-2程序性核糖体移码元件与锌指抗病毒蛋白 的反式作用因子短同种型的相互作用。此外，使用共聚焦单元监测荧光标记的核糖体，这最终将实现翻译伸长率的研究。荧光偶联OT测定可广泛用于探索各种RNA-蛋白复合物或调节翻译的 跨作用因子，并有助于研究基于RNA的基因调控。

在本节中，重点主要放在荧光光学镊子对RNA-蛋白质/配体相互作用的测量上。有关一般RNA光学镊子实验的描述和相应的代表性结果，请参见32。有关RNA / DNA - 蛋白质相互作用的更详细讨论，另见1，2，26，59，60。
原则上，RBP或任何其他 <e...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

该协议为使用光学镊子研究RNA-蛋白质相互作用提供了完整的实验工作流程。概述了几种可能的实验设置，包括光学镊子与共聚焦显微镜的组合。

光学镊子研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

以下方法文章的总体目标是展示一种方案，该方案可用于使用光学镊子结合共聚焦显微镜研究RNA与蛋白质或其他因子的相互作用。在过去的十年中，已经开发了几种复杂的技术来研究单个大分子的性质。其中一种技术是单分子光学镊子。使用新的荧光辅助光学镊子，不仅可以详细监测RNA分子展开所需的力以及翻译过程中的结合事件。在这里，我们专注于RNA分子在有和没有调节翻译的交易因子的情况下被拉伸的测量。我们还说明了如何将该技术应用于使用标记的核糖体监测翻译。该协议将由我小组中的两名研究生Lukas Pekarek和Stefan Park演示。在本视频中，我们将指导您完成光学镊子实验的设置和执行。我们还概述了简单的数据分析工作流程。这种技术的优点是它简单而强大。分子被拴在两个珠子之间，绑在激光束的焦点中，在所谓的力斜坡实验中可以精确地测量位移时的变化和力。系绳内部的二级结构根据分子的内部能量以一定的力展开。多个结构之间的这种动态转变可以通过恒力测量进一步研究。此外，荧光成像的并行使用可用于实时可视化结合事件。在绑定影响其稳定性的潜在交易因素后，系绳的不同力-距离分布可能会有所不同。首先，必须将感兴趣的RNA克隆到DNA载体中。该序列的上游和下游，需要额外的部分，手柄来将最终的DNA-RNA构建体拴在珠子之间。在质粒成功克隆和扩增后，进行三种不同的PCR反应。对于每个PCR反应，根据方案中的表一混合试剂。在适当的热循环仪中以50微升等分试样运行PCR。第一个导致整个构建体的双链DNA与T7启动子，用于随后的体外转录。第二个PCR产生五个质控手柄。而最后的反应导致三个素数手柄。5 个定焦手柄和 3 个定焦手柄都需要根据使用的珠子进行标记。在PCR期间，使用标记的地高辛反向引物标记三个质代手柄，并且必须通过生物素化在额外的步骤中标记五个质控手柄。使用T 40和聚合酶进行五个质性手柄的三个质数生物素化。反应在室温下进行一至两小时。接下来，使用T7聚合酶进行体外转录。根据RNA的长度，在37度下孵育反应两到四个小时。在最后一步中，用体外转录的RNA退火手柄，以获得具有双链手柄之间单链目标区域的最终DNA-RNA构建体。要退火所需的RNA-DNA杂交种，请在退火缓冲液中混合手柄和RNA。加热，将混合物退火至85度持续10分钟，然后缓慢冷却至样品4度。将退火样品与体积的1/10的三摩尔乙酸钠和三体积的冰冷乙醇混合，并在零下80度下孵育至少一小时。将样品以15， 000 xg在四度下离心30分钟。弃去上清液并在真空下干燥沉淀。重悬沉淀的小等分试样在液氮中冷冻并保持在零下80度，直到使用。首先从注射器中取出漂白剂，并填充一毫升不含RNase的水。加入50微升0.5摩尔硫代硫酸钠，并用一巴洗涤系统。请注意，微流体系统永远不会干涸，以避免系统中出现气泡。接下来，丢弃剩余的硫代硫酸钠溶液，并用新的注射器替换注射器。然后用至少0.5毫升RNase游离水再次洗涤。要设置机器的光学系统，请将两滴浸油滴到物镜上。将流通池放置到位并升起物镜，直到液体接触到流通池。然后将两滴浸油滴在流通池的顶部。现在打开陷阱转向装置和陷阱激光器。使用机器诊断摄像头的Z形查找器工具调整物镜。通过转动微型螺钉，Z轴被调整到第二和第三反射之间的腔室中间。其中折射环最大。将诊断摄像头切换到月球模式，将捕获激光降低到50%左右，然后降低聚光镜并调整其位置，以便您看到大约10个光带。测量室有五个通道，在实验之前，应考虑不同的设置可能性。对于简单的力斜坡实验，磁珠-缓冲-磁珠是一种方便的通道排列。对于第四种化合物的测量，如荧光核糖体或交易因子，珠子 - 珠子 - 缓冲因子是更好的排列，但它使捕获珠子变得更加困难。将等分试样与3微升AD珠悬浮液，1微升RNase抑制剂和8微升测定缓冲液在室温下孵育10至20分钟。然后将样品稀释在500微升测定缓冲液中并放入相应的通道中。对于第二种微球，将0.8微升测定微球与一mL测定缓冲液混合并施用到相应的通道中。通道打开并用低压清洗。现在打开陷印激光。为了捕捉珠子，激光器彼此分开移动，AD珠子被捕获在陷阱中。接下来，阶段被移动到SA珠道，珠子被困在陷阱二中。为了避免丢失磁珠，或在同一陷阱中捕获第二个磁珠，将载物台移动到缓冲通道并关闭所有通道。在缓冲液中，执行陷阱校准。捕获的珠子应设置为可视模板，以便后续测量。并且测量之间的相似性分数应保持在90%以上，以保证可比性。最后，珠子靠得更近，人们可以开始捕捉一根绳子。这是将珠子关闭几秒钟，然后再次缓慢离开珠子。系绳形成导致在将两颗珠子彼此拉开时测量的力增加。通过找到过度拉伸的平台，并将轨迹与自由连接的链条或蠕虫状链模型进行比较，可以检查系绳的数量和质量。对于单个系绳，过度拉伸的高原应在50至60皮波尼顿之间。要进行荧光测量，请打开单元和光学镊子机上的共聚焦激光器和光子计数。之后，打开所需波长的激发激光器和软件界面，根据荧光团将激光器的功率设置为5%或更高。现在，可以使用软件的图像或运动记录仪功能启动成像。为了获得聚焦良好的图像，请确保共聚焦显微镜和光学陷阱的焦平面对齐。为此，可以采用蓝色激光通道中聚苯乙烯微球的自发荧光。随着光学陷阱的焦平面上下移动，直到磁珠的自发荧光达到其最高直径。在这个位置，可以检测到在系留分子处发生的荧光信号。对于这两个功能，选择适当的感兴趣区域非常重要。在整个测量过程中，可以通过将微珠移动到不同的通道或通过改变微流体系统中提供的缓冲液来轻松更改缓冲液组合物。为避免光漂白，在未测量时始终关闭激发激光。器件输出的原始数据通常包含大量噪声。因此，为了进一步分析分散的数据，首先必须对其进行预处理。第一步是用低通巴特沃斯滤波对数据进行下采样和滤波，得到良好的结果。对于力斜坡实验，必须在第一距离曲线的相应折叠和展开区域标记展开事件，可以使用蠕虫状链或自由连接链模型进行拟合。对于恒定力数据，可以绘制随时间变化的距离，并且生成直方图以量化给定力下的主要构象非常有用。这里表明，滤波器参数对于区分不同的折叠状态至关重要。为了更好地理解使用这种技术可以实现的目标，显示了一些具有代表性的结果。这就是力斜坡实验的标准力-距离曲线的样子。在这种情况下，我们研究了SARS-coronavirus-2帧移位元件。我们观察到在15皮波顿附近以多个步骤展开。当方向反转并且珠子再次靠近时，系绳会以略低的力重新折返。当我们在锌指抗病毒蛋白ZAP的存在下测量相同的RNA时，观察到类似的展开模式。但RNA的二级结构没有重新折叠。这是一个很好的例子，可以说明蛋白质结合对RNA动力学有多大影响。查看恒定力数据，可以进一步研究展开的动力学。绘制不同力随时间变化的距离，并在右侧添加不同观测状态的直方图。在10皮牛顿时，RNA完全处于折叠状态。在11.5皮波顿时，它在状态之间切换，而在13皮波顿时，RNA永久处于未折叠状态。然而，当SARS-冠状病毒-2帧移位元件与ZAP一起测量时，RNA在11皮波顿时完全处于展开状态，甚至在10皮波顿时向折叠状态过渡很少。这表明ZAP与单股框架移位元件结合并阻止了二级结构的形成。最后，我们将看看一些光学镊子数据以及共聚焦显微镜。在该实验中，使用荧光染料标记双链核酸，而不是特异性地以增加的力。运动记录仪显示，当珠子彼此分开移动时，荧光强度增加，一旦系绳拉伸过度并断裂，它就会完全消失。在最后一张图中，荧光标记的核糖体通过第四通道加入。在该实验中观察到特异性核糖体与RNA系绳的结合。我们希望这个视频能让您深入了解光学镊子以及这种令人难以置信的技术可以执行什么。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

从细胞使用寡核苷酸定向洗脱同源RNA-蛋白质复合物的隔离

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

科研

生物化学

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

荧光各向异性作为一种工具来研究蛋白质相互作用

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

定量荧光测量全球本地化翻译

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

化细胞穿透肽研究胞内蛋白-蛋白质相互作用

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

核糖体剖面对芽殖酵母中翻译的全基因组定量

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

应用三色单分子焦虑研究蛋白质相互作用的相关性

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

线虫线虫中乳酸和丙酮酸细胞的小尺度比色测定

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

淀粉样蛋白纤维蛋白的相互作用和脑线粒体的膜渗透

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

在Vivo羟基基蛋白足迹研究卡诺哈布迪特人的蛋白质相互作用

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...