Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Vi takker Anuja Kibe og Jun. Prof. Redmond Smyth for kritisk gennemgang af manuskriptet. Vi takker Tatyana Koch for teknisk ekspertbistand. Vi takker Kristyna Pekarkova for hjælpen til at optage eksperimentelle videoer. Arbejdet i vores laboratorium er støttet af Helmholtz Association og finansiering fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) Grant Nr. 948636 (til NC).

1. Prøveforberedelse
<ol><li>Klon sekvensen af interesse i vektoren, der indeholder Lambda DNA-fragmenter, der tjener som håndtag sekvenser (Figur 2)43,50.</li>
	<li>Først generere en DNA-skabelon til efterfølgende in vitro transskription via PCR (Figur 2B; reaktion 1). På dette PCR-trin tilsættes T7-promotoren i 5' slutningen af forstand-DNA-molekylet32,33,43,50.<sup cl...

Her demonstrerer vi brugen af fluorescens-koblede optiske pincet til at studere interaktioner og dynamisk adfærd af RNA-molekyler med forskellige ligands. Nedenfor diskuteres kritiske trin og begrænsninger af den nuværende teknik.
Kritiske trin i protokollen Som for mange andre metoder, kvaliteten af prøven er afgørende for at opnå pålidelige data. For at opnå de højest mulige kvalitetsprøver er det derfor værd at bruge tid på at optimere proceduren for prøvefo...

Overførsel af genetisk information fra DNA til proteiner gennem mRNAs er en kompleks biokemisk proces, som er præcist reguleret på alle niveauer gennem makromolekylære interaktioner inde i celler. For translationel regulering giver RNA-proteininteraktioner en afgørende rolle for hurtigt at reagere på forskellige stimuli og signaler1,2. Nogle RNA-proteininteraktioner påvirker mRNA-stabiliteten og ændrer dermed det tidspunkt, hvor et RNA er translationelt aktivt. Andre RNA-protein interaktioner er forbundet med reoding mekanismer såsom stop-codon gennemlæsning, omgåelse, eller programmeret ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. For nylig har en række RNA-bindende proteiner (RBPs) vist sig at interagere med stimulerende mRNA-elementer og oversættelsesmaskineriet for at diktere, hvornår og hvor meget omkodning der vil forekomme i cellen7,8,9,10,11. For at dissekere RNA-bindende proteiners rolle i oversættelsen, og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det afgørende at studere interaktionsprincipperne og de mekaniske egenskaber af disse RNA-proteinkomplekser i detaljer.
Årtiers arbejde har lagt grunden til at studere multi-trins og multi-komponent proces oversættelse, som er afhængig af indviklet kommunikation mellem RNA og protein komponenter i oversættelsen maskiner til at opnå hastighed og nøjagtighed12,13,14. Et afgørende næste skridt i forståelsen af komplekse lovgivningsmæssige begivenheder er at bestemme de kræfter, tidshorisonter og strukturelle determinanter under oversættelse med høj præcision12,15,16,17. Undersøgelsen af RNA-kropsbygningsdynamikken og især hvordan transvirkende hjælpefaktorer virker på RNA-strukturen under oversættelsen, er blevet yderligere belyst af fremkomsten af enkeltmolekyleværktøjer, herunder optiske pincet eller nultilstandsbølgeguider16,17,18,19,20,21,22,23,24 25,26.
Optisk pincet (OT) repræsenterer en meget præcis enkeltmolekyle teknik, som er blevet anvendt til at studere mange former for RNA-afhængige dynamiske processer, herunder transskription, og oversættelse26,27,28,29,30,31,32. Brugen af optiske pincet har gjort det muligt sondering af molekylære interaktioner, nukleinsyre strukturer, og termodynamiske egenskaber, kinetika, og energiske af disse processer i detaljer16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pincet assay er baseret på fastklemning af mikroskopiske objekter med en fokuseret laserstråle. I et typisk OT-eksperiment bindes interessemolekylet mellem to gennemsigtige (normalt polystyren) perler (figur 1A)27. Disse perler fanges derefter af optiske fælder, der opfører sig som fjedre. Således kan den kraft, der påføres molekylet, beregnes baseret på perlens forskydning fra midten af den fokuserede laserstråle (trap center). For nylig er optiske pincet blevet kombineret med konfokal mikroskopi (Figur 1B), hvilket muliggør fluorescens eller Förster resonans energioverførsel (FRET) målinger40,41,42. Dette åbner et helt nyt felt af mulige eksperimenter, der muliggør samtidig måling og dermed præcis korrelation mellem kraftspektroskopi og fluorescensdata.
Her demonstrerer vi eksperimenter ved hjælp af de optiske pincet kombineret med konfokal mikroskopi til at studere protein-RNA interaktioner, der regulerer translationel frameshifting. Mellem målet og kondensatoren muliggør en flowcelle med fem kanaler kontinuerlig prøveudbringning med laminarflow. Gennem de mikrofluidiske kanaler kan forskellige komponenter injiceres direkte, hvilket reducerer hands-on-tiden samt tillader meget lidt prøveforbrug i hele eksperimentet.
For det første foreslås en grundlæggende retningslinje for at hjælpe med udformningen af OT-eksperimenter, og fordele samt faldgruber ved forskellige opsætninger diskuteres. Dernæst beskrives forberedelsen af prøver og eksperimentelle arbejdsgange, og der leveres en protokol til dataanalysen. For at repræsentere et eksempel skitserer vi resultaterne fra RNA-strækforsøg for at studere SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet (figur 2A) med den transvirkende faktor den korte isoform af zinkfinger antiviralt protein (ZAP), som ændrer oversættelsen af det virale RNA fra en alternativ læseramme43. Derudover påvises det, at fluorescensmærkede ribosomer kan anvendes i denne OT-konfokale analyse, hvilket ville være nyttigt at overvåge oversættelsesmaskinernes processivitet og hastighed. Den metode, der præsenteres her, kan bruges til hurtigt at teste effekten af forskellige buffere, ligands eller andre cellulære komponenter for at studere forskellige aspekter af oversættelse. Endelig diskuteres almindelige eksperimentelle faldgruber, og hvordan man foretager fejlfinding af dem. Nedenfor er nogle afgørende punkter i eksperimentelt design skitseret.
Konstruktion design I princippet er der to fælles tilgange til at skabe en OT-kompatibel RNA-konstruktion. Den første tilgang anvender et langt RNA-molekyle, der er hybridiseret med komplementære DNA-håndtag, hvilket giver en konstruktion bestående af to RNA / DNA hybrid regioner flankerer en enkeltstrenget RNA-sekvens i midten (Figur 2B). Denne tilgang anvendes i de fleste OT RNA eksperimenter33,44,45.
Den anden tilgang udnytter dsDNA håndtag med korte (ca. 20 nt) udhæng15,17. Disse udhæng hybridiseres derefter med RNA-molekylet. Selvom brugen af dsDNA-håndtag er mere kompliceret i design, overvinder det nogle af begrænsningerne i DNA/RNA-hybridsystemet. I princippet kan selv meget lange håndtag (>10kb) implementeres, hvilket er mere bekvemt for konfokale målinger. Derudover kan RNA-molekylet nedtones til DNA-håndtag for at øge tetherstabiliteten.
Strategi for slutmærkning Konstruktionen skal bindes til perler via en stærk molekylær interaktion. Mens der er tilgange til rådighed for kovalent limning af håndtag til perler46, stærke, men ikke-kovalente interaktioner såsom streptavidin-biotin og digoxigenin-antistof er almindeligt anvendt i OT eksperimenter15,33,35,45. I den beskrevne protokol er konstruktionen mærket med henholdsvis biotin eller digoxigenin, og perlerne er belagt med henholdsvis streptavidin eller antistoffer mod digoxigenin (figur 1A). Denne fremgangsmåde vil være egnet til at anvende kræfter op til ca. 60 pN (pr. tether)47. Desuden gør brugen af forskellige 5' og 3'-mærkningsstrategier det muligt at bestemme retningen af tether dannet mellem perlerne17.
Proteinmærkning til fluorescensmålinger For confocal billeddannelse, der er flere almindeligt anvendte tilgange til fluorescens mærkning. For eksempel kan fluorophorer være kovalent fastgjort til aminosyrerester, der findes indbygget i proteiner eller introduceres af stedrettet mutagenese gennem en reaktiv organisk gruppe. Thiol eller amine-reaktive farvestoffer kan bruges til mærkning af henholdsvis cystein- og lysinrester. Der er flere reversible beskyttelsesmetoder til at øge specificiteten af mærkning48,49, men indfødte proteiner vil typisk blive mærket ved flere rester. Selv om fluorophorens lille størrelse kan give en fordel, kan ikke-specifik mærkning forstyrre proteinaktiviteten, og signalintensiteten kan derfor variere49. Afhængigt af mærkningseffektivitetssignalintensiteten kan der også være forskel på forskellige eksperimenter. Derfor bør der udføres en aktivitetskontrol forud for eksperimentet.
Hvis proteinet af interesse indeholder en N- eller C-terminal tag, såsom en His-tag eller STREP-tag, specifikke mærkning af disse tags repræsenterer en anden populær tilgang. Desuden reducerer tag-målrettet mærkning risikoen for, at fluorophoren forstyrrer proteinaktiviteten, og kan forbedre opløseligheden49. Men tag-specifikke mærkning normalt giver mono-fluorophore mærket proteiner, som kan være udfordrende at opdage. En anden måde at specifik mærkning kan opnås ved at anvende antistoffer.
Opsætning af mikrofluidics Kombinationen af OT med et mikrofluidics system giver mulighed for en hurtig overgang mellem forskellige eksperimentelle forhold. Desuden udnytter de nuværende systemer at opretholde laminarstrømmen inde i strømningscellen, hvilket udelukker blanding af væsker fra andre kanaler i vinkelret retning i forhold til strømningsretningen. Derfor er laminar flow særligt fordelagtigt for det eksperimentelle design. I øjeblikket er flowceller med op til 5 kanaler almindeligt anvendt (figur 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA vedtager forskellige strukturelle folder, som er afgørende for dets funktioner og dermed kan påvirke forskellige processer i cellen. Derudover kan strukturen og funktionen af et RNA moduleres af forskellige transvirkende faktorer, såsom proteiner, metabolitter eller andre RNA'er. Frameshifting RNA molekyler, for eksempel, er regulatoriske RNA'er placeret i kodning regioner, som direkte oversætte ribosomer i en alternativ åben læseramme, og dermed fungere som gen switche. De kan også vedtage forskellige folder efter binding til proteiner eller andre transfaktorer. For at dissekere RNA-bindende proteiners rolle i oversættelsen, og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det afgørende at studere samspillet og de mekaniske træk ved disse RNA-proteinkomplekser samtidigt. Dette arbejde illustrerer, hvordan man anvender enkelt-molekyle-fluorescens-koblet optisk pincet til at udforske det kropslige og termodynamiske landskab af RNA-protein komplekser ved en høj opløsning. Som et eksempel er samspillet mellem sars-CoV-2 programmeret ribosomale frameshifting element med trans-virkende faktor kort isoform af zink-finger antivirale protein uddybes. Derudover blev fluorescensmærkede ribosomer overvåget ved hjælp af den konfokale enhed, hvilket i sidste ende ville gøre det muligt at studere oversættelsesforlængelse. Fluorescens koblet OT assay kan anvendes bredt til at udforske forskellige RNA-protein komplekser eller trans-virkende faktorer, der regulerer oversættelse og kunne lette undersøgelser af RNA-baserede genregulering.

I dette afsnit fokuseres der hovedsageligt på målinger af RNA-protein/ligandinteraktioner foretaget af fluorescens optiske pincet. For en beskrivelse af generelle RNA optiske pincet eksperimenter og tilsvarende repræsentative resultater, se32. For mere detaljeret diskussion af RNA / DNA-protein interaktioner, også se1,2,26,59,60.</p...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Denne protokol præsenterer en komplet eksperimentel arbejdsgang til undersøgelse af RNA-proteininteraktioner ved hjælp af optiske pincet. Flere mulige eksperimentelle opsætninger er skitseret, herunder kombinationen af optiske pincet med konfokal mikroskopi.

Optiske pincet til at studere RNA-Protein interaktioner i oversættelse forordning

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Det overordnede mål med følgende metodeartikel er at demonstrere en protokol, der er nyttig til at studere RNA-interaktioner med proteiner eller andre faktorer ved hjælp af optiske pincet kombineret med konfokal mikroskopi. I løbet af det sidste årti er der udviklet flere sofistikerede teknikker til at undersøge egenskaberne af enkelte makromolekyler. En af disse teknikker er enkelt molekyle optisk pincet.Med den nye fluorescens assisteret optisk pincet, ikke kun kræfter, der kræves for udfoldelse af RNA molekyler, samt bindende begivenheder under oversættelsen kan overvåges i detaljer. Her fokuserer vi på målinger, hvor RNA-molekyler strækkes med og uden at udføre faktorer, der regulerer oversættelse. Vi illustrerer også, hvordan teknikken kan anvendes til at overvåge oversættelse ved hjælp af mærkede ribosomer.Protokollen vil blive demonstreret af to kandidatstuderende i min gruppe, Lukas Pekarek og Stefan Park. I denne video vil vi guide dig gennem opsætning og udførelse af et optisk pincet eksperiment. Vi skitserer også den enkle arbejdsgang for dataanalyse.Fordelen ved denne teknik er, at den er ligetil og robust. Et molekyle er bundet mellem to perler, spændt i fokus af laserstråler, og forandring og kraft ved forskydning kan måles præcist i såkaldte kraft-rampe eksperimenter. Sekundære strukturer inde i et tøjre udfolder sig ved en bestemt kraft afhængigt af molekylets indre energi.Denne dynamiske overgang mellem flere strukturer kan undersøges yderligere med konstante kraftmålinger. Desuden kan den parallelle brug af fluorescerende billeddannelse bruges til at visualisere bindende begivenheder i realtid. En særskilt kraftafstandsprofil for et tøjre kan variere efter binding af potentielle gennemførelsesfaktorer, der påvirker dets stabilitet.For det første skal RNA'et af interesse klones til en DNA-vektor. Opstrøms og nedstrøms af denne sekvens, yderligere dele, håndtagene er nødvendige for at binde den endelige DNA-RNA konstruktion mellem perlerne. Efter vellykket kloning og forstærkning af plasmiden udføres tre forskellige PCR-reaktioner.For hver PCR-reaktion blandes reagenserne i henhold til tabel et i protokollen. Kør PCR i 50 mikroliter aliquots i en passende termisk cycler. Den første resulterer i en dobbelt strandet DNA af hele konstruktionen med T7 promotor for efterfølgende in-vitro transskription.Den anden PCR producerer de fem primære håndtag. Mens den sidste reaktion resulterer i de tre primære håndtag. Både 5 prime og 3 prime håndtag skal mærkes i henhold til de anvendte perler.De tre primære håndtag er mærket under PCR ved hjælp af en digoxigenin mærket omvendt primer, og de fem primære håndtag skal mærkes i et ekstra trin gennem biotinylation. De tre primære biotinylation af de fem primære håndtag udføres ved hjælp af T 40 og en polymerase. Reaktionen udføres i en til to timer ved stuetemperatur.Udfør derefter in-vitro transskriptionen ved hjælp af T7 polymerase. Inkuber reaktionen ved 37 grader i to til fire timer, afhængigt af længden af RNA. I et sidste trin er håndtagene udglødet med RNA fra in-vitro transskription for at opnå den endelige DNA-RNA konstruktion med den enkelte strandede region af interesse mellem de dobbelte strandede håndtag.For at udgløde den ønskede RNA-DNA hybrid blandes håndtagene og RNA'en i udglødningsbufferen. Varme, udglødning blandingen op til 85 grader i 10 minutter, og derefter langsomt køle ned prøven til fire grader. Bland den udgløde prøve med 1/10th af volumen af tre molar natriumacetat, og tre mængder af iskold ethanol og inkubere minus 80 grader i mindst en time.Centrifugere prøverne ved 15.000 xg i 30 minutter ved fire grader. Kassér supernatanten og tør pelleten under vakuum. Små aliquots af den genophængte pellet fryses i flydende nitrogen og holdes på minus 80 grader, indtil de anvendes.Fjern først blegemidlet ud af sprøjterne og udfyld et mL RNasefrit vand. Tilsæt 50 mikroliter af 0,5 molar natrium thiosulat og vask systemet med en bar. Pas på, at det mikrofluidiske system aldrig løber tør for at undgå luftbobler i systemet.Kassér derefter den resterende natrium thiosulatopløsning og udskift sprøjterne med nye. Vask derefter igen med mindst 0,5 mL RNasefrit vand. For at oprette maskinens optiske system skal du sætte to dråber nedsænkningsolie på målet.Sæt flowcellen på plads og optær målet, indtil væsken rører flowcellen. Sæt derefter to dråber nedsænkningsolie oven på flowcellen. Tænd nu fældestyringsenheden og diffuseringslaseren.Målet justeres ved hjælp af Z finderværktøjet på maskinens diagnostiske kameraer. Ved at dreje mikroskruen justeres Z-aksen til midten af kammeret mellem den anden og den tredje refleksion. Hvor brydningsringene er de største.Skift de diagnostiske kameraer til månetilstand, og reducer diffuseringslaseren til omkring 50%Sænk derefter kondensatoren, og juster dens position, så du ser ca. 10 lysbånd. Målekammeret har fem kanaler, og før eksperimentet bør der tages hensyn til forskellige opsætningsmuligheder. For en simpel kraft-rampe eksperiment, perler-buffer-perler er en bekvem kanal arrangement.Til målinger med den fjerde forbindelse, som fluorescerende ribosomer eller transacting faktorer, perler-perler-buffer faktor er et bedre arrangement, men det gør det sværere at fange perler. En aliquot af den udgløde konstruktion inkuberes med tre mikroliter AD perle suspension, en mikroliter RNase hæmmere, og otte mikroliter af analysen buffer ved stuetemperatur i 10 til 20 minutter. Derefter fortyndes prøven i 500 mikroliter assay buffer og sættes i den respektive kanal.For den anden slags perler, 0,8 mikroliter af assay perler blandes med en ML af assay buffer og administreres i den tilsvarende kanal. Kanalerne åbnes og vaskes med lavt tryk. Tænd nu fældefangstlaseren.For at fange perler flyttes laserne adskilt fra hinanden, og en AD perle fanges i fælde et. Næste fase flyttes til SA perle kanal og en perle er fanget i fælde to. For at undgå at miste perlerne, eller for at fange en anden i samme fælde, flyttes scenen til bufferkanalen, og alle kanaler lukkes.I bufferen udføres en fældekalibrering. De fangede perler skal indstilles som visuelle skabeloner til efterfølgende målinger. Og lighedsscoren bør holdes over 90% mellem målingerne for at sikre sammenlignelighed.Endelig flyttes perlerne tættere sammen, og man kan begynde at fange en enkelt tether. Dette gøres for at flytte perlerne tæt i et par sekunder og derefter langsomt forlade perlerne igen. En tetherdannelse resulterer i en stigning i målt kraft ved at trække de to perler væk fra hinanden.Antallet og kvaliteten af tethers kan kontrolleres ved at finde overstretching plateau og sammenligne bane med frit led kæde eller orm-lignende kæde model. Den overbelastede plateau bør være mellem 50 til 60 piconewton for en enkelt tether. For at udføre fluorescensmålingerne skal du tænde for de konfokale lasere og fotontællingen på enheds- og optisk pincetmaskine.Derefter tænde excitation laser af ønskede bølgelængde og software interface og indstille kraften i laser til 5% eller højere, afhængigt af fluorophore. Nu billedbehandling kan startes ved hjælp af billedet eller kymograf funktioner i softwaren. For at få velfokuserede billeder skal du sørge for, at det konfokale mikroskops brændplan og de optiske fælder er justeret.Til dette formål kan der anvendes autofluorescence af polystyrenperlerne i den blå laserkanal. Flyt op og ned med brændplan af de optiske fælder, indtil autofluorescence af perlerne når sin højeste diameter. På denne position kan fluorescenssignalerne, der finder sted ved det tøjrede molekyle, detekteres.For begge funktioner er det vigtigt at vælge de relevante regioner af interesse. Hele målingen buffer sammensætning kan nemt ændres ved enten at flytte perlerne til forskellige kanaler, eller ved at ændre bufferen leveres i det mikrofluidiske system. For at undgå fotografering skal du altid slukke for excitationslaseren, når den ikke måler.Den rå data output fra enheden indeholder ofte en masse støj. For yderligere at analysere spredte data skal man derfor først forbehandle dem. Det første skridt er at ned prøve og filtrere data med lav pass Butterworth filter, gode resultater blev opnået.For force-ramp eksperimenter, de udfoldende begivenheder skal mærkes på de tilsvarende foldede og udfoldede regioner i den første afstand kurve kan monteres ved hjælp af orm-lignende kæde eller frit jointed kæde modeller. For de konstante kraftdata kan afstanden over tid afbildes, og det er nyttigt at generere et histogrammer for at kvantificere den fremherskende kropsbygning ved en given kraft. Her er det vist, at filterparametrene er afgørende for at skelne mellem forskellige foldetilstande.For bedre at forstå, hvad der kan opnås med denne teknik, vises nogle repræsentative resultater. Sådan ser en standard kraftafstandskurve fra et kraftrampeeksperiment ud. I dette tilfælde studerede vi SARS-coronavirus-2 rammeskifteelementet.Vi observerede udfolde sig i flere trin omkring 15 piconewton. Når retningen er vendt, og perlerne kommer tættere igen, foldes tetheren tilbage ved lidt lavere kraft. Da vi målte det samme RNA i nærværelse af zinkfinger antivirale protein ZAP, et lignende mønster af udfoldelse blev observeret.Men RNA's sekundære struktur blev ikke genindlæst. Dette er et godt eksempel på at vise, hvilken stor indflydelse proteinbinding kan have på RNA kinetika. Ser man på konstant kraft data udfolder kinetika kan undersøges yderligere.Afstanden over tid er plottet for forskellige kræfter, og histogrammet af de forskellige observerede tilstande tilføjes til højre. På 10 piconewton er RNA helt i foldet tilstand. På 11,5 piconewton det skifter mellem stater, og på 13 piconewton RNA er permanent i en udfoldet tilstand.Men da SARS-coronavirus-2-rammeskifteelementet blev målt sammen med ZAP, var RNA helt i en udfoldet tilstand på 11 piconewton og viste endda meget lidt overgang til en foldet tilstand på 10 piconewton. Dette indikerer, at ZAP binder sig til det enkelte strandede rammeskiftelement og forhindrer dannelsen af en sekundær struktur. Endelig vil vi se på nogle optiske pincet data kombineret med konfokal mikroskopi.I dette eksperiment blev der anvendt et fluorescerende farvestof, der mærker dobbeltstrengede nukleinsyrer, ikke specifikt med stigende kraft. Kymografen viser, at når perlerne flyttes adskilt fra hinanden, øges fluorescensintensiteten, og den forsvinder helt, når tether er strakt for meget og går i stykker. I det sidste tal fluorescerende mærket ribosomer blev tilføjet gennem kanal fire.I dette forsøg blev der observeret specifik ribosombinding til RNA-tether. Vi håber, at denne video gav dig et indblik i optisk pincet, og hvad der kan udføres denne utrolige teknik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering af sammenhørende RNA-protein-komplekser fra celler under anvendelse Oligonucleotid-rettet Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens Anisotropi som værktøj til at studere protein-protein interaktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitative immunofluorescens foranstaltning globale lokaliseret Oversættelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gennemtrængende peptider til at studere intracellulær Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

I Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet af proteininteraktioner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...