Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

We bedanken Anuja Kibe en Jun. Prof. Redmond Smyth voor het kritisch beoordelen van het manuscript. Wij danken Tatyana Koch voor de deskundige technische bijstand. We bedanken Kristyna Pekarkova voor de hulp bij het opnemen van experimentele video's. Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door de Helmholtz Association en financiering van de European Research Council (ERC) Grant Nr. 948636 (to NC).

1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Kloon de interessante sequentie in de vector met de Lambda DNA-fragmenten, die dienen als de handvatsequenties (figuur 2)43,50.</li>
	<li>Genereer eerst een DNA-sjabloon voor daaropvolgende in vitro transcriptie via PCR (figuur 2B; reactie 1). Bij deze PCR-stap wordt de T7-promotor toegevoegd aan het 5'-uiteinde van het zintuig DNA-molecuul32,33...

Hier demonstreren we het gebruik van fluorescentie-gekoppelde optische pincetten om interacties en dynamisch gedrag van RNA-moleculen met verschillende liganden te bestuderen. Hieronder worden kritische stappen en beperkingen van de huidige techniek besproken.
Kritieke stappen in het protocol Zoals voor veel andere methoden is de kwaliteit van het monster van cruciaal belang om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Daarom, om monsters van de hoogst mogelijke kwaliteit te verk...

Overdracht van genetische informatie van DNA naar eiwitten via mRNA's is een complex biochemisch proces, dat op alle niveaus nauwkeurig wordt gereguleerd door macromoleculaire interacties in cellen. Voor translationele regulatie spelen RNA-eiwitinteracties een cruciale rol om snel te reageren op verschillende stimuli en signalen1,2. Sommige RNA-eiwitinteracties beïnvloeden de mRNA-stabiliteit en veranderen daardoor de tijd dat een RNA translatief actief is. Andere RNA-eiwitinteracties zijn geassocieerd met hercoderingsmechanismen zoals stop-codon readthrough, bypassing of geprogrammeerde ribosomale frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Onlangs is aangetoond dat een aantal RNA-bindende eiwitten (RBP's) interageren met stimulerende mRNA-elementen en de translatiemachinerie om te bepalen wanneer en hoeveel hercodering in de cel zal plaatsvinden7,8,9,10,11. Dus, om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om de interactieprincipes en mechanische eigenschappen van deze RNA-eiwitcomplexen in detail te bestuderen.
Tientallen jaren werk hebben de basis gelegd voor het bestuderen van het meerstaps- en meercomponentenproces van vertaling, dat afhankelijk is van ingewikkelde communicatie tussen het RNA en eiwitcomponenten van de vertaalmachinerie om snelheid en nauwkeurigheid te bereiken12,13,14. Een cruciale volgende stap in het begrijpen van complexe regulerende gebeurtenissen is het bepalen van de krachten, tijdschalen en structurele determinanten tijdens translatie met hoge precisie12,15,16,17. De studie van RNA-conformatiedynamica en vooral hoe trans-acterende hulpfactoren tijdens translatie op de RNA-structuur inwerken, is verder verlicht door de opkomst van hulpmiddelen met één molecuul, waaronder optische pincetten of nulmodusgolfgeleiders16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optische pincetten (OT) vertegenwoordigen een zeer nauwkeurige single-molecule techniek, die is toegepast om vele soorten RNA-afhankelijke dynamische processen te bestuderen, waaronder transcriptie, en translatie26,27,28,29,30,31,32. Het gebruik van een optisch pincet heeft het mogelijk gemaakt om moleculaire interacties, nucleïnezuurstructuren en thermodynamische eigenschappen, kinetiek en energetica van deze processen in detail te onderzoeken16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optische pincet assay is gebaseerd op de beknelling van microscopische objecten met een gerichte laserstraal. In een typisch OT-experiment wordt het betreffende molecuul vastgebonden tussen twee transparante (meestal polystyreen) kralen (figuur 1A)27. Deze kralen worden vervolgens gevangen door optische vallen, die zich gedragen als veren. De kracht die op het molecuul wordt uitgeoefend, kan dus worden berekend op basis van de verplaatsing van de kraal uit het midden van de gerichte laserstraal (valcentrum). Onlangs is een optisch pincet gecombineerd met confocale microscopie (figuur 1B), waardoor fluorescentie- of Förster resonantie-energieoverdracht (FRET)-metingen40,41,42 mogelijk zijn. Dit opent een heel nieuw veld van mogelijke experimenten die gelijktijdige meting en dus nauwkeurige correlatie van krachtspectroscopie en fluorescentiegegevens mogelijk maken.
Hier demonstreren we experimenten met behulp van het optische pincet in combinatie met confocale microscopie om eiwit-RNA-interacties te bestuderen die translationele frameshifting reguleren. Tussen het objectief en de condensor maakt een stroomcel met vijf kanalen een continue monstertoepassing met laminaire stroming mogelijk. Via de microfluïdische kanalen kunnen verschillende componenten direct worden geïnjecteerd, wat de hands-on tijd vermindert en zeer weinig monsterverbruik tijdens het experiment mogelijk maakt.
Eerst wordt een basisrichtlijn voorgesteld om het ontwerp van OT-experimenten te ondersteunen en worden voordelen en valkuilen van verschillende opstellingen besproken. Vervolgens wordt de voorbereiding van monsters en experimentele workflows beschreven en wordt een protocol voor de data-analyse verstrekt. Om een voorbeeld te geven, schetsen we de resultaten verkregen van RNA-stretching-experimenten om het SARS-CoV-2 frameshifting RNA-element (figuur 2A) te bestuderen met de trans-acterende factor de korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit (ZAP), dat de vertaling van het virale RNA van een alternatief leesframe verandert43. Bovendien is aangetoond dat fluorescentie-gelabelde ribosomen kunnen worden gebruikt in deze OT confocale assay, wat nuttig zou zijn om de processiviteit en snelheid van de vertaalmachinerie te controleren. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om snel het effect van verschillende buffers, liganden of andere cellulaire componenten te testen om verschillende aspecten van translatie te bestuderen. Tot slot worden veelvoorkomende experimentele valkuilen besproken en hoe deze op te lossen. Hieronder worden enkele cruciale punten in experimenteel ontwerp geschetst.
Ontwerp construeren In principe zijn er twee gangbare benaderingen om een OT-compatibel RNA-construct te maken. De eerste benadering maakt gebruik van een lang RNA-molecuul dat is gehybridiseerd met complementaire DNA-handvatten, waardoor een construct ontstaat dat bestaat uit twee RNA / DNA-hybride regio's die een enkelstrengs RNA-sequentie in het midden flankeren (figuur 2B). Deze aanpak wordt gebruikt in de meeste OT RNA-experimenten33,44,45.
De tweede benadering maakt gebruik van dsDNA-handgrepen met korte (ongeveer 20 nt) overhangen15,17. Deze overhangen worden vervolgens gehybridiseerd met het RNA-molecuul. Hoewel ingewikkelder in ontwerp, overwint het gebruik van dsDNA-handles enkele beperkingen van het DNA / RNA-hybride systeem. In principe kunnen zelfs zeer lange handgrepen (>10kb) worden geïmplementeerd, wat handiger is voor confocale metingen. Bovendien kan het RNA-molecuul worden geligeerd aan DNA-handvatten om de stabiliteit van de tether te vergroten.
End-labeling strategie Het construct moet via een sterke moleculaire interactie aan kralen worden vastgemaakt. Hoewel er benaderingen beschikbaar zijn voor covalente binding van handvatten aan kralen46, worden sterke maar niet-covalente interacties zoals streptavidin-biotine en digoxigenine-antilichaam vaak gebruikt in OT-experimenten15,33,35,45. In het beschreven protocol wordt het construct gelabeld met biotine of digoxigenine en zijn de kralen gecoat met respectievelijk streptavidin of antilichamen tegen digoxigenine (figuur 1A). Deze aanpak zou geschikt zijn voor het toepassen van krachten tot ongeveer 60 pN (per tether)47. Bovendien maakt het gebruik van verschillende 5'- en 3'-etiketteringsstrategieën het mogelijk om de oriëntatie van de tussen de kralen gevormde ketting te bepalen17.
Eiwitetikettering voor fluorescentiemetingen Voor de confocale beeldvorming zijn er verschillende veelgebruikte benaderingen voor fluorescentie-etikettering. Fluoroforen kunnen bijvoorbeeld covalent worden gehecht aan aminozuurresiduen die inheems in eiwitten worden aangetroffen of door plaatsgerichte mutagenese via een reactieve organische groep worden geïntroduceerd. Thiol of amine-reactieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het etiketteren van respectievelijk cysteïne- en lysineresiduen. Er zijn verschillende omkeerbare beschermingsmethoden om de specificiteit van etikettering te vergroten48,49, maar inheemse eiwitten worden meestal gelabeld op meerdere residuen. Hoewel de kleine omvang van de fluorofoor een voordeel kan bieden, kan niet-specifieke etikettering de eiwitactiviteit verstoren en dus de signaalintensiteit variëren49. Afhankelijk van de etikettering kan de intensiteit van het efficiëntiesignaal ook verschillen tussen verschillende experimenten. Daarom moet voorafgaand aan het experiment een activiteitencontrole worden uitgevoerd.
In het geval dat het eiwit van belang een N- of C-terminale tag bevat, zoals een His-tag of streptokokkentag, vertegenwoordigt specifieke etikettering van deze tags een andere populaire benadering. Bovendien vermindert tag-gerichte etikettering de kans dat de fluorofoor de eiwitactiviteit verstoort en kan de oplosbaarheid verbeteren49. Tag-specifieke etikettering levert echter meestal mono-fluorofoor gelabelde eiwitten op, die een uitdaging kunnen zijn om te detecteren. Een andere manier van specifieke etikettering kan worden bereikt door antilichamen te gebruiken.
Microfluïdica-installatie De combinatie van OT met een microfluïdicasysteem maakt een snelle overgang tussen verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Bovendien maken de huidige systemen gebruik van het behoud van de laminaire stroming in de stroomcel, waardoor het mengen van vloeistoffen uit andere kanalen in de loodrechte richting ten opzichte van de stroomrichting wordt uitgesloten. Daarom is laminaire stroming bijzonder voordelig voor het experimentele ontwerp. Momenteel worden vaak flowcellen met maximaal 5 kanalen gebruikt (figuur 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA neemt verschillende structurele plooien aan, die essentieel zijn voor zijn functies en daardoor verschillende processen in de cel kunnen beïnvloeden. Bovendien kan de structuur en functie van een RNA worden gemoduleerd door verschillende trans-acterende factoren, zoals eiwitten, metabolieten of andere RNA's. Frameshifting RNA-moleculen zijn bijvoorbeeld regulerende RNA's in coderende regio's, die het vertalen van ribosomen naar een alternatief open leeskader sturen en daardoor fungeren als genschakelaars. Ze kunnen ook verschillende plooien aannemen na binding aan eiwitten of andere transfactoren. Om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om het samenspel en de mechanische kenmerken van deze RNA-eiwitcomplexen tegelijkertijd te bestuderen. Dit werk illustreert hoe single-molecule-fluorescentie-gekoppelde optische pincetten kunnen worden gebruikt om het conformationele en thermodynamische landschap van RNA-eiwitcomplexen met een hoge resolutie te verkennen. Als voorbeeld wordt de interactie van het SARS-CoV-2 geprogrammeerde ribosomale frameshifting element met de trans-acterende factor korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit uitgewerkt. Bovendien werden fluorescentie-gelabelde ribosomen gecontroleerd met behulp van de confocale eenheid, die uiteindelijk de studie van translatie-elongatie mogelijk zou maken. De fluorescentie gekoppelde OT-test kan op grote schaal worden toegepast om diverse RNA-eiwitcomplexen of trans-acterende factoren die de translatie reguleren te onderzoeken en zou studies van op RNA gebaseerde genregulatie kunnen vergemakkelijken.

In deze sectie wordt voornamelijk aandacht besteed aan metingen van RNA-eiwit/ligand interacties door het fluorescentie optische pincet. Voor een beschrijving van algemene RNA optische pincet experimenten en bijbehorende representatieve resultaten, zie32. Voor meer gedetailleerde bespreking van de RNA/DNA-eiwit interacties, zie ook1,2,26,59,60.<sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Het algemene doel van het volgende methodeartikel is om een protocol aan te tonen dat nuttig is om RNA-interacties met eiwitten of andere factoren te bestuderen met behulp van optische pincetten in combinatie met confocale microscopie. In het afgelopen decennium zijn verschillende geavanceerde technieken ontwikkeld om de eigenschappen van afzonderlijke macromoleculen te onderzoeken. Een van deze technieken is een enkel molecuul optisch pincet.Met het nieuwe fluorescentieondersteunde optische pincet kunnen niet alleen de krachten die nodig zijn voor het ontvouwen van RNA-moleculen, maar ook bindingsgebeurtenissen tijdens de translatie in detail worden gevolgd. Hier richten we ons op metingen waarbij RNA-moleculen worden uitgerekt met en zonder transactiefactoren die de translatie reguleren. We illustreren ook hoe de techniek kan worden toegepast om de vertaling te controleren met behulp van gelabelde ribosomen.Het protocol zal worden gedemonstreerd door twee afgestudeerde studenten in mijn groep, Lukas Pekarek en Stefan Park. In deze video gaan we je begeleiden bij het instellen en uitvoeren van een optisch pincetexperiment. We schetsen ook de eenvoudige workflow voor gegevensanalyse.Het voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig en robuust is. Een molecuul wordt vastgebonden tussen twee kralen, vastgebonden in de focus van laserstralen, en verandering en kracht bij verplaatsing kunnen nauwkeurig worden gemeten in zogenaamde force-ramp experimenten. Secundaire structuren in een tether ontvouwen zich met een bepaalde kracht, afhankelijk van de interne energie van het molecuul.Deze dynamische overgang tussen meerdere structuren kan verder worden onderzocht met constante krachtmetingen. Bovendien kan het parallelle gebruik van fluorescerende beeldvorming worden gebruikt om bindingsgebeurtenissen in realtime te visualiseren. Een duidelijk kracht-afstandsprofiel van een tether kan variëren na binding van potentiële transactiefactoren die de stabiliteit ervan beïnvloeden.Eerst moet het betreffende RNA worden gekloond tot een DNA-vector. Stroomopwaarts en stroomafwaarts van deze sequentie zijn extra onderdelen, de handvatten nodig om het uiteindelijke DNA-RNA-construct tussen de kralen te binden. Na succesvol klonen en versterken van het plasmide worden drie verschillende PCR-reacties uitgevoerd.Meng voor elke PCR-reactie de reagentia volgens tabel één in het protocol. Voer de PCR uit in aliquots van 50 microliter in een geschikte thermische cycler. De eerste resulteert in een dubbelstrengs DNA van het hele construct met de T7-promotor voor daaropvolgende in-vitro transcriptie.De tweede PCR produceert de vijf prime handgrepen. Terwijl de laatste reactie resulteert in de drie priemgrepen. Zowel 5 priem- als 3 priemgrepen moeten worden gelabeld volgens de gebruikte kralen.De drie prime handles worden tijdens de PCR gelabeld met behulp van een digoxigenine gelabelde reverse primer, en de vijf prime handles moeten in een extra stap worden geëtiketteerd door middel van biotinylatie. De drie primaire biotinylatie van de vijf priemgrepen wordt uitgevoerd met behulp van T 40 en een polymerase. De reactie wordt gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur uitgevoerd.Voer vervolgens de in-vitro transcriptie uit met behulp van T7-polymerase. Incubeer de reactie bij 37 graden gedurende twee tot vier uur, afhankelijk van de lengte van het RNA. In een laatste stap worden de handvatten gegloeid met het RNA uit de in-vitro transcriptie om het uiteindelijke DNA-RNA-construct te verkrijgen met het enkelstrengs interessegebied tussen de dubbelstrengs handgrepen.Om de gewenste RNA-DNA hybride te gloeien, mengt u de handvatten en het RNA in gloeibuffer. Verwarm het gloeimengsel tot 85 graden gedurende 10 minuten en koel het monster vervolgens langzaam af tot vier graden. Meng het gegloeide monster met 1/10e van het volume van drie molair natriumacetaat en drie volumes ijskoude ethanol en incubeer min 80 graden gedurende ten minste een uur.Centrifugeer de monsters bij 15.000 xg gedurende 30 minuten bij vier graden. Gooi het bovennatuurlijk middel weg en droog de pellet onder vacuüm. Kleine aliquots van de geresuspendeerde pellet worden bevroren in vloeibare stikstof en op min 80 graden gehouden totdat ze worden gebruikt.Verwijder eerst het bleekmiddel uit de spuiten en vul een ml RNase-vrij water in. Voeg 50 microliter 0,5 molair natriumthiosulfaat toe en was het systeem met één staaf. Pas op dat het microfluïdische systeem nooit droogvalt om luchtbellen in het systeem te voorkomen.Gooi vervolgens de resterende natriumthiosulfaatoplossing weg en vervang de spuiten door nieuwe. Daarna opnieuw wassen met minimaal 0,5 ml RNase-vrij water. Om het optische systeem van de machine in te stellen, plaatst u twee druppels dompelolie op het doel.Plaats de stroomcel op zijn plaats en verhoog het doel totdat de vloeistof de stroomcel raakt. Leg vervolgens twee druppels dompelolie op de stroomcel. Schakel nu de valbesturing en de vanglaser in.Het objectief wordt aangepast met behulp van de Z-vinder van de diagnosecamera's van de machine. Door aan de microschroef te draaien, wordt de Z-as aangepast aan het midden van de kamer tussen de tweede en de derde reflectie. Waar de brekingsringen het grootst zijn.Schakel de diagnostische camera's naar de maanmodus en verlaag de vanglaser tot ongeveer 50% Verlaag vervolgens de condensor en pas de positie aan zodat u ongeveer 10 lichtbanden ziet. De meetkamer heeft vijf kanalen en vóór het experiment moeten verschillende instelmogelijkheden worden overwogen. Voor een eenvoudig force-ramp experiment is beads-buffer-beads een handige kanaalopstelling.Voor metingen met de vierde verbinding, zoals fluorescerende ribosomen of transacterende factoren, is de kralen-kralen-bufferfactor een betere opstelling, maar het maakt het moeilijker om kralen te vangen. Een aliquot van de gegloeide constructie wordt geïncubeerd met drie microliter AD-kralsuspensie, één microliter RNase-remmers en acht microliter van de testbuffer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 20 minuten. Vervolgens wordt het monster verdund in een testbuffer van 500 microliter en in het betreffende kanaal geplaatst.Voor de tweede soort kralen wordt 0,8 microliter assaykralen gemengd met één ml testbuffer en toegediend in het overeenkomstige kanaal. De kanalen worden geopend en gewassen met lage druk. Schakel nu de vanglaser in.Om kralen te vangen, worden de lasers uit elkaar verplaatst en wordt een AD-kraal gevangen in val één. Vervolgens wordt de fase verplaatst naar het SA-kralenkanaal en wordt een kraal gevangen in val twee. Om te voorkomen dat de kralen verloren gaan, of om een tweede in dezelfde val te vangen, wordt het podium verplaatst naar het bufferkanaal en worden alle kanalen gesloten.In de buffer wordt een overvulkalibratie uitgevoerd. De gevangen kralen moeten worden ingesteld als visuele sjablonen voor latere metingen. En de gelijkenisscore moet tussen de metingen boven de 90% worden gehouden om de vergelijkbaarheid te garanderen.Ten slotte worden de kralen dichter bij elkaar gebracht en kan men beginnen met het vangen van een enkele tether. Dit wordt gedaan door de kralen een paar seconden dicht te bewegen en vervolgens langzaam de kralen weer te verlaten. Een tetherformatie resulteert in een toename van de gemeten kracht bij het van elkaar wegtrekken van de twee kralen.Het aantal en de kwaliteit van de tethers kan worden gecontroleerd door het overrekkingsplateau te vinden en het traject te vergelijken met het vrij samengevoegde ketting- of wormachtige kettingmodel. Het overrekkingsplateau moet tussen de 50 en 60 piconewton zijn voor een enkele tether. Om de fluorescentiemetingen uit te voeren, schakelt u de confocale lasers in en stelt u fotonen op de eenheid en het optische pincet.Schakel daarna de excitatielaser van de gewenste golflengte en de software-interface in en stel het vermogen van de laser in op 5% of hoger, afhankelijk van de fluorofoor. Nu kan beeldvorming worden gestart met behulp van de beeld- of kymograaffuncties van de software. Om goed gefocuste beelden te krijgen, moet u ervoor zorgen dat het brandpuntsvlak van de confocale microscoop en de optische vallen zijn uitgelijnd.Hiervoor kan autofluorescentie van de polystyreenparels in het blauwe laserkanaal worden gebruikt. Beweeg op en neer met het brandpuntsvlak van de optische vallen totdat de autofluorescentie van de kralen de hoogste diameter bereikt. Op deze positie kunnen de fluorescentiesignalen die plaatsvinden bij het vastgebonden molecuul worden gedetecteerd.Voor beide functies is het belangrijk om de juiste interessante regio's te selecteren. Gedurende de meetbuffer kan de samenstelling eenvoudig worden gewijzigd door de kralen naar verschillende kanalen te verplaatsen of door de buffer in het microfluïdische systeem te veranderen. Om fotobleken te voorkomen, schakelt u de excitatielaser altijd uit wanneer u niet meet.De ruwe gegevensuitvoer van het apparaat bevat vaak veel ruis. Daarom, om verspreide gegevens verder te analyseren, moet men ze eerst vooraf verwerken. De eerste stap is om de gegevens te bemonsteren en te filteren met het Butterworth-filter met lage doorlaat, er werden goede resultaten verkregen.Voor force-ramp experimenten moeten de zich ontvouwende gebeurtenissen worden gemarkeerd op de overeenkomstige gevouwen en uitgevouwen gebieden van de eerste afstandscurve die kunnen worden gemonteerd met behulp van wormachtige ketting- of vrijgevoegde kettingmodellen. Voor de constante krachtgegevens kan de afstand in de tijd worden uitgezet en het is nuttig om een histogram te genereren om de overheersende conformatie bij een bepaalde kracht te kwantificeren. Hier wordt aangetoond dat de filterparameters cruciaal zijn om verschillende vouwtoestanden te onderscheiden.Om beter te begrijpen wat er met deze techniek bereikt kan worden, worden enkele representatieve resultaten getoond. Zo ziet een standaard force-distance curve van een force-ramp experiment eruit. In dit geval bestudeerden we het SARS-coronavirus-2 frameverschuivingselement.We zagen de ontvouwing zich in meerdere stappen rond 15 piconewton. Wanneer de richting wordt omgedraaid en de kralen weer dichterbij komen, vouwt de tether zich met iets lagere kracht terug. Toen we hetzelfde RNA maten in aanwezigheid van het zinkvinger antivirale eiwit ZAP, werd een vergelijkbaar patroon van ontvouwen waargenomen.Maar de secundaire structuur van het RNA hervouwde niet. Dit is een goed voorbeeld om te laten zien welke grote invloed eiwitbinding kan hebben op de RNA-kinetiek. Kijkend naar constante krachtgegevens kan de zich ontvouwende kinetiek verder worden onderzocht.De afstand in de tijd wordt uitgezet voor verschillende krachten en het histogram van de verschillende waargenomen toestanden wordt aan de rechterkant toegevoegd. Bij 10 piconewton is het RNA volledig in gevouwen toestand. Bij 11,5 piconewton wisselt het tussen toestanden en bij 13 piconewton bevindt het RNA zich permanent in een uitgevouwen toestand.Toen het SARS-coronavirus-2 frameverschuivingselement echter samen met ZAP werd gemeten, was het RNA volledig in een uitgevouwen toestand bij 11 piconewton en vertoonde het zelfs heel weinig overgang naar een gevouwen toestand bij 10 piconewton. Dit geeft aan dat ZAP bindt aan het enkelstrengs frameverschuivingselement en de vorming van een secundaire structuur voorkomt. Ten slotte zullen we kijken naar enkele optische pincetgegevens in combinatie met confocale microscopie.In dit experiment werd een fluorescerende kleurstof gebruikt die dubbelstrengs nucleïnezuren labelt, niet specifiek met toenemende kracht. De kymograaf laat zien dat naarmate de kralen uit elkaar worden bewogen, de fluorescentie-intensiteit toeneemt en deze volledig verdwijnt zodra de ketting te veel wordt uitgerekt en breekt. In de laatste figuur werden fluorescerend gelabelde ribosomen toegevoegd via kanaal vier.In dit experiment werd specifieke ribosoombinding aan de RNA-tether waargenomen. We hopen dat deze video je inzicht heeft gegeven in optische pincetten en wat er met deze ongelooflijke techniek kan worden uitgevoerd.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting voor de studie van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...