Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Nous remercions Anuja Kibe et Jun. Prof. Redmond Smyth d’avoir examiné le manuscrit de manière critique. Nous remercions Tatyana Koch pour son assistance technique experte. Nous remercions Kristyna Pekarkova pour son aide dans l’enregistrement de vidéos expérimentales. Les travaux de notre laboratoire sont soutenus par l’Association Helmholtz et le financement de la subvention Nr. 948636 (à NC) du Conseil européen de la recherche (ERC).

1. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Clonez la séquence d’intérêt dans le vecteur contenant les fragments d’ADN Lambda, qui servent de séquences de poignée (Figure 2)43,50.</li>
	<li>Générez d’abord un modèle d’ADN pour une transcription in vitro ultérieure par PCR (Figure 2B; réaction 1). À cette étape de PCR, le promoteur T7 est ajouté à l’extr...

Ici, nous démontrons l’utilisation de pinces optiques couplées à la fluorescence pour étudier les interactions et le comportement dynamique des molécules d’ARN avec divers ligands. Ci-dessous, les étapes critiques et les limites de la technique actuelle sont discutées.
Étapes critiques du protocole Comme pour beaucoup d’autres méthodes, la qualité de l’échantillon est essentielle pour obtenir des données fiables. Par conséquent, pour obtenir des échant...

Le transfert de l’information génétique de l’ADN aux protéines à travers les ARNm est un processus biochimique complexe, qui est régulé avec précision à tous les niveaux par des interactions macromoléculaires à l’intérieur des cellules. Pour la régulation translationnelle, les interactions ARN-protéine confèrent un rôle essentiel pour réagir rapidement à divers stimuli et signaux1,2. Certaines interactions ARN-protéine affectent la stabilité de l’ARNm et modifient ainsi le temps pendant lequel un ARN est actif sur le plan translationnel. D’autres interactions ARN-protéine sont associées à des mécanismes de recodage tels que la lecture stop-codon, le contournement ou le décalage de trame ribosomique programmé (PRF)3,4,5,6,7. Récemment, il a été démontré qu’un certain nombre de protéines de liaison à l’ARN (RBP) interagissent avec les éléments de l’ARNm stimulants et la machinerie de traduction pour dicter quand et combien de recodage se produira dans la cellule7,8,9,10,11. Ainsi, pour disséquer le rôle des protéines de liaison à l’ARN dans la traduction et la façon dont elles modulent la structure et la stabilité de l’ARN, il est essentiel d’étudier en détail les principes d’interaction et les propriétés mécaniques de ces complexes ARN-protéine.
Des décennies de travail ont jeté les bases de l’étude du processus de traduction en plusieurs étapes et en plusieurs composants, qui repose sur une communication complexe entre les composants ARN et protéique de la machinerie de traduction pour atteindre la vitesse et la précision12,13,14. Une prochaine étape cruciale dans la compréhension des événements réglementaires complexes consiste à déterminer les forces, les échelles de temps et les déterminants structurels pendant la traduction avec une grande précision12,15,16,17. L’étude de la dynamique conformationnelle de l’ARN et en particulier de la façon dont les facteurs auxiliaires à action trans agissant sur la structure de l’ARN pendant la traduction ont été encore éclairées par l’émergence d’outils à molécule unique, y compris les pinces optiques ou les guides d’ondes en mode zéro16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Les pinces optiques (OT) représentent une technique à molécule unique très précise, qui a été appliquée pour étudier de nombreux types de processus dynamiques dépendants de l’ARN, y compris la transcription et la traduction26,27,28,29,30,31,32. L’utilisation de pinces optiques a permis de sonder en détail les interactions moléculaires, les structures des acides nucléiques et les propriétés thermodynamiques, la cinétique et l’énergie de ces processus16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Le test de pince à épiler optique est basé sur le piégeage d’objets microscopiques avec un faisceau laser focalisé. Dans une expérience d’OT typique, la molécule d’intérêt est attachée entre deux billes transparentes (généralement du polystyrène) (Figure 1A)27. Ces perles sont ensuite capturées par des pièges optiques, qui se comportent comme des ressorts. Ainsi, la force appliquée sur la molécule peut être calculée en fonction du déplacement de la perle du centre du faisceau laser focalisé (centre du piège). Récemment, des pinces optiques ont été combinées à la microscopie confocale (Figure 1B), permettant des mesures de fluorescence ou de transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET)40,41,42. Cela ouvre un tout nouveau champ d’expériences possibles permettant une mesure simultanée et, par conséquent, une corrélation précise des données de spectroscopie de force et de fluorescence.
Ici, nous démontrons des expériences utilisant la pince à épiler optique combinée à la microscopie confocale pour étudier les interactions protéine-ARN régulant le décalage translationnel. Entre l’objectif et le condenseur, une cellule d’écoulement à cinq canaux permet une application continue de l’échantillon avec un flux laminaire. Grâce aux canaux microfluidiques, divers composants peuvent être injectés directement, ce qui réduit le temps de pratique et permet très peu de consommation d’échantillons tout au long de l’expérience.
Tout d’abord, une ligne directrice de base pour aider à la conception d’expériences OT est proposée et les avantages ainsi que les pièges de diverses configurations sont discutés. Ensuite, la préparation des échantillons et des flux de travail expérimentaux sont décrits, et un protocole pour l’analyse des données est fourni. Pour représenter un exemple, nous décrivons les résultats obtenus à partir d’expériences d’étirement de l’ARN pour étudier l’élément ARN de décalage de trame du SARS-CoV-2 (Figure 2A) avec le facteur de transaction l’isoforme courte de la protéine antivirale à doigts de zinc (ZAP), qui modifie la traduction de l’ARN viral à partir d’un cadre de lecture alternatif43. En outre, il est démontré que des ribosomes marqués par fluorescence peuvent être utilisés dans ce test confocal OT, ce qui serait utile pour surveiller la processivité et la vitesse de la machine de traduction. La méthode présentée ici peut être utilisée pour tester rapidement l’effet de différents tampons, ligands ou autres composants cellulaires afin d’étudier divers aspects de la traduction. Enfin, les pièges expérimentaux courants et la façon de les résoudre sont discutés. Ci-dessous, quelques points cruciaux de la conception expérimentale sont décrits.
Conception de construction En principe, il existe deux approches communes pour créer une construction d’ARN compatible OT. La première approche utilise une longue molécule d’ARN qui est hybridée avec des poignées d’ADN complémentaires, donnant ainsi une construction composée de deux régions hybrides ARN/ADN flanquant une séquence d’ARN simple brin au milieu (Figure 2B). Cette approche est utilisée dans la plupart des expériences d’ARN OT33,44,45.
La deuxième approche tire parti des poignées dsDNA avec des porte-à-faux courts (environ 20 nt)15,17. Ces surplombs sont ensuite hybridés avec la molécule d’ARN. Bien que de conception plus compliquée, l’utilisation de poignées dsDNA surmonte certaines des limites du système hybride ADN/ARN. En principe, même des poignées très longues (>10kb) peuvent être mises en œuvre, ce qui est plus pratique pour les mesures confocales. De plus, la molécule d’ARN peut être ligaturée aux poignées d’ADN pour augmenter la stabilité de l’attache.
Stratégie d’étiquetage final La construction doit être attachée aux perles via une forte interaction moléculaire. Bien qu’il existe des approches disponibles pour la liaison covalente des poignées aux billes46, des interactions fortes mais non covalentes telles que la streptavidine-biotine et la digoxigénine-anticorps sont couramment utilisées dans les expériences OT15,33,35,45. Dans le protocole décrit, la construction est marquée avec de la biotine ou de la digoxigénine, et les billes sont recouvertes de streptavidine ou d’anticorps contre la digoxigénine, respectivement (Figure 1A). Cette approche conviendrait à l’application de forces allant jusqu’à environ 60 pN (par attache)47. De plus, l’utilisation de différentes stratégies d’étiquetage de 5' et 3' permet de déterminer l’orientation de l’attache formée entre les perles17.
Marquage des protéines pour les mesures de fluorescence Pour l’imagerie confocale, il existe plusieurs approches couramment utilisées pour le marquage par fluorescence. Par exemple, les fluorophores peuvent être attachés de manière covalente à des résidus d’acides aminés qui se trouvent nativement dans les protéines ou introduits par mutagénèse dirigée par le site à travers un groupe organique réactif. Les colorants thiol ou réactifs aux amines peuvent être utilisés pour le marquage des résidus de cystéine et de lysine, respectivement. Il existe plusieurs méthodes de protection réversibles pour augmenter la spécificité du marquage48,49, mais les protéines natives seraient généralement marquées à plusieurs résidus. Bien que la petite taille du fluorophore puisse conférer un avantage, un marquage non spécifique peut interférer avec l’activité protéique et, par conséquent, l’intensité du signal peut varier49. En outre, en fonction de l’efficacité de l’étiquetage, l’intensité du signal peut différer d’une expérience à l’autre. Par conséquent, une vérification de l’activité doit être effectuée avant l’expérience.
Dans le cas où la protéine d’intérêt contient une étiquette terminale N ou C, telle qu’une étiquette His ou une étiquette streptococcique, l’étiquetage spécifique de ces étiquettes représente une autre approche populaire. De plus, le marquage ciblé par étiquette réduit le risque que le fluorophore interfère avec l’activité des protéines et peut améliorer la solubilité49. Cependant, l’étiquetage spécifique à l’étiquette donne généralement des protéines marquées monofluorophore, ce qui peut être difficile à détecter. Une autre façon de marquer spécifiquement peut être réalisée en utilisant des anticorps.
Configuration de la microfluidique La combinaison de l’OT avec un système microfluidique permet une transition rapide entre différentes conditions expérimentales. De plus, les systèmes actuels tirent parti du maintien du flux laminaire à l’intérieur de la cellule d’écoulement, ce qui empêche le mélange de liquides d’autres canaux dans la direction perpendiculaire par rapport à la direction d’écoulement. Par conséquent, l’écoulement laminaire est particulièrement avantageux pour la conception expérimentale. Actuellement, les cellules d’écoulement avec jusqu’à 5 canaux sont couramment utilisées (Figure 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

L’ARN adopte divers plis structurels, qui sont essentiels à ses fonctions et peuvent donc avoir un impact sur divers processus dans la cellule. En outre, la structure et la fonction d’un ARN peuvent être modulées par divers facteurs trans-agissants, tels que des protéines, des métabolites ou d’autres ARN. Les molécules d’ARN à décalage de trame, par exemple, sont des ARN régulateurs situés dans des régions codantes, qui dirigent la traduction des ribosomes en un cadre de lecture ouvert alternatif, et agissent ainsi comme des commutateurs de gènes. Ils peuvent également adopter différents plis après s’être liés à des protéines ou à d’autres facteurs trans. Pour disséquer le rôle des protéines de liaison à l’ARN dans la traduction et la façon dont elles modulent la structure et la stabilité de l’ARN, il est crucial d’étudier simultanément l’interaction et les caractéristiques mécaniques de ces complexes ARN-protéine. Ce travail illustre comment utiliser des pinces optiques couplées à une seule molécule et à fluorescence pour explorer le paysage conformationnel et thermodynamique des complexes ARN-protéine à haute résolution. À titre d’exemple, l’interaction de l’élément de décalage de trame ribosomique programmé par le SARS-CoV-2 avec l’isoforme courte du facteur trans-agissant de la protéine antivirale zinc-doigt est élaborée. De plus, les ribosomes marqués par fluorescence ont été surveillés à l’aide de l’unité confocale, ce qui permettrait finalement d’étudier l’allongement de la traduction. Le test OT couplé à la fluorescence peut être largement appliqué pour explorer divers complexes ARN-protéine ou facteurs trans-agissant régulant la traduction et pourrait faciliter les études de la régulation des gènes basée sur l’ARN.

Dans cette section, l’accent est principalement mis sur les mesures des interactions ARN-protéine/ligand par les pinces optiques à fluorescence. Pour une description des expériences générales de pinces optiques à ARN et des résultats représentatifs correspondants, voir 32. Pour une discussion plus détaillée des interactions ARN/ADN-protéine, voir également 1,2,26,59,60.<sup class=...

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Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Ce protocole présente un flux de travail expérimental complet pour l’étude des interactions ARN-protéine à l’aide de pinces optiques. Plusieurs configurations expérimentales possibles sont décrites, y compris la combinaison de pinces optiques avec la microscopie confocale.

Pinces optiques pour étudier les interactions ARN-protéine dans la régulation de la traduction

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

L’objectif global de l’article suivant sur la méthode est de démontrer un protocole utile pour étudier les interactions de l’ARN avec les protéines ou d’autres facteurs à l’aide de pinces optiques couplées à la microscopie confocale. Au cours de la dernière décennie, plusieurs techniques sophistiquées ont été développées pour étudier les propriétés des macromolécules individuelles. L’une de ces techniques est la pince optique à molécule unique.Avec la nouvelle pince optique assistée par fluorescence, non seulement les forces nécessaires au déploiement des molécules d’ARN, ainsi que les événements de liaison pendant la traduction peuvent être surveillés en détail. Ici, nous nous concentrons sur les mesures dans lesquelles les molécules d’ARN sont étirées avec et sans facteurs de transaction qui régulent la traduction. Nous illustrons également comment la technique peut être appliquée pour surveiller la traduction à l’aide de ribosomes étiquetés.Le protocole sera démontré par deux étudiants diplômés de mon groupe, Lukas Pekarek et Stefan Park. Dans cette vidéo, nous allons vous guider à travers la configuration et l’exécution d’une expérience de pince à épiler optique. Nous décrivons également le flux de travail simple d’analyse des données.L’avantage de cette technique est qu’elle est simple et robuste. Une molécule est attachée entre deux perles, sanglée dans le foyer des faisceaux laser, et le changement et la force lors du déplacement peuvent être mesurés avec précision dans des expériences dites de rampe de force. Les structures secondaires à l’intérieur d’une attache se déploient à une certaine force en fonction de l’énergie interne de la molécule.Cette transition dynamique entre plusieurs structures peut être étudiée plus avant avec des mesures de force constantes. En outre, l’utilisation parallèle de l’imagerie fluorescente peut être utilisée pour visualiser les événements de liaison en temps réel. Un profil force-distance distinct d’une attache peut varier après la liaison de facteurs de transaction potentiels qui influencent sa stabilité.Tout d’abord, l’ARN d’intérêt doit être cloné dans un vecteur d’ADN. En amont et en aval de cette séquence, des parties supplémentaires, les poignées sont nécessaires pour attacher la construction finale ADN-ARN entre les perles. Après un clonage et une amplification réussis du plasmide, trois réactions PCR différentes sont effectuées.Pour chaque réaction de PCR, mélanger les réactifs selon le tableau un du protocole. Exécutez la PCR en aliquotes de 50 microlitres dans un cycleur thermique approprié. Le premier aboutit à un ADN double brin de l’ensemble de la construction avec le promoteur T7 pour une transcription in vitro ultérieure.La deuxième PCR produit les cinq poignées principales. Alors que la dernière réaction aboutit aux trois poignées principales. Les poignées 5 prime et 3 prime doivent être étiquetées en fonction des perles utilisées.Les trois poignées principales sont marquées pendant la PCR à l’aide d’une amorce inverse marquée à la digoxigénine, et les cinq poignées principales doivent être marquées en une étape supplémentaire par biotinylation. La biotinylation des trois premiers des cinq premiers manchons est réalisée à l’aide de T 40 et d’une polymérase. La réaction est réalisée pendant une à deux heures à température ambiante.Ensuite, effectuez la transcription in vitro à l’aide de la polymérase T7. Incuber la réaction à 37 degrés pendant deux à quatre heures, selon la longueur de l’ARN. Dans une dernière étape, les poignées sont recuites avec l’ARN de la transcription in vitro pour obtenir la construction finale ADN-ARN avec la région simple brin d’intérêt entre les poignées double brin.Pour recuit l’hybride ARN-ADN souhaité, mélangez les poignées et l’ARN dans un tampon de recuit. Chauffer, le mélange de recuit jusqu’à 85 degrés pendant 10 minutes, puis refroidir lentement l’échantillon à quatre degrés. Mélanger l’échantillon recuit avec 1/10e de volume de trois acétate de sodium molaire et trois volumes d’éthanol glacé et incuber moins 80 degrés pendant au moins une heure.Centrifugez les échantillons à 15 000 xg pendant 30 minutes à quatre degrés. Jeter le surnageant et sécher la pastille sous vide. Les petites aliquotes de la pastille remise en suspension sont congelées dans de l’azote liquide et conservées à moins 80 degrés jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.Retirez d’abord l’eau de Javel des seringues et remplissez un mL d’eau sans RNase. Ajouter 50 microlitres de thiosulfate de sodium 0,5 molaire et laver le système avec une barre. Veillez à ce que le système microfluidique ne s’assèche jamais pour éviter les bulles d’air dans le système.Ensuite, jetez la solution de thiosulfate de sodium restante et remplacez les seringues par de nouvelles. Ensuite, laver à nouveau avec au moins 0,5 mL d’eau sans RNase. Pour mettre en place le système optique de la machine, placez deux gouttes d’huile d’immersion sur l’objectif.Mettez la cellule d’écoulement en place et relevez l’objectif jusqu’à ce que le liquide touche la cellule d’écoulement. Ensuite, placez deux gouttes d’huile d’immersion sur le dessus de la cellule d’écoulement. Maintenant, allumez l’unité de direction de piège et le laser de piégeage.L’objectif est réglé à l’aide de l’outil de recherche Z des caméras de diagnostic de la machine. En tournant la micro vis, l’axe Z est ajusté au milieu de la chambre entre la deuxième et la troisième réflexion. Où les anneaux de réfraction sont les plus grands.Passez les caméras de diagnostic en mode lune et réduisez le laser de piégeage à environ 50%, puis abaissez le condenseur et ajustez sa position pour voir environ 10 bandes lumineuses. La chambre de mesure a cinq canaux, et avant l’expérience, différentes possibilités de configuration doivent être envisagées. Pour une simple expérience de rampe de force, perles-tampons-perles est un arrangement de canal pratique.Pour les mesures avec le quatrième composé, comme les ribosomes fluorescents ou les facteurs de transaction, le facteur perles-perles-tampon est un meilleur arrangement, mais il rend plus difficile la capture des perles. Une aliquote de la construction recuite est incubée avec trois microlitres de suspension de billes AD, un microlitre d’inhibiteurs de la RNase et huit microlitres du tampon d’essai à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Ensuite, l’échantillon est dilué dans un tampon de dosage de 500 microlitres et placé dans le canal respectif.Pour le deuxième type de billes, 0,8 microlitre de billes d’essai sont mélangés à un mL de tampon d’essai et administrés dans le canal correspondant. Les canaux sont ouverts et lavés à basse pression. Maintenant, allumez le laser de piégeage.Pour attraper les perles, les lasers sont éloignés les uns des autres et une perle AD est prise dans un piège. Ensuite, l’étape est déplacée vers le canal de perles SA et une perle est prise dans le piège deux. Pour éviter de perdre les perles, ou pour en attraper une seconde dans le même piège, la scène est déplacée vers le canal tampon et tous les canaux sont fermés.Dans la mémoire tampon, un étalonnage de piège est effectué. Les perles capturées doivent être définies comme modèles visuels pour les mesures ultérieures. Et le score de similitude doit être maintenu au-dessus de 90% entre les mesures pour garantir la comparabilité.Enfin, les perles sont rapprochées et on peut commencer à attraper une seule attache. Cela se fait en déplaçant les perles près pendant quelques secondes, puis en quittant lentement les perles à nouveau. Une formation d’attache entraîne une augmentation de la force mesurée en éloignant les deux perles l’une de l’autre.Le nombre et la qualité des attaches peuvent être vérifiés en trouvant le plateau de surmenage et en comparant la trajectoire avec le modèle de chaîne librement articulée ou de chaîne en forme de ver. Le plateau de surmenage devrait être compris entre 50 et 60 piconewtons pour une seule attache. Pour effectuer les mesures de fluorescence, allumez les lasers confocaux et le nombre de photons sur l’unité et la pince optique.Ensuite, allumez le laser d’excitation de la longueur d’onde souhaitée et l’interface logicielle et réglez la puissance du laser à 5% ou plus, en fonction du fluorophore. Maintenant, l’imagerie peut être démarrée en utilisant les fonctions d’image ou de kymographe du logiciel. Afin d’obtenir des images bien focalisées, assurez-vous que le plan focal du microscope confocal et les pièges optiques sont alignés.À cette fin, l’autofluorescence des billes de polystyrène dans le canal laser bleu peut être utilisée. Déplacez-vous de haut en bas avec le plan focal des pièges optiques jusqu’à ce que l’autofluorescence des perles atteigne son diamètre le plus élevé. À cette position, les signaux de fluorescence qui ont lieu au niveau de la molécule attachée peuvent être détectés.Pour les deux fonctions, il est important de sélectionner les régions d’intérêt appropriées. Tout au long de la mesure, la composition du tampon peut être facilement modifiée soit en déplaçant les billes vers différents canaux, soit en changeant le tampon fourni dans le système microfluidique. Pour éviter le photoblanchiment, éteignez toujours le laser d’excitation lorsque vous ne mesurez pas.La sortie de données brutes de l’appareil contient souvent beaucoup de bruit. Par conséquent, afin d’analyser davantage les données dispersées, il faut d’abord les pré-traiter. La première étape consiste à échantillonner et à filtrer les données avec le filtre Butterworth passe-bas, de bons résultats ont été obtenus.Pour les expériences de rampe de force, les événements de déploiement doivent être marqués aux régions pliées et dépliées correspondantes de la première courbe de distance peuvent être ajustées à l’aide de chaînes en forme de ver ou de modèles de chaînes librement articulées. Pour les données de force constante, la distance dans le temps peut être tracée et il est utile de générer un histogramme pour quantifier la conformation prédominante à une force donnée. Ici, il est montré que les paramètres du filtre sont cruciaux pour distinguer les différents états de pliage.Pour mieux comprendre ce qui peut être réalisé avec cette technique, certains résultats représentatifs sont montrés. Voici à quoi ressemble une courbe force-distance standard d’une expérience de rampe de force. Dans ce cas, nous avons étudié l’élément de changement de cadre SARS-coronavirus-2.Nous avons observé le déroulement en plusieurs étapes autour de 15 piconewton. Lorsque la direction est inversée et que les perles se rapprochent à nouveau, l’attache se replie à force légèrement inférieure. Lorsque nous avons mesuré le même ARN en présence de la protéine antivirale ZAP du doigt de zinc, un schéma similaire de déploiement a été observé.Mais la structure secondaire de l’ARN ne s’est pas repliée. C’est un bon exemple pour montrer quelle grande influence la liaison aux protéines peut avoir sur la cinétique de l’ARN. En regardant les données de force constante, la cinétique de déploiement peut être étudiée plus en détail.La distance dans le temps est tracée pour différentes forces et l’histogramme des différents états observés est ajouté à droite. À 10 piconewtons, l’ARN est complètement à l’état plié. À 11,5 piconewton, il bascule entre les états, et à 13 piconewton, l’ARN est en permanence dans un état déplié.Cependant, lorsque l’élément de changement de cadre SARS-coronavirus-2 a été mesuré avec ZAP, l’ARN était complètement dans un état déplié à 11 piconewtons, et a même montré très peu de transition vers un état plié à 10 piconewton. Cela indique que ZAP se lie à l’élément de déplacement de cadre simple brin et empêche la formation d’une structure secondaire. Enfin, nous examinerons certaines données de pinces optiques couplées à la microscopie confocale.Dans cette expérience, un colorant fluorescent a été utilisé qui marque les acides nucléiques double brin, non spécifiquement avec une force croissante. Le kymographe montre que lorsque les perles sont éloignées les unes des autres, l’intensité de fluorescence augmente et disparaît complètement une fois que l’attache est trop étirée et se brise. Dans la dernière figure, des ribosomes marqués par fluorescence ont été ajoutés par le canal quatre.Dans cette expérience, une liaison spécifique du ribosome à l’attache de l’ARN a été observée. Nous espérons que cette vidéo vous a donné un aperçu des pinces optiques et de ce qui peut être effectué cette technique incroyable.

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