Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Wir danken Anuja Kibe und Jun. Prof. Redmond Smyth für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Wir danken Tatyana Koch für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken Kristyna Pekarkova für die Hilfe bei der Aufnahme experimenteller Videos. Die Arbeit in unserem Labor wird von der Helmholtz-Gemeinschaft unterstützt und vom Europäischen Forschungsrat (ERC) Grant Nr. 948636 (bis NC) gefördert.

1. Probenvorbereitung
<ol><li>Klonen Sie die interessierende Sequenz in den Vektor, der die Lambda-DNA-Fragmente enthält, die als Griffsequenzen dienen (Abbildung 2)43,50.</li>
	<li>Generieren Sie zunächst eine DNA-Vorlage für die anschließende In-vitro-Transkription mittels PCR (Abbildung 2B; Reaktion 1). Bei diesem PCR-Schritt wird der T7-Promotor am 5'-Ende des Sinnes-D...

Hier demonstrieren wir die Verwendung von fluoreszenzgekoppelten optischen Pinzetten, um Wechselwirkungen und dynamisches Verhalten von RNA-Molekülen mit verschiedenen Liganden zu untersuchen. Im Folgenden werden kritische Schritte und Einschränkungen der vorliegenden Technik diskutiert.
Kritische Schritte im Protokoll Wie bei vielen anderen Methoden ist die Qualität der Probe entscheidend, um zuverlässige Daten zu erhalten. Um Proben von höchstmöglicher Qualität zu ...

Die Übertragung genetischer Information von DNA auf Proteine durch mRNAs ist ein komplexer biochemischer Prozess, der auf allen Ebenen durch makromolekulare Interaktionen innerhalb von Zellen präzise reguliert wird. Für die translationale Regulation spielen RNA-Protein-Interaktionen eine entscheidende Rolle, um schnell auf verschiedene Reize und Signale zu reagieren1,2. Einige RNA-Protein-Interaktionen beeinflussen die mRNA-Stabilität und verändern dadurch die Zeit, in der eine RNA translational aktiv ist. Andere RNA-Protein-Interaktionen sind mit Rekodierungsmechanismen wie Stop-Codon-Readthrough, Bypassing oder Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF)3,4,5,6,7 assoziiert. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Reihe von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit stimulierenden mRNA-Elementen und der Translationsmaschinerie interagieren, um zu bestimmen, wann und wie viel Rekodierung in der Zelle stattfinden wird7,8,9,10,11. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation und deren Modulation der RNA-Struktur und -Stabilität zu analysieren, ist es daher von entscheidender Bedeutung, die Interaktionsprinzipien und mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Proteinkomplexe im Detail zu untersuchen.
Jahrzehntelange Arbeit hat den Grundstein für die Untersuchung des mehrstufigen und mehrkomponentigen Prozesses der Translation gelegt, der auf einer komplizierten Kommunikation zwischen den RNA- und Proteinkomponenten der Translationsmaschinerie beruht, um Geschwindigkeit und Genauigkeit zu erreichen12,13,14. Ein entscheidender nächster Schritt zum Verständnis komplexer regulatorischer Ereignisse ist die Bestimmung der Kräfte, Zeitskalen und strukturellen Determinanten während der Translation mit hoher Genauigkeit12,15,16,17. Die Untersuchung der RNA-Konformationsdynamik und insbesondere wie trans-wirkende Hilfsfaktoren während der Translation auf die RNA-Struktur wirken, wurde durch das Aufkommen von Einzelmolekülwerkzeugen, einschließlich optischer Pinzetten oder Nullmodus-Wellenleiter, weiter beleuchtet16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optische Pinzetten (OT) stellen eine hochpräzise Einzelmolekültechnik dar, die angewendet wurde, um viele Arten von RNA-abhängigen dynamischen Prozessen einschließlich Transkription und Translation zu untersuchen26,27,28,29,30,31,32. Die Verwendung einer optischen Pinzette hat es ermöglicht, molekulare Wechselwirkungen, Nukleinsäurestrukturen und thermodynamische Eigenschaften, Kinetik und Energetik dieser Prozesse im Detail zu untersuchen16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Der optische Pinzetten-Assay basiert auf dem Einklemmen mikroskopischer Objekte mit einem fokussierten Laserstrahl. In einem typischen OT-Experiment wird das interessierende Molekül zwischen zwei transparenten (normalerweise Polystyrol-) Kügelchen gebunden (Abbildung 1A)27. Diese Perlen werden dann von optischen Fallen aufgefangen, die sich wie Federn verhalten. So kann die auf das Molekül ausgeübte Kraft basierend auf der Verschiebung der Perle aus dem Zentrum des fokussierten Laserstrahls (Fallenzentrum) berechnet werden. Kürzlich wurden optische Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie kombiniert (Abbildung 1B), was Fluoreszenz- oder Förster-Resonanzenergietransfermessungen (FRET) ermöglicht40,41,42. Dies eröffnet ein völlig neues Feld möglicher Experimente, die eine gleichzeitige Messung und damit eine präzise Korrelation von Kraftspektroskopie und Fluoreszenzdaten ermöglichen.
Hier demonstrieren wir Experimente mit der optischen Pinzette in Kombination mit konfokaler Mikroskopie, um Protein-RNA-Interaktionen zu untersuchen, die die translationale Frameshifting regulieren. Zwischen objektiv und Kondensator ermöglicht eine Durchflusszelle mit fünf Kanälen eine kontinuierliche Probenapplikation mit laminarer Strömung. Durch die mikrofluidischen Kanäle können verschiedene Komponenten direkt injiziert werden, was die Hands-on-Zeit verkürzt und während des gesamten Experiments einen sehr geringen Probenverbrauch ermöglicht.
Zunächst wird eine grundlegende Richtlinie zur Unterstützung des Designs von OT-Experimenten vorgeschlagen und Vorteile sowie Fallstricke verschiedener Setups diskutiert. Als nächstes werden die Aufbereitung von Proben und experimentelle Workflows beschrieben und ein Protokoll für die Datenanalyse bereitgestellt. Um ein Beispiel darzustellen, skizzieren wir die Ergebnisse von RNA-Dehnungsexperimenten zur Untersuchung des SARS-CoV-2 frameshifting RNA-Elements (Abbildung 2A) mit dem trans-agierenden Faktor, der kurzen Isoform des antiviralen Zinkfingerproteins (ZAP), das die Translation der viralen RNA aus einem alternativen Leserahmen verändert43. Darüber hinaus wird gezeigt, dass fluoreszenzmarkierte Ribosomen in diesem OT-konfokalen Assay verwendet werden können, was nützlich wäre, um die Prozessivität und Geschwindigkeit der Translationsmaschinerie zu überwachen. Die hier vorgestellte Methode kann verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Puffer, Liganden oder anderer zellulärer Komponenten schnell zu testen, um verschiedene Aspekte der Translation zu untersuchen. Schließlich werden häufige experimentelle Fallstricke und deren Behebung diskutiert. Im Folgenden werden einige entscheidende Punkte im experimentellen Design skizziert.
Konstruktionsdesign Prinzipiell gibt es zwei gängige Ansätze, um ein OT-kompatibles RNA-Konstrukt zu erstellen. Der erste Ansatz verwendet ein langes RNA-Molekül, das mit komplementären DNA-Handles hybridisiert wird, wodurch ein Konstrukt aus zwei RNA/DNA-Hybridregionen entsteht, die eine einzelsträngige RNA-Sequenz in der Mitte flankieren (Abbildung 2B). Dieser Ansatz wird in den meisten OT-RNA-Experimenten verwendet33,44,45.
Der zweite Ansatz nutzt dsDNA-Griffe mit kurzen (ca. 20 nt) Überhängen15,17. Diese Überhänge werden dann mit dem RNA-Molekül hybridisiert. Obwohl komplizierter im Design, überwindet die Verwendung von dsDNA-Handles einige Einschränkungen des DNA / RNA-Hybridsystems. Prinzipiell können auch sehr lange Griffe (>10kb) realisiert werden, was für konfokale Messungen komfortabler ist. Darüber hinaus kann das RNA-Molekül an DNA-Handles ligiert werden, um die Tether-Stabilität zu erhöhen.
End-Labeling-Strategie Das Konstrukt muss über eine starke molekulare Wechselwirkung an Perlen gebunden werden. Während es Ansätze für die kovalente Bindung von Griffen an Perlen46 gibt, werden starke, aber nicht-kovalente Wechselwirkungen wie Streptavidin-Biotin und Digoxigenin-Antikörper häufig in OT-Experimenten verwendet15,33,35,45. Im beschriebenen Protokoll wird das Konstrukt mit Biotin oder Digoxigenin markiert, und die Kügelchen sind mit Streptavidin bzw. Antikörpern gegen Digoxigenin beschichtet (Abbildung 1A). Dieser Ansatz wäre für die Anwendung von Kräften bis zu etwa 60 pN (per Tether)47 geeignet. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung unterschiedlicher 5'- und 3'-Markierungsstrategien die Bestimmung der Ausrichtung des zwischen den Kügelchen gebildeten Seils17.
Proteinmarkierung für Fluoreszenzmessungen Für die konfokale Bildgebung gibt es mehrere häufig verwendete Ansätze zur Fluoreszenzmarkierung. Zum Beispiel können Fluorophore kovalent an Aminosäurereste gebunden sein, die nativ in Proteinen vorkommen oder durch ortsgerichtete Mutagenese durch eine reaktive organische Gruppe eingeführt werden. Thiol- oder Amin-reaktive Farbstoffe können zur Markierung von Cystein- bzw. Lysinresten verwendet werden. Es gibt mehrere reversible Schutzmethoden, um die Spezifität der Markierung zu erhöhen48,49, jedoch würden native Proteine typischerweise an mehreren Rückständen markiert. Obwohl die geringe Größe des Fluorophors einen Vorteil bieten kann, kann eine unspezifische Markierung die Proteinaktivität beeinträchtigen und somit die Signalintensität variieren49. Abhängig von der Markierungseffizienz kann die Signalintensität zwischen verschiedenen Experimenten variieren. Daher sollte vor dem Experiment eine Aktivitätsprüfung durchgeführt werden.
Falls das Protein von Interesse ein N- oder C-terminales Tag enthält, wie z. B. ein His-Tag oder ein Streptokokken-Tag, stellt die spezifische Kennzeichnung dieser Tags einen weiteren beliebten Ansatz dar. Darüber hinaus verringert die markierungsorientierte Markierung die Wahrscheinlichkeit, dass das Fluorophor die Proteinaktivität stört, und kann die Löslichkeit verbessern49. Die Tag-spezifische Markierung führt jedoch in der Regel zu monofluorophor markierten Proteinen, die schwer nachzuweisen sein können. Eine andere Möglichkeit der spezifischen Markierung kann durch den Einsatz von Antikörpern erreicht werden.
Aufbau der Mikrofluidik Die Kombination von OT mit einem Mikrofluidik-System ermöglicht einen schnellen Übergang zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen. Darüber hinaus nutzen Stromsysteme die Aufrechterhaltung der laminaren Strömung in der Durchflusszelle, was das Mischen von Flüssigkeiten aus anderen Kanälen in senkrechter Richtung relativ zur Strömungsrichtung verhindert. Daher ist die laminare Strömung besonders vorteilhaft für das experimentelle Design. Derzeit werden häufig Flusszellen mit bis zu 5 Kanälen eingesetzt (Abbildung 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA nimmt verschiedene strukturelle Falten an, die für ihre Funktionen essentiell sind und dadurch verschiedene Prozesse in der Zelle beeinflussen können. Darüber hinaus kann die Struktur und Funktion einer RNA durch verschiedene transaktive Faktoren wie Proteine, Metaboliten oder andere RNAs moduliert werden. Frameshifting-RNA-Moleküle zum Beispiel sind regulatorische RNAs in kodierenden Regionen, die Ribosomen direkt in einen alternativen offenen Leserahmen übersetzen und dadurch als Genschalter fungieren. Sie können auch verschiedene Falten annehmen, nachdem sie an Proteine oder andere Transfaktoren gebunden sind. Um die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der Translation zu analysieren und wie sie die RNA-Struktur und -Stabilität modulieren, ist es wichtig, das Zusammenspiel und die mechanischen Eigenschaften dieser RNA-Protein-Komplexe gleichzeitig zu untersuchen. Diese Arbeit zeigt, wie man mit einer einzelnen Molekül-Fluoreszenz-gekoppelten optischen Pinzette die Konformations- und thermodynamische Landschaft von RNA-Protein-Komplexen mit hoher Auflösung erforscht. Als Beispiel wird die Interaktion des SARS-CoV-2 programmierten ribosomalen Frameshifting-Elements mit der trans-wirkenden Faktor-Kurzisoform des antiviralen Zinkfingerproteins herausgearbeitet. Darüber hinaus wurden fluoreszenzmarkierte Ribosomen mit der konfokalen Einheit überwacht, was letztendlich die Untersuchung der Translationsdehnung ermöglichen würde. Der fluoreszenzgekoppelte OT-Assay kann weit verbreitet eingesetzt werden, um verschiedene RNA-Proteinkomplexe oder trans-wirkende Faktoren zu erforschen, die die Translation regulieren, und könnte Studien zur RNA-basierten Genregulation erleichtern.

In diesem Abschnitt liegt der Schwerpunkt hauptsächlich auf Messungen von RNA-Protein/Liganden-Wechselwirkungen durch die fluoreszenzoptischen Pinzetten. Für eine Beschreibung allgemeiner Experimente mit optischen RNA-Pinzetten und entsprechenden repräsentativen Ergebnissen siehe 32. Für eine detailliertere Erörterung der RNA/DNA-Protein-Interaktionen siehe auch 1,2,26,59,60<s...

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Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Methodenartikels ist es, ein Protokoll zu demonstrieren, das nützlich ist, um RNA-Wechselwirkungen mit Proteinen oder anderen Faktoren unter Verwendung einer optischen Pinzette in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere ausgeklügelte Techniken entwickelt, um die Eigenschaften einzelner Makromoleküle zu untersuchen. Eine dieser Techniken ist eine optische Pinzette mit einem Molekül.Mit der neuen fluoreszenzgestützten optischen Pinzette können nicht nur kräfte, die für die Entfaltung von RNA-Molekülen benötigt werden, sondern auch Bindungsereignisse während der Translation detailliert überwacht werden. Hier konzentrieren wir uns auf Messungen, bei denen RNA-Moleküle mit und ohne Transaktionsfaktoren gedehnt werden, die die Translation regulieren. Wir veranschaulichen auch, wie die Technik angewendet werden kann, um die Translation mit markierten Ribosomen zu überwachen.Das Protokoll wird von zwei Doktoranden meiner Gruppe, Lukas Pekarek und Stefan Park, demonstriert. In diesem Video führen wir Sie durch die Einrichtung und Durchführung eines optischen Pinzettenexperiments. Wir skizzieren auch den einfachen Datenanalyse-Workflow.Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie unkompliziert und robust ist. Ein Molekül wird zwischen zwei Kügelchen gebunden, im Fokus von Laserstrahlen festgeschnallt, und in sogenannten Force-Ramp-Experimenten können Änderung und Kraft bei Verschiebung präzise gemessen werden. Sekundärstrukturen innerhalb eines Seils entfalten sich bei einer bestimmten Kraft, abhängig von der inneren Energie des Moleküls.Dieser dynamische Übergang zwischen mehreren Strukturen kann mit konstanten Kraftmessungen weiter untersucht werden. Darüber hinaus kann der parallele Einsatz der Fluoreszenzbildgebung genutzt werden, um Bindungsereignisse in Echtzeit sichtbar zu machen. Ein ausgeprägtes Kraft-Weg-Profil eines Seils kann nach der Bindung potenzieller Transaktionsfaktoren, die seine Stabilität beeinflussen, variieren.Zunächst muss die interessierende RNA in einen DNA-Vektor kloniert werden. Vor und nach dieser Sequenz werden zusätzliche Teile, die Griffe benötigt, um das endgültige DNA-RNA-Konstrukt zwischen den Kügelchen zu binden. Nach erfolgreichem Klonen und Amplifikation des Plasmids werden drei verschiedene PCR-Reaktionen durchgeführt.Mischen Sie für jede PCR-Reaktion die Reagenzien gemäß Tabelle eins im Protokoll. Führen Sie die PCR in 50 Mikroliter-Aliquots in einem geeigneten thermischen Cycler durch. Die erste führt zu einer doppelsträngigen DNA des gesamten Konstrukts mit dem T7-Promotor für die anschließende In-vitro-Transkription.Die zweite PCR erzeugt die fünf Prime-Griffe. Während die letzte Reaktion zu den drei Prime-Griffen führt. Sowohl 5 Prime- als auch 3 Prime-Griffe müssen entsprechend den verwendeten Perlen gekennzeichnet werden.Die drei Prime-Griffe werden während der PCR mit einem Digoxigenin-markierten Reverse-Primer markiert, und die fünf Prime-Griffe müssen in einem zusätzlichen Schritt durch Biotinylierung markiert werden. Die drei Prime-Biotinylierung der fünf Prime-Griffe erfolgt unter Verwendung von T40 und einer Polymerase. Die Reaktion wird für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.Als nächstes führen Sie die In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase durch. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad für zwei bis vier Stunden, abhängig von der Länge der RNA. In einem letzten Schritt werden die Handles mit der RNA aus der in-vitro-Transkription geglüht, um das endgültige DNA-RNA-Konstrukt mit der einzelsträngigen Region von Interesse zwischen den doppelsträngigen Handles zu erhalten.Um den gewünschten RNA-DNA-Hybrid zu glühen, mischen Sie die Griffe und die RNA in Glühpuffer. Die Glühmischung 10 Minuten lang auf 85 Grad erhitzen und dann die Probe langsam auf vier Grad abkühlen lassen. Mischen Sie die geglühte Probe mit 1/10 Volumen von drei molaren Natriumacetat und drei Volumen eiskaltem Ethanol und inkubieren Sie minus 80 Grad für mindestens eine Stunde.Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.000 xg für 30 Minuten bei vier Grad. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet unter Vakuum. Kleine Aliquots des resuspendierten Pellets werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu ihrer Verwendung bei minus 80 Grad gehalten.Entfernen Sie zuerst das Bleichmittel aus den Spritzen und füllen Sie einen ml RNase-freies Wasser ein. Fügen Sie 50 Mikroliter 0,5 molares Natriumthiosulfat hinzu und waschen Sie das System mit einem Riegel. Achten Sie darauf, dass das mikrofluidische System niemals trocken läuft, um Luftblasen im System zu vermeiden.Als nächstes verwerfen Sie die verbleibende Natriumthiosulfatlösung und ersetzen Sie die Spritzen durch neue. Anschließend erneut mit mindestens 0,5 ml RNase-freiem Wasser waschen. Um das optische System der Maschine einzurichten, geben Sie zwei Tropfen Tauchöl auf das Objektiv.Setzen Sie die Flusszelle ein und heben Sie das Ziel an, bis die Flüssigkeit die Flusszelle berührt. Dann geben Sie zwei Tropfen Tauchöl auf die Durchflusszelle. Schalten Sie nun die Trap-Steuereinheit und den Trapping-Laser ein.Das Objektiv wird mit dem Z-Finder-Tool der Diagnosekameras der Maschine eingestellt. Durch Drehen der Mikroschraube wird die Z-Achse auf die Mitte der Kammer zwischen der zweiten und der dritten Reflexion eingestellt. Wo die Brechungsringe am größten sind.Schalten Sie die Diagnosekameras in den Mondmodus und reduzieren Sie den Fanglaser auf etwa 50%, dann senken Sie den Kondensator und passen Sie seine Position an, so dass Sie ungefähr 10 Lichtbänder sehen. Die Messkammer hat fünf Kanäle, und vor dem Experiment sollten verschiedene Rüstmöglichkeiten in Betracht gezogen werden. Für ein einfaches Force-Ramp-Experiment ist beads-buffer-beads eine bequeme Kanalanordnung.Für Messungen mit der vierten Verbindung, wie fluoreszierende Ribosomen oder Transaktionsfaktoren, ist der Perlen-Perlen-Pufferfaktor eine bessere Anordnung, aber es macht es schwieriger, Perlen zu fangen. Ein Aliquot des geglühten Konstrukts wird mit drei Mikroliter AD-Perlensuspension, einem Mikroliter RNase-Inhibitor und acht Mikroliter des Assay-Puffers bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Probe in 500 Mikroliter Assay-Puffer verdünnt und in den jeweiligen Kanal gegeben.Für die zweite Art von Kügelchen werden 0,8 Mikroliter Assay-Kügelchen mit einem ml Assay-Puffer gemischt und in den entsprechenden Kanal verabreicht. Die Kanäle werden geöffnet und mit niedrigem Druck gewaschen. Schalten Sie nun den Fanglaser ein.Um Perlen aufzufangen, werden die Laser voneinander entfernt und eine AD-Perle wird in Falle eins gefangen. Als nächstes wird die Stufe zum SA-Perlenkanal bewegt und eine Perle wird in Falle zwei gefangen. Um den Verlust der Perlen zu vermeiden oder eine zweite in derselben Falle zu fangen, wird die Bühne in den Pufferkanal verschoben und alle Kanäle werden geschlossen.Im Puffer wird eine Trap-Kalibrierung durchgeführt. Die gefangenen Perlen sollten als visuelle Vorlagen für nachfolgende Messungen festgelegt werden. Und der Ähnlichkeitswert sollte zwischen den Messungen über 90% gehalten werden, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.Schließlich werden die Perlen näher zusammengeschoben und man kann anfangen, ein einzelnes Seil zu fangen. Dies geschieht, indem die Perlen für einige Sekunden nahe bewegt werden und dann langsam wieder die Perlen verlassen werden. Eine Tetherbildung führt zu einer Erhöhung der gemessenen Kraft, wenn die beiden Perlen voneinander weggezogen werden.Die Anzahl und Qualität der Haltegurte kann überprüft werden, indem das überdehnte Plateau gefunden und die Flugbahn mit dem frei gelenkigen Ketten- oder wurmartigen Kettenmodell verglichen wird. Das überdehnte Plateau sollte zwischen 50 und 60 Piconewton für ein einzelnes Seil liegen. Um die Fluoreszenzmessungen durchzuführen, schalten Sie die konfokalen Laser und die Photonenzählung an der Einheits- und optischen Pinzette ein.Schalten Sie anschließend den Anregungslaser der gewünschten Wellenlänge und die Softwareschnittstelle ein und stellen Sie die Leistung des Lasers je nach Fluorophor auf 5% oder höher ein. Nun kann die Bildgebung über die Bild- oder Kymographenfunktionen der Software gestartet werden. Um gut fokussierte Bilder zu erhalten, stellen Sie sicher, dass die Brennebene des konfokalen Mikroskops und die optischen Fallen ausgerichtet sind.Zu diesem Zweck kann die Autofluoreszenz der Polystyrolperlen im blauen Laserkanal eingesetzt werden. Bewegen Sie sich mit der Brennebene der optischen Fallen auf und ab, bis die Autofluoreszenz der Perlen ihren höchsten Durchmesser erreicht. An dieser Stelle können die am angebundenen Molekül ablaufenden Fluoreszenzsignale detektiert werden.Für beide Funktionen ist es wichtig, die entsprechenden Interessensgebiete auszuwählen. Während der gesamten Messung kann die Pufferzusammensetzung leicht geändert werden, indem entweder die Kügelchen in verschiedene Kanäle bewegt werden oder indem der im mikrofluidischen System bereitgestellte Puffer geändert wird. Um Photobleichen zu vermeiden, schalten Sie den Anregungslaser immer aus, wenn Sie nicht messen.Die Rohdatenausgabe des Geräts enthält oft viel Rauschen. Um verstreute Daten weiter analysieren zu können, muss man sie daher zunächst vorverarbeiten. Der erste Schritt besteht darin, die Proben zu entnehmen und die Daten mit dem Tiefpass-Butterworth-Filter zu filtern, gute Ergebnisse wurden erzielt.Für Kraftrampenexperimente müssen die Entfaltungsereignisse an den entsprechenden gefalteten und entfalteten Bereichen der ersten Abstandskurve markiert werden, die mit wurmartigen Ketten- oder freigelenkten Kettenmodellen angebracht werden können. Für die konstanten Kraftdaten kann der Abstand über die Zeit aufgezeichnet werden und es ist nützlich, ein Histogramm zu erstellen, um die vorherrschende Konformation bei einer gegebenen Kraft zu quantifizieren. Hier wird gezeigt, dass die Filterparameter entscheidend sind, um verschiedene Falzzustände zu unterscheiden.Um besser zu verstehen, was mit dieser Technik erreicht werden kann, werden einige repräsentative Ergebnisse gezeigt. So sieht eine Standard-Kraft-Abstands-Kurve aus einem Kraftrampenexperiment aus. In diesem Fall haben wir das SARS-Coronavirus-2-Frame-Shifting-Element untersucht.Wir beobachteten die Entfaltung in mehreren Schritten um 15 Piconewton. Wenn die Richtung umgekehrt ist und die Perlen wieder näher kommen, faltet sich das Seil mit etwas geringerer Kraft wieder zurück. Als wir die gleiche RNA in Gegenwart des antiviralen Zinkfingerproteins ZAP maßen, wurde ein ähnliches Muster der Entfaltung beobachtet.Aber die sekundäre Struktur der RNA faltete sich nicht neu. Dies ist ein gutes Beispiel, um zu zeigen, welchen großen Einfluss die Proteinbindung auf die RNA-Kinetik haben kann. Anhand konstanter Kraftdaten kann die sich entfaltende Kinetik weiter untersucht werden.Die Entfernung über die Zeit wird für verschiedene Kräfte aufgetragen und das Histogramm der verschiedenen beobachteten Zustände wird auf der rechten Seite hinzugefügt. Bei 10 Piconewton befindet sich die RNA vollständig im gefalteten Zustand. Bei 11,5 Piconewton wechselt es zwischen den Zuständen, und bei 13 Piconewton befindet sich die RNA dauerhaft in einem entfalteten Zustand.Als jedoch das SARS-Coronavirus-2-Frame-Shifting-Element zusammen mit ZAP gemessen wurde, befand sich die RNA bei 11 Piconewton vollständig in einem entfalteten Zustand und zeigte bei 10 Piconewton sogar nur einen sehr geringen Übergang zu einem gefalteten Zustand. Dies deutet darauf hin, dass ZAP an das einzelsträngige Rahmenverschiebungselement bindet und die Bildung einer Sekundärstruktur verhindert. Schließlich werden wir uns einige optische Pinzettendaten in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie ansehen.In diesem Experiment wurde ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet, der doppelsträngige Nukleinsäuren markiert, nicht spezifisch mit zunehmender Kraft. Der Kymograph zeigt, dass, wenn die Perlen voneinander entfernt werden, die Fluoreszenzintensität zunimmt und vollständig verschwindet, sobald das Band zu stark gedehnt wird und bricht. In der letzten Abbildung wurden fluoreszierend markierte Ribosomen durch Kanal vier hinzugefügt.In diesem Experiment wurde eine spezifische Ribosomenbindung an den RNA-Tether beobachtet. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen einen Einblick in die optische Pinzette gegeben hat und was mit dieser unglaublichen Technik durchgeführt werden kann.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluoreszenzanisotropiemessungen als Werkzeug Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...