Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Ringraziamo Anuja Kibe e Jun. Prof. Redmond Smyth per aver esaminato criticamente il manoscritto. Ringraziamo Tatyana Koch per l'assistenza tecnica esperta. Ringraziamo Kristyna Pekarkova per l'aiuto nella registrazione di video sperimentali. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dall'Associazione Helmholtz e dal finanziamento della sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (CER) Nr. 948636 (a NC).

1. Preparazione del campione
<ol><li>Clonare la sequenza di interesse nel vettore contenente i frammenti di DNA Lambda, che fungono da sequenze di maniglia (Figura 2)43,50.</li>
	<li>Per prima cosa generare un modello di DNA per la successiva trascrizione in vitro tramite PCR (Figura 2B; reazione 1). In questa fase della PCR, il promotore T7 viene aggiunto all'estremità 5' de...

Qui, dimostriamo l'uso di pinzette ottiche accoppiate a fluorescenza per studiare le interazioni e il comportamento dinamico delle molecole di RNA con vari ligandi. Di seguito, vengono discussi i passaggi critici e le limitazioni della presente tecnica.
Passaggi critici nel protocollo Come per molti altri metodi, la qualità del campione è fondamentale per ottenere dati affidabili. Pertanto, per ottenere campioni della massima qualità possibile, vale la pena dedicare del ...

Il trasferimento di informazioni genetiche dal DNA alle proteine attraverso gli mRNA è un processo biochimico complesso, che è regolato con precisione a tutti i livelli attraverso interazioni macromolecolari all'interno delle cellule. Per la regolazione traslazionale, le interazioni RNA-proteina conferiscono un ruolo critico per reagire rapidamente a vari stimoli e segnali1,2. Alcune interazioni RNA-proteina influenzano la stabilità dell'mRNA e quindi alterano il tempo in cui un RNA è attivo per via traslazionale. Altre interazioni RNA-proteina sono associate a meccanismi di ricodifica come il readthrough stop-codone, il bypassing o il frameshifting ribosomiale programmato (PRF)3,4,5,6,7. Recentemente, un certo numero di proteine leganti l'RNA (RBP) hanno dimostrato di interagire con gli elementi dell'mRNA stimolatorio e il meccanismo di traduzione per dettare quando e quanta ricodifica si verificherà nella cellula7,8,9,10,11. Pertanto, per analizzare il ruolo delle proteine leganti l'RNA nella traduzione e il modo in cui modulano la struttura e la stabilità dell'RNA, è fondamentale studiare in dettaglio i principi di interazione e le proprietà meccaniche di questi complessi RNA-proteina.
Decenni di lavoro hanno gettato le basi per studiare il processo di traduzione multi-fase e multi-componente, che si basa su una comunicazione intricata tra l'RNA e i componenti proteici del meccanismo di traduzione per raggiungere velocità e precisione12,13,14. Un passo successivo cruciale nella comprensione di eventi normativi complessi è determinare le forze, i tempi e i determinanti strutturali durante la traduzione ad alta precisione12,15,16,17. Lo studio della dinamica conformazionale dell'RNA e in particolare di come i fattori ausiliari trans-agenti agiscono sulla struttura dell'RNA durante la traslazione sono stati ulteriormente illuminati dall'emergere di strumenti a singola molecola, tra cui pinzette ottiche o guide d'onda in modalità zero16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Le pinzette ottiche (OT) rappresentano una tecnica a singola molecola altamente precisa, che è stata applicata per studiare molti tipi di processi dinamici dipendenti dall'RNA, tra cui la trascrizione e la traduzione26,27,28,29,30,31,32. L'uso di pinzette ottiche ha permesso di sondare in dettaglio le interazioni molecolari, le strutture degli acidi nucleici e le proprietà termodinamiche, la cinetica e l'energetica di questi processi16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Il test delle pinzette ottiche si basa sull'intrappolamento di oggetti microscopici con un raggio laser focalizzato. In un tipico esperimento OT, la molecola di interesse è legata tra due perle trasparenti (di solito polistirene) (Figura 1A)27. Queste perle vengono poi catturate da trappole ottiche, che si comportano come molle. Pertanto, la forza applicata sulla molecola può essere calcolata in base allo spostamento del tallone dal centro del raggio laser focalizzato (centro trappola). Recentemente, le pinzette ottiche sono state combinate con la microscopia confocale (Figura 1B), consentendo misurazioni di fluorescenza o trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) 40,41,42. Questo apre un campo completamente nuovo di possibili esperimenti che consentono la misurazione simultanea e, quindi, una correlazione precisa della spettroscopia di forza e dei dati di fluorescenza.
Qui, dimostriamo esperimenti che utilizzano le pinzette ottiche combinate con la microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-RNA che regolano il frameshifting traslazionale. Tra l'obiettivo e il condensatore, una cella di flusso con cinque canali consente l'applicazione continua del campione con flusso laminare. Attraverso i canali microfluidici, vari componenti possono essere iniettati direttamente, il che riduce il tempo di hands-on e consente un consumo di campioni molto ridotto durante l'esperimento.
In primo luogo, viene proposta una linea guida di base per assistere la progettazione di esperimenti OT e vengono discussi i vantaggi e le insidie di varie configurazioni. Successivamente, viene descritta la preparazione di campioni e flussi di lavoro sperimentali e viene fornito un protocollo per l'analisi dei dati. Per rappresentare un esempio, delineiamo i risultati ottenuti da esperimenti di stretching dell'RNA per studiare l'elemento RNA frameshifting SARS-CoV-2 (Figura 2A) con il fattore trans-agente l'isoforma corta della proteina antivirale zinco-dito (ZAP), che altera la traduzione dell'RNA virale da un frame di lettura alternativo43. Inoltre, è dimostrato che i ribosomi marcati con fluorescenza possono essere impiegati in questo saggio confocale OT, che sarebbe utile per monitorare la processività e la velocità del macchinario di traduzione. Il metodo qui presentato può essere utilizzato per testare rapidamente l'effetto di diversi tamponi, ligandi o altri componenti cellulari per studiare vari aspetti della traduzione. Infine, vengono discusse le insidie sperimentali comuni e come risolverle. Di seguito, vengono delineati alcuni punti cruciali nella progettazione sperimentale.
Progettazione di costruzioni In linea di principio, ci sono due approcci comuni per creare un costrutto di RNA compatibile ot. Il primo approccio impiega una lunga molecola di RNA che viene ibridata con maniglie di DNA complementari, producendo così un costrutto costituito da due regioni ibride RNA / DNA che fiancheggiano una sequenza di RNA a singolo filamento nel mezzo (Figura 2B). Questo approccio è impiegato nella maggior parte degli esperimenti ot RNA33,44,45.
Il secondo approccio sfrutta le maniglie dsDNA con sporgenze corte (circa 20 nt)15,17. Queste sporgenze vengono poi ibridate con la molecola di RNA. Sebbene più complicato nella progettazione, l'uso di maniglie dsDNA supera alcune delle limitazioni del sistema ibrido DNA / RNA. In linea di principio, è possibile implementare anche maniglie molto lunghe (>10kb), il che è più conveniente per le misurazioni confocali. Inoltre, la molecola di RNA può essere legata alle maniglie del DNA per aumentare la stabilità del legame.
Strategia di etichettatura finale Il costrutto deve essere legato a perline tramite una forte interazione molecolare. Mentre ci sono approcci disponibili per il legame covalente delle maniglie alle perline46, interazioni forti ma non covalenti come streptavidina-biotina e digoxigenina-anticorpo sono comunemente usate negli esperimenti OT15,33,35,45. Nel protocollo descritto, il costrutto è etichettato con biotina o digossigenina e le perline sono rivestite rispettivamente con streptavidina o anticorpi contro la digossigenina (Figura 1A). Questo approccio sarebbe adatto per applicare forze fino a circa 60 pN (per tether)47. Inoltre, l'uso di diverse strategie di etichettatura 5' e 3' consente di determinare l'orientamento del cavo formato tra le perline17.
Etichettatura delle proteine per misure di fluorescenza Per l'imaging confocale, ci sono diversi approcci comunemente usati per l'etichettatura a fluorescenza. Ad esempio, i fluorofori possono essere attaccati covalentemente a residui di amminoacidi che si trovano nativamente nelle proteine o introdotti dalla mutagenesi diretta dal sito attraverso un gruppo organico reattivo. I coloranti tiolici o ammino-reattivi possono essere utilizzati per l'etichettatura dei residui di cisteina e lisina, rispettivamente. Esistono diversi metodi di protezione reversibili per aumentare la specificità dell'etichettatura48,49, tuttavia le proteine native sarebbero tipicamente etichettate a più residui. Sebbene le piccole dimensioni del fluoroforo possano conferire un vantaggio, l'etichettatura non specifica potrebbe interferire con l'attività proteica e quindi l'intensità del segnale potrebbe variare49. Inoltre, a seconda dell'efficienza di etichettatura, l'intensità del segnale può differire tra i diversi esperimenti. Pertanto, un controllo dell'attività deve essere eseguito prima dell'esperimento.
Nel caso in cui la proteina di interesse contenga un tag N- o C-terminale, come un His-tag o strep-tag, l'etichettatura specifica di questi tag rappresenta un altro approccio popolare. Inoltre, l'etichettatura mirata ai tag riduce la possibilità che il fluoroforo interferisca con l'attività proteica e può migliorare la solubilità49. Tuttavia, l'etichettatura specifica del tag di solito produce proteine marcate con monofluoroforo, che potrebbero essere difficili da rilevare. Un altro modo di etichettatura specifica può essere realizzato impiegando anticorpi.
Configurazione della microfluidica La combinazione di OT con un sistema di microfluidica consente una rapida transizione tra diverse condizioni sperimentali. Inoltre, i sistemi di corrente sfruttano il mantenimento del flusso laminare all'interno della cella di flusso, che preclude la miscelazione di liquidi da altri canali nella direzione perpendicolare rispetto alla direzione del flusso. Pertanto, il flusso laminare è particolarmente vantaggioso per la progettazione sperimentale. Attualmente, le celle di flusso con un massimo di 5 canali sono comunemente utilizzate (Figura 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

L'RNA adotta diverse pieghe strutturali, che sono essenziali per le sue funzioni e quindi possono avere un impatto su diversi processi nella cellula. Inoltre, la struttura e la funzione di un RNA possono essere modulate da vari fattori trans-agenti, come proteine, metaboliti o altri RNA. Le molecole di RNA frameshifting, ad esempio, sono RNA regolatori situati in regioni codificanti, che dirigono la traduzione dei ribosomi in un frame di lettura aperto alternativo, e quindi agiscono come interruttori genici. Possono anche adottare pieghe diverse dopo il legame a proteine o altri fattori trans. Per analizzare il ruolo delle proteine leganti l'RNA nella traduzione e il modo in cui modulano la struttura e la stabilità dell'RNA, è fondamentale studiare contemporaneamente l'interazione e le caratteristiche meccaniche di questi complessi RNA-proteina. Questo lavoro illustra come impiegare pinzette ottiche accoppiate a singola molecola-fluorescenza per esplorare il panorama conformazionale e termodinamico dei complessi RNA-proteina ad alta risoluzione. Ad esempio, viene elaborata l'interazione dell'elemento di frameshifting ribosomiale programmato SARS-CoV-2 con l'isoforma breve del fattore trans-agente della proteina antivirale zinco-dito. Inoltre, i ribosomi marcati con fluorescenza sono stati monitorati utilizzando l'unità confocale, che alla fine avrebbe permesso lo studio dell'allungamento della traduzione. Il test OT accoppiato a fluorescenza può essere ampiamente applicato per esplorare diversi complessi RNA-proteina o fattori trans-agenti che regolano la traduzione e potrebbe facilitare gli studi sulla regolazione genica basata sull'RNA.

In questa sezione, l'attenzione si concentra principalmente sulle misurazioni delle interazioni RNA-proteina/ligando da parte delle pinzette ottiche a fluorescenza. Per una descrizione degli esperimenti generali sulle pinzette ottiche a RNA e dei corrispondenti risultati rappresentativi, vedere32. Per una discussione più dettagliata delle interazioni RNA/DNA-proteina, vedere anche1,2,26,59,60....

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Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro sperimentale completo per lo studio delle interazioni RNA-proteina utilizzando pinzette ottiche. Sono delineate diverse possibili configurazioni sperimentali, tra cui la combinazione di pinzette ottiche con microscopia confocale.

Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

L'obiettivo generale del seguente articolo sul metodo è quello di dimostrare un protocollo utile per studiare le interazioni dell'RNA con proteine o altri fattori utilizzando pinzette ottiche accoppiate con microscopia confocale. Negli ultimi dieci anni, sono state sviluppate diverse tecniche sofisticate per studiare le proprietà delle singole macromolecole. Una di queste tecniche sono le pinzette ottiche a singola molecola.Con le nuove pinzette ottiche assistite da fluorescenza, non solo le forze necessarie per lo spiegamento delle molecole di RNA, ma anche gli eventi di legame durante la traduzione possono essere monitorati in dettaglio. Qui ci concentriamo sulle misurazioni in cui le molecole di RNA sono allungate con e senza fattori di transazione che regolano la traduzione. Illustriamo anche come la tecnica può essere applicata per monitorare la traduzione utilizzando ribosomi etichettati.Il protocollo sarà dimostrato da due studenti laureati del mio gruppo, Lukas Pekarek e Stefan Park. In questo video, ti guideremo attraverso la configurazione e l'esecuzione di un esperimento di pinzette ottiche. Descriviamo anche il semplice flusso di lavoro di analisi dei dati.Il vantaggio di questa tecnica è che è semplice e robusta. Una molecola è legata tra due perline, legata al fuoco dei raggi laser, e il cambiamento e la forza allo spostamento possono essere misurati con precisione nei cosiddetti esperimenti di rampa di forza. Le strutture secondarie all'interno di un cavo si dispiegano a una certa forza a seconda dell'energia interna della molecola.Questa transizione dinamica tra più strutture può essere ulteriormente studiata con misurazioni di forza costante. Inoltre, l'uso parallelo dell'imaging fluorescente può essere utilizzato per visualizzare gli eventi di legame in tempo reale. Un profilo di forza-distanza distinto di un cavo potrebbe variare dopo il legame di potenziali fattori di transazione che influenzano la sua stabilità.In primo luogo, l'RNA di interesse deve essere clonato in un vettore di DNA. A monte e a valle di questa sequenza, sono necessarie parti aggiuntive, le maniglie per legare il costrutto finale DNA-RNA tra le perle. Dopo aver superato con successo la clonazione e l'amplificazione del plasmide, vengono eseguite tre diverse reazioni PCR.Per ogni reazione PCR, mescolare i reagenti secondo la tabella uno del protocollo. Eseguire la PCR in aliquote da 50 microlitri in un appropriato termociclatore. Il primo si traduce in un DNA a doppio filamento dell'intero costrutto con il promotore T7 per la successiva trascrizione in vitro.La seconda PCR produce le cinque maniglie principali. Mentre l'ultima reazione si traduce nelle tre maniglie principali. Sia 5 maniglie prime che 3 prime devono essere etichettate in base alle perline utilizzate.Le tre maniglie principali sono etichettate durante la PCR utilizzando un primer inverso marcato con digossigenina e le cinque maniglie prime devono essere etichettate in un passaggio aggiuntivo attraverso la biotinilazione. La biotinilazione a tre primi delle cinque maniglie prime viene eseguita utilizzando T 40 e una polimerasi. La reazione viene eseguita per una o due ore a temperatura ambiente.Quindi, eseguire la trascrizione in vitro utilizzando la polimerasi T7. Incubare la reazione a 37 gradi per due o quattro ore, a seconda della lunghezza dell'RNA. In un'ultima fase, le maniglie vengono ricotte con l'RNA dalla trascrizione in vitro per ottenere il costrutto finale DNA-RNA con la singola regione di interesse a filamento tra le maniglie a doppio filamento.Per ricottura dell'ibrido RNA-DNA desiderato, mescolare le maniglie e l'RNA nel tampone di ricottura. Riscaldare, la miscela di ricottura fino a 85 gradi per 10 minuti, quindi raffreddare lentamente il campione a quattro gradi. Mescolare il campione ricotto con 1/10 di volume di tre molari acetato di sodio e tre volumi di etanolo ghiacciato e incubare meno 80 gradi per almeno un'ora.Centrifugare i campioni a 15.000 xg per 30 minuti a quattro gradi. Scartare il surnatante e asciugare il pellet sotto vuoto. Piccole aliquote del pellet risospeso vengono congelate in azoto liquido e mantenute a meno 80 gradi fino a quando non vengono utilizzate.Per prima cosa rimuovere la candeggina dalle siringhe e riempire un mL di acqua priva di RNasi. Aggiungere 50 microlitri di 0,5 tiosolfato di sodio molare e lavare il sistema con una barra. Fare attenzione che il sistema microfluidico non si esaurisca mai per evitare bolle d'aria nel sistema.Quindi, scartare la soluzione rimanente di tiosolfato di sodio e sostituire le siringhe con quelle nuove. Quindi lavare di nuovo con almeno 0,5 ml di acqua priva di RNase. Per impostare il sistema ottico della macchina, mettere due gocce di olio di immersione sull'obiettivo.Mettere la cella di flusso in posizione e aumentare l'obiettivo fino a quando il liquido tocca la cella di flusso. Quindi mettere due gocce di olio per immersione sopra la cella di flusso. Ora accendi l'unità di guida della trappola e il laser di intrappolamento.L'obiettivo viene regolato utilizzando lo strumento Z finder delle telecamere diagnostiche della macchina. Ruotando la microvite, l'asse Z viene regolato al centro della camera tra la seconda e la terza riflessione. Dove gli anelli di rifrazione sono i più grandi.Passare le telecamere diagnostiche alla modalità luna e ridurre il laser di intrappolamento a circa il 50%, quindi abbassare il condensatore e regolarne la posizione in modo da vedere circa 10 bande luminose. La camera di misura ha cinque canali e, prima dell'esperimento, dovrebbero essere prese in considerazione diverse possibilità di configurazione. Per un semplice esperimento di rampa di forza, perline-buffer-perline è una comoda disposizione del canale.Per le misurazioni con il quarto composto, come i ribosomi fluorescenti o i fattori di transazione, il fattore tampone di perline-perline è una disposizione migliore, ma rende più difficile catturare le perline. Un'aliquota del costrutto ricotto viene incubata con tre microlitri di sospensione di perline AD, un microlitro inibitori della RNasi e otto microlitro del tampone di dosaggio a temperatura ambiente per 10-20 minuti. Quindi il campione viene diluito in un tampone di dosaggio da 500 microlitri e inserito nel rispettivo canale.Per il secondo tipo di perline, 0,8 microlitri di perle di saggio vengono miscelati con un mL di tampone di saggio e somministrati nel canale corrispondente. I canali vengono aperti e lavati a bassa pressione. Ora accendi il laser di intrappolamento.Per catturare le perline, i laser vengono spostati l'uno dall'altro e una perla AD viene catturata nella trappola uno. Successivamente lo stadio viene spostato sul canale di perline SA e una perla viene catturata nella trappola due. Per evitare di perdere le perline o di catturarne una seconda nella stessa trappola, lo stadio viene spostato sul canale buffer e tutti i canali vengono chiusi.Nel buffer viene eseguita una calibrazione della trappola. Le perle catturate dovrebbero essere impostate come modelli visivi per le misurazioni successive. E il punteggio di somiglianza dovrebbe essere mantenuto al di sopra del 90% tra le misurazioni per garantire la comparabilità.Infine, le perline vengono avvicinate e si può iniziare a catturare un singolo laccio. Questo viene fatto spostando le perline vicino per alcuni secondi e poi lentamente lasciare le perline di nuovo. Una formazione di cavi si traduce in un aumento della forza misurata dopo aver tirato le due perle lontano l'una dall'altra.Il numero e la qualità dei cavi possono essere controllati trovando il plateau di sovraccarico e confrontando la traiettoria con la catena liberamente giuntata o il modello di catena simile a un verme. L'altopiano di sovraccarico dovrebbe essere compreso tra 50 e 60 piconewton per un singolo cavo. Per eseguire le misure di fluorescenza, accendere i laser confocali e il conteggio dei fotoni sull'unità e sulla pinzetta ottica.Successivamente, accendere il laser di eccitazione della lunghezza d'onda desiderata e l'interfaccia software e impostare la potenza del laser al 5% o superiore, a seconda del fluoroforo. Ora l'imaging può essere avviato utilizzando le funzioni di immagine o kymograph del software. Per ottenere immagini ben focalizzate, assicurarsi che il piano focale del microscopio confocale e le trappole ottiche siano allineati.A tale scopo, è possibile utilizzare l'autofluorescenza delle perle di polistirene nel canale laser blu. Muoviti su e giù con il piano focale delle trappole ottiche fino a quando l'autofluorescenza delle perline raggiunge il suo diametro più alto. In questa posizione, i segnali di fluorescenza che avvengono alla molecola legata possono essere rilevati.Per entrambe le funzioni è importante selezionare le regioni di interesse appropriate. In tutta la composizione del buffer di misura può essere facilmente modificata spostando le perline su canali diversi o cambiando il buffer fornito nel sistema microfluidico. Per evitare il fotosbiancamento, spegnere sempre il laser di eccitazione quando non si misura.L'output di dati grezzi dal dispositivo spesso contiene molto rumore. Pertanto, al fine di analizzare ulteriormente i dati sparsi, è necessario prima pre-elaborarli. Il primo passo è quello di abbassare il campione e filtrare i dati con il filtro Butterworth passa-basso, sono stati ottenuti buoni risultati.Per gli esperimenti di rampa di forza, gli eventi che si dispiegano devono essere contrassegnati nelle corrispondenti regioni piegate e spiegate della prima curva di distanza possono essere montate utilizzando modelli a catena a forma di verme o a catena liberamente articolata. Per i dati di forza costante, la distanza nel tempo può essere tracciata ed è utile generare un istogramma per quantificare la conformazione predominante ad una data forza. Qui viene mostrato che i parametri del filtro sono cruciali per distinguere i diversi stati di piegatura.Per comprendere meglio cosa si può ottenere con questa tecnica, vengono mostrati alcuni risultati rappresentativi. Ecco come appare una curva forza-distanza standard da un esperimento forza-rampa. In questo caso, abbiamo studiato l'elemento di spostamento del telaio SARS-coronavirus-2.Abbiamo osservato lo svolgimento in più fasi intorno a 15 piconewton. Quando la direzione è invertita e le perline si avvicinano di nuovo, il cavo si ripiega a una forza leggermente inferiore. Quando abbiamo misurato lo stesso RNA in presenza della proteina antivirale ZAP del dito di zinco, è stato osservato un modello simile di dispiegamento.Ma la struttura secondaria dell'RNA non si è ripiegata. Questo è un buon esempio per mostrare quale grande influenza può avere il legame proteico sulla cinetica dell'RNA. Osservando i dati di forza costante, la cinetica di dispiegamento può essere ulteriormente studiata.La distanza nel tempo viene tracciata per diverse forze e l'istogramma dei diversi stati osservati viene aggiunto sulla destra. A 10 piconewton, l'RNA è completamente nello stato piegato. A 11,5 piconewton passa da uno stato all'altro, e a 13 piconewton l'RNA è permanentemente in uno stato dispiegato.Tuttavia, quando l'elemento di spostamento del frame SARS-coronavirus-2 è stato misurato insieme a ZAP, l'RNA era completamente in uno stato dispiegato a 11 piconewton e ha persino mostrato pochissima transizione verso uno stato piegato a 10 piconewton. Ciò indica che ZAP si lega al singolo elemento di spostamento del telaio a trefoli e impedisce la formazione di una struttura secondaria. Infine, esamineremo alcuni dati delle pinzette ottiche accoppiati con la microscopia confocale.In questo esperimento, è stato utilizzato un colorante fluorescente che etichetta gli acidi nucleici a doppio filamento, non specificamente con forza crescente. Il kymograph mostra che quando le perle vengono spostate l'una dall'altra, l'intensità della fluorescenza aumenta e scompare completamente una volta che il cavo è allungato troppo e si rompe. Nell'ultima figura sono stati aggiunti ribosomi marcati in modo fluorescente attraverso il canale quattro.In questo esperimento è stato osservato un legame specifico del ribosoma al legame dell'RNA. Speriamo che questo video ti abbia dato un'idea delle pinzette ottiche e di cosa si può eseguire questa incredibile tecnica.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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