Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

原稿を批判的に見直してくれたアヌジャ・キベ教授とレドモンド・スミス教授に感謝します。私たちは、専門家の技術支援のためにタチアナ・コッホに感謝します。私たちは、実験的なビデオを記録する助けのためにクリスティナペカルコワに感謝します.当研究室での研究は、ヘルムホルツ協会と欧州研究評議会(ERC)グラント・Nr・948636(NC)からの資金提供によって支援されています。

1. サンプル準備
<ol><li>対象の配列を、ハンドル配列として機能するラムダDNAフラグメントを含むベクターにクローン化します(図2)43,50。</li>
	<li>まず、PCRを介して後続 のインビトロ 転写用のDNAテンプレートを生成する(図2B;反応1)。このPCRステップでは、T7プロモーターがセンスDNA分?...

ここでは、蛍光結合型光ピンセットを用いて、RNA分子と様々なリガンドの相互作用と動的挙動を研究する方法を示す。以下に、本技術の重要なステップと限界について説明します。
プロトコルの重要なステップ 他の多くの方法と同様に、サンプルの品質は信頼性の高いデータを得るために極めて重要です。したがって、可能な限り最高の品質のサンプル?...

mRNAを介したDNAからタンパク質への遺伝情報の伝達は、細胞内の高分子相互作用を通じてあらゆるレベルで正確に調節される複雑な生化学的プロセスです。翻訳調節では、RNAとタンパク質の相互作用は、様々な刺激およびシグナルに迅速に反応する重要な役割を与える1,2。RNAとタンパク質の相互作用の中には、mRNAの安定性に影響を与え、RNAが翻訳的に活性である時間を変化させるものがあります。他のRNA-タンパク質相互作用は、ストップコドンの読み取り、バイパス、またはプログラムリボソームフレームシフト(PRF)3,4,5,6,7などの再コードメカニズムに関連しています。最近では、多くのRNA結合タンパク質(RRP)が、細胞内でいつ、どのくらいのリコードが起こるかを決定するために、刺激性mRNA要素および翻訳機械と相互作用することが実証されています7,8,9,10,11。したがって、翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNA構造および安定性を調節する方法を解剖するためには、RNA-タンパク質複合体の相互作用原理と機械的特性を詳細に研究することが極めて重要です。
数十年にわたる作業は、速度と精度を達成するために翻訳機械のRNAとタンパク質成分の間の複雑なコミュニケーションに依存する翻訳のマルチステップおよびマルチコンポーネントプロセスを研究するための基礎を築いてきました12,13,14。複雑な規制事象を理解するうえで重要な次のステップは、翻訳中の力、タイムスケール、構造決定要因を高精度で決定することです12,15,16,17。RNAの立体構造ダイナミクス、特に翻訳中のRNA構造に対するトランス作用補助因子の作用の研究は、光ピンセットやゼロモードの導波ガイドを含む単分子ツールの出現によってさらに明るやかされています16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
光ピンセット(OT)は、転写を含む多くの種類のRNA依存性動的プロセスを研究するために適用された非常に正確な単分子技術を表し、翻訳26,28,28,29,30,31,32。光ピンセットの使用により、分子相互作用、核酸構造、熱力学的特性、運動論、およびこれらのプロセスのエネルギーの詳細な調査が可能になりました17,22,33,34,35,36,37,38,39 .光ピンセットアッセイは、焦点を合わせるレーザービームを有する微視的な物体の封じ込めに基づいている。典型的なOT実験では、目的の分子は2つの透明(通常はポリスチレン)ビーズ(図1A)27の間につながれである。これらのビーズは、その後、スプリングのように動作する光学トラップによってキャッチされます。したがって、分子に適用される力は、焦点を合わせるレーザー光(トラップ中心)の中心からのビードの変位に基づいて計算することができる。近年、光ピンセットを共焦点顕微鏡(図1B)と組み合わせて、蛍光またはフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)測定40,41,42を可能にしました。これにより、同時測定が可能な実験の全く新しい分野が開き、力分光法と蛍光データの正確な相関が可能になります。
ここでは、光ピンセットと共焦点顕微鏡を組み合わせて、並進フレームシフトを調節するタンパク質とRNAの相互作用を研究する実験を行う。目的と凝縮器の間に、5つのチャネルを持つフローセルは、層流を用いた連続的なサンプル塗布を可能にする。マイクロ流体チャネルを介して、様々な成分を直接注入することができ、実験全体を通してサンプル消費をほとんど行わず、実践的な時間を短縮します。
まず、OT実験の設計を支援する基本的なガイドラインを提案し、様々なセットアップの落とし穴と同様に利点を議論する。次に、サンプルの調製と実験ワークフローについて説明し、データ分析のためのプロトコルを提供する。例を示すために、代替読み取りフレーム43からのウイルスRNAの翻訳を変化させるジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質(ZAP)のトランス作用因子を用いてSARS-CoV-2フレームシフトRNA元素(図2A)を研究するRNAストレッチ実験から得られた結果を概説する。さらに、このOT共焦点アッセイでは蛍光標識リボソームを採用できることが実証されており、翻訳機械の加工性と速度を監視するのに役立ちます。ここで提示される方法は、翻訳のさまざまな側面を研究するために、異なるバッファー、リガンド、または他の細胞成分の効果を迅速にテストするために使用することができます。最後に、一般的な実験的な落とし穴と、それらのトラブルシューティング方法について説明します。以下に、実験計画の重要なポイントを概説します。
設計の構築 原則として、OT適合性RNA構築物を作成するための2つの一般的なアプローチがあります。最初のアプローチは、相補的なDNAハンドルとハイブリダイズされる長いRNA分子を採用し、したがって、真ん中に一本鎖RNA配列を横切る2つのRNA/DNAハイブリッド領域からなる構築物を生み出す(図2B)。このアプローチは、ほとんどのOT RNA実験で33,44,45に採用されています。
2 番目のアプローチでは、dsDNA ハンドルの短い (約 20 nt) のオーバーハング数 15,17 を利用します。これらのオーバーハングは、RNA分子とハイブリダイズされます。設計は複雑ですが、dsDNAハンドルを使用すると、DNA/RNAハイブリッドシステムの制限を克服できます。原則として、非常に長いハンドル(>10kb)でも実装できるため、共焦点測定に便利です。さらに、RNA分子をDNAハンドルに連結してテザー安定性を高めることができる。
エンドラベリング戦略 構築物は強い分子相互作用によってビーズにつながれなければならない。ハンドルの共有結合にはbeads46へのアプローチがありますが、ストレプトアビジン-ビオチンおよびジゴキシゲニン抗体などの強いが非共有的な相互作用は、OT実験15,33,35,45で一般的に使用されています。記載されたプロトコルにおいて、構築物はビオチンまたはジゴキシゲニンで標識され、ビーズは、それぞれ、ジゴキシゲニンに対するストレプトアビジンまたは抗体でコーティングされる(図1A)。このアプローチは、最大約60pN(テザー当たり)47の力を加えるのに適しています。さらに、異なる5'および3'ラベル付け戦略を使用することで、ビーズ17の間に形成されるテザーの方向を決定することができる。
蛍光測定用タンパク質標識 共焦点イメージングでは、蛍光標識にはいくつかの一般的に使用されるアプローチがあります。例えば、フルオロフォアは、タンパク質に自在に見られるアミノ酸残基に共有結合したり、反応性有機基を介して部位特異的突然変異誘発によって導入されたりする。チオールまたはアミン反応性染料は、システイン残基およびリジン残基の標識にそれぞれ使用できる。標識48,49の特異性を高めるための可逆的な保護方法はいくつかありますが、ネイティブタンパク質は通常、複数の残基で標識されます。蛍光素の小さなサイズは利点を与えるかもしれませんが、非特異的標識はタンパク質活性を妨げる可能性があり、したがってシグナル強度は49変わることがあります。また、標識効率に応じて信号強度が異なる実験によって異なる場合がある。したがって、実験の前にアクティビティチェックを実行する必要があります。
目的のタンパク質に His タグやストレップ タグなどの N または C 端子タグが含まれている場合、これらのタグの特定の標識は別の一般的なアプローチを表します。さらに、タグ標的標識は、フルオロフォアがタンパク質活性を妨害する可能性を低減し、溶解度49を高めることができる。しかし、タグ特異的標識は通常、モノフルオロフォア標識タンパク質を生み出し、検出が困難である可能性があります。特異的標識の別の方法は、抗体を採用することによって達成することができる。
マイクロ流体セットアップ OTとマイクロ流体システムの組み合わせにより、異なる実験条件間の迅速な移行が可能になります。さらに、現在のシステムはフローセル内の層流を維持することを利用し、流れ方向に対して垂直方向の他のチャネルからの液体の混合を妨げる。そのため、層流は実験計画に特に有利である。現在、最大5チャンネルのフローセルが一般的に使用されています(図3)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNAは、その機能に不可欠な多様な構造フォールドを採用しており、細胞内の多様なプロセスに影響を与える可能性があります。また、RNAの構造と機能は、タンパク質、代謝物、または他のRNAなどの様々な トランス作用因子によって変調することができます。例えば、フレームシフトRNA分子は、リボソームを別のオープンリーディングフレームに直接翻訳し、遺伝子スイッチとして機能するコード領域に位置する調節RNAです。彼らはまた、タンパク質または他の トランスファクターに結合した後に異なる折り目を採用することができます。翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNAの構造と安定性を調節する方法を解剖するには、これらのRNA-タンパク質複合体の相互作用と機械的特徴を同時に研究することが重要です。この研究は、単分子蛍光結合光ピンセットを採用して、RNA-タンパク質複合体の立体構造および熱力学的景観を高解像度で探索する方法を示しています。一例として、SARS-CoV-2プログラムリボソームフレームシフトエレメントと、ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質の 経作用因子短いアイソフォームとの相互作用が詳述される。さらに、蛍光標識リボソームを共焦点単位でモニタリングし、最終的に翻訳伸びの研究を可能にした。蛍光結合OTアッセイは、多様なRNAタンパク質複合体または翻訳を調節する トランス作用因子を探索するために広く適用することができ、RNAベースの遺伝子調節の研究を容易にする可能性があります。

このセクションでは、主に蛍光光ピンセットによるRNA-タンパク質/リガンド相互作用の測定に焦点を当てています。一般的なRNA光学ピンセット実験および対応する代表的な結果の説明については、32を参照してください。RNA/DNA-タンパク質相互作用の詳細については、1,26,59,60も参照してくださ?...

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Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

このプロトコルは、光ピンセットを用いたRNAとタンパク質の相互作用を研究するための完全な実験的ワークフローを提示する。光ピンセットと共焦点顕微鏡の組み合わせを含むいくつかの可能な実験セットアップが概説されている。

翻訳調節におけるRNA-タンパク質相互作用を研究する光ピンセット

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

次の方法の記事の全体的な目標は、共焦点顕微鏡と結合された光ピンセットを用いて、タンパク質または他の因子とのRNA相互作用を研究するのに有用なプロトコルを実証することです。過去10年間で、単一の高分子の特性を調べるためのいくつかの洗練された技術が開発されました。これらの技術の1つは、単一分子光ピンセットである。新しい蛍光支援光ピンセットを使用すると、RNA分子の展開に必要な力だけでなく、翻訳中の結合事象も詳細に監視できます。ここでは、RNA分子が翻訳を調節する取引因子の有無にかかわらず伸ばされる測定に焦点を当てます。また、ラベル付きリボソームを用いた翻訳を監視する方法についても説明します。このプロトコルは、私のグループの2人の大学院生、ルーカス・ペカレクとステファン・パークによって実証されます。このビデオでは、光ピンセット実験のセットアップと実行について説明します。また、単純なデータ分析ワークフローの概要も説明します。この手法の利点は、簡単で堅牢な方法です。分子は2つのビーズの間につながれ、レーザービームの焦点に縛られ、変位時の変化と力は、いわゆるフォースランプ実験で正確に測定することができます。テザー内部の二次構造は、分子の内部エネルギーに応じてある程度の力で展開します。複数の構造間のこの動的な遷移は、一定の力の測定によってさらに調査することができる。さらに、蛍光イメージングの並列使用により、結合事象をリアルタイムで可視化することができます。テザーの明確な力距離プロファイルは、安定性に影響を与える潜在的な取引因子の結合後に変化する可能性があります。まず、目的のRNAをDNAベクターにクローン化する必要があります。この配列の上流および下流では、追加の部品、ハンドルがビーズ間の最終的なDNA-RNA構築物をテザーするために必要である。プラスミドのクローニングと増幅が成功した後、3つの異なるPCR反応が行われます。PCR反応ごとに、プロトコルの表1に従って試薬を混合します。適切なサーマルサイクラーで50マイクロリットルのアリコートでPCRを実行します。最初の1つは、その後のインビトロ転写のためのT7プロモーターを有する全構築物の二本鎖DNAをもたらす。2 番目の PCR では、5 つの素数ハンドルが生成されます。一方、最後の反応は3つの素数ハンドルで生じる。5素数および3素数ハンドルの両方が使用されるビーズに従ってラベル付けする必要があります。3つの素数ハンドルは、ジゴキシゲニン標識リバースプライマーを使用してPCR中に標識され、5つの素数ハンドルはビオチン化を通して余分なステップでラベル付けする必要があります。5つの素数ハンドルの3つのプライムビオチン化は、T40およびポリメラーゼを用いて行われる。反応は室温で1〜2時間行う。次に、T7ポリメラーゼを用いてインビトロ転写を行う。RNAの長さに応じて、反応を37度から4時間インキュベートします。最後の1つのステップでは、ハンドルは、二本鎖ハンドル間の関心のある単一鎖領域を有する最終的なDNARNA構築物を得るために、インビトロ転写からRNAでアニールされます。目的のRNA-DNAハイブリッドをアニールするには、ハンドルとRNAをアニーリングバッファーに混ぜます。熱、焼鈍混合物を85度まで10分間加熱し、サンプルをゆっくりと4度に冷却する。アニールサンプルを酢酸臼歯3ナトリウムの1/10体積と、氷冷エタノール3ボリュームと混合し、少なくとも1時間はマイナス80度のインキュベートを行います。サンプルを15,000 xgで4度で30分間遠心する。上清を捨て、ペレットを真空下で乾燥させます。再懸濁されたペレットの小さなアリコートは液体窒素で凍結され、使用されるまでマイナス80度に保たれる。まず注射器から漂白剤を取り出し、RNaseフリーウォーターの1mLを埋めます。0.5モルナトリウムチオ硫酸ナトリウムの50マイクロリットルを追加し、1つのバーでシステムを洗います。マイクロ流体システムは、システム内の気泡を避けるために、乾燥して実行することはありません注意してください。次に、残りのチオ硫酸ナトリウム溶液を廃棄し、注射器を新しいものに交換します。その後、RNaseフリー水の少なくとも0.5mLで再び洗浄します。機械の光学系をセットアップするには、目的に浸漬油を2滴入れます。フローセルを所定の位置に置き、液体がフローセルに触れるまで目的を上げます。その後、フローセルの上に浸漬油を2滴入れます。トラップステアリングユニットとトラッピングレーザーをオンにします。目的は、マシンの診断カメラのZファインダーツールを使用して調整されます。マイクロスクリューを回すことで、Z軸は第2と第3の反射の間のチャンバの中央に調節される。屈折リングが最大である場所。診断カメラをムーンモードに切り替え、トラップレーザーを約50%に減らしてから、凝縮器を下げ、約10個の光バンドが見える位置を調整します。測定室には5つのチャネルがあり、実験の前に、異なるセットアップの可能性を考慮する必要があります。単純なフォースランプ実験では、ビーズバッファビーズは便利なチャネル配置です。蛍光リボソームや取引因子などの第4化合物を用いた測定では、ビーズ緩衝因子はより良い配置ですが、ビーズを捕まえるのが難しくなります。アニール構造のアリコートは、3マイクロリットルADビーズ懸濁液、1マイクロリットルRNase阻害剤、および8マイクロリットルのアッセイバッファーを室温で10〜20分間インキュベートする。次いで、サンプルを500マイクロリットルアッセイバッファーで希釈し、それぞれのチャネルに入れます。第2種のビーズについては、0.8マイクロリットルのアッセイビーズをアッセイバッファーの1 mLと混合し、対応するチャネルに投与する。チャネルは開かれ、低い圧力で洗浄される。今、トラップレーザーをオンにします。ビーズをキャッチするには、レーザーが互いに離れて移動し、ADビーズがトラップ1に巻き込まれる。次に、ステージは SA ビーズ チャネルに移動し、ビードはトラップ 2 に捕らえます。ビーズを失うことを避けるため、または同じトラップで 2 つ目のビードをキャッチするために、ステージはバッファー チャネルに移動され、すべてのチャネルが閉じられます。バッファ内では、トラップキャリブレーションが実行されます。キャッチビードは、後続の測定のための視覚的なテンプレートとして設定する必要があります。類似性スコアは、比較可能性を保証するために、測定値間で90%以上に保つ必要があります。最後に、ビーズを近づけて、1つのテザーを捕まえることができます。これは、数秒間ビーズを近くに移動し、ゆっくりと再びビーズを出発します。テザー形成は、2つのビーズを互いに引き離した場合に測定力の増加をもたらす。テザーの数と品質は、伸縮高原を見つけ、軌道を自由に関節鎖またはワーム状の鎖モデルと比較することによって確認することができる。過延伸高原は、単一のテザーに対して50〜60ピコニュートンの間でなければなりません。蛍光測定を行うためには、ユニットと光ピンセットマシンの共焦点レーザーと光子数をオンにします。その後、所望の波長とソフトウェアインターフェースの励起レーザーをオンにし、蛍光色素に応じてレーザーのパワーを5%以上に設定します。ソフトウェアの画像または動体機能を使用してイメージングを開始できるようになりました。焦点を合わせた画像を得るためには、共焦点顕微鏡と光学トラップの焦点面が揃っていることを確認してください。この目的のために、青色レーザーチャネルにおけるポリスチレンビーズの自己蛍光を採用することができる。ビーズの自己蛍光が最高径になるまで、光トラップの焦点面で上下に移動します。この位置では、テザーリングされた分子で起こる蛍光信号を検出することができます。どちらの機能でも、適切な領域を選択することが重要です。測定バッファー組成物全体を通して、ビーズを異なるチャネルに移動するか、マイクロ流体システムで供給されるバッファーを変更することによって容易に変更できます。光の消光を避けるために、測定しない場合は必ず励起レーザーをオフにしてください。デバイスからの生データ出力には、多くの場合、多くのノイズが含まれています。したがって、散乱データをさらに解析するために、まずそれらを事前処理する必要があります。最初のステップは、ローパスバターワースフィルターでデータをダウンサンプルしてフィルタリングし、良好な結果が得られた。フォースランプ実験では、最初の距離曲線の折り畳まれた展開された領域で展開イベントをマークする必要があり、ワームのようなチェーンまたは自由にジョイントされたチェーンモデルを使用して取り付けることができます。一定力データでは、時間の経過に対する距離をプロットすることができ、特定の力で優勢な立体構造を定量化するためにヒストグラムを生成することが有用です。ここでは、フィルタパラメータが異なる折りたたみ状態を区別するために重要であることを示しています。この手法で何が達成できるかをより深く理解するために、いくつかの代表的な結果が示されています。これは、フォースランプ実験からの標準的な力距離曲線がどのように見えるかです。この場合、SARS-コロナウイルス-2フレームシフトエレメントを研究した。我々は、15ピコニュートンの周りの複数のステップで展開を観察した。方向が反転し、ビーズが再び近づいているとき、テザーはわずかに低い力で折り返します。ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質ZAPの存在下で同じRNAを測定した場合、同様の展開パターンが観察された。しかし、RNAの二次構造は再折り畳み出さなかった。これは、タンパク質結合がRNAキネティクスにどのような大きな影響を与えることができるかを示す良い例です。一定の力のデータを見ると、展開するキネティクスをさらに調査することができます。時間経過に対する距離は異なる力に対してプロットされ、異なる観測状態のヒストグラムが右側に追加されます。10ピコニュートンでは、RNAは完全に折り畳まれた状態にある。11.5ピコニュートンでは状態間を切り替え、13ピコニュートンではRNAは永久に展開された状態にある。しかし、SARS-コロナウイルス-2フレームシフトエレメントをZAPと一緒に測定すると、RNAは11ピコニュートンで完全に展開状態にあり、10ピコニュートンで折り畳まれた状態に向かってほとんど移行を示さなかった。これは、ZAP が単一のフレームシフト要素に結合し、二次構造の形成を防止することを示します。最後に、光ピンセットデータと共焦点顕微鏡を組み合わせたものを見ていい。本実験では、二本鎖核酸に標識する蛍光色素を用いたが、特に増加力を伴う。キモグラフは、ビーズが互いに離れて移動するにつれて、蛍光強度が増加し、テザーが伸び過ぎて壊れると完全に消失することを示しています。最後の図では、蛍光標識リボソームをチャネル4を介して添加した。本実験では、RNAテザーに特異的にリボソーム結合が認められた。このビデオが光ピンセットとこの信じられないほどのテクニックを実行できるものについての洞察を与えた願っています。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

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イン・ビボヒドロキシルラジカルプロテインフットプリントにおけるカエノハブディティス・エレガンスにおけるタンパク質相互作用の研究

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