Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

우리는 아누자 키베와 준 교수 레드몬드 Smyth 비판적으로 원고를 검토해 주셔서 감사합니다. 우리는 전문 기술 지원을 위한 Tatyana Koch에게 감사드립니다. 실험적인 비디오 녹화에 도움을 주신 크리스티나 페카르코바에게 감사드립니다. 우리의 실험실에서 작품은 헬름홀츠 협회에 의해 지원되고 유럽 연구 위원회 (ERC) 그랜트 nr. 948636 (NC에)에서 자금.

1. 샘플 준비
<ol><li>핸들 서열로 작용하는 람다 DNA 단편을 포함하는 벡터내관심서열을 복제한다(도 2)43,50.</li>
	<li>먼저 PCR을 통해 후속 체외 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성한다(도 2B; 반응 1). 이 PCR 단계에서, T7 프로모터는 감각 DNA 분자32,33,43,50...

여기서는 다양한 리간드를 사용한 RNA 분자의 상호 작용과 동적 행동을 연구하기 위해 형광 결합 광학 핀셋의 사용을 입증합니다. 아래에서 현재 기술의 중요한 단계와 한계에 대해 설명합니다.
프로토콜의 중요한 단계 다른 많은 방법에 관해서는, 샘플의 품질은 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 중추적 인이다. 따라서 가능한 최고 품질의 샘플을 얻으려면 시...

MRNAs를 통해 DNA에서 단백질로 유전 정보의 전송은 세포 내의 거대 분자 상호 작용을 통해 모든 수준에서 정확하게 규제되는 복잡한 생화학 과정입니다. 번역 조절을 위해 RNA-단백질 상호 작용은 다양한 자극및 신호1,2에 신속하게 반응하는 중요한 역할을 부여합니다. 일부 RNA 단백질 상호 작용은 mRNA 안정성에 영향을 미치고 따라서 RNA가 번역 활성시간을 변경합니다. 그밖 RNA 단백질 상호 작용은 정지 코돈 판독과 같은 재코딩 기계장치와 연관됩니다, 우회, 또는 프로그램된 리보소말 프레임 변속 (PRF)3,4,5,6,7. 최근에는 다수의 RNA 결합 단백질(RBP)이 자극성 mRNA 원소 및 번역 기계와 상호 작용하여 셀7,8,9,10,11에서 언제 그리고 얼마나 많은 재코딩이 발생할지 지시하는 것으로 입증되었다. 따라서, 번역에서 RNA 결합 단백질의 역할을 해부하고 RNA 구조 및 안정성을 조절하는 방법, 이러한 RNA-단백질 복합체의 상호 작용 원리 및 기계적 특성을 자세히 연구하는 것은 중추적인 것이다.
수십 년의 작업은 속도와 정확성을 달성하기 위해 번역 기계의 RNA와 단백질 구성 요소 사이의 복잡한 통신에 의존하는 다단계 및 다중 구성 요소 번역 과정을 연구하는 토대를 마련했습니다12,13,14. 복잡한 규제 이벤트를 이해하는 중요한 다음 단계 는 고정밀12,15,16,17에서 번역 하는 동안 힘, 기간 및 구조 결정자를 결정 하는. RNA 형태 역학및 특히 번역 도중 RNA 구조 에 작용하는 트랜스 작용 보조 요인의 연구는 광학 핀셋 또는 제로 모드 파도관을 포함하여 단하나 분자 공구의 출현에 의해 더 조명되었습니다16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
광학 핀셋(OT)은 매우 정밀한 단일 분자 기법을 나타내며, 전사를 포함한 많은 종류의 RNA 의존적 동적 공정을 연구하고, 번역26,27,28,29,30,31,32를 연구한다. 광학 핀셋의 사용은 분자 상호 작용, 핵산 구조 및 열역학 적 특성, 운동학 및 이러한 공정의 정력적 16,17,17,22,34,35,35,37,38,38,39의 탐구를 허용했습니다. . 광학 핀셋 분석은 집중 된 레이저 빔과 미세한 물체의 함정을 기반으로합니다. 일반적인 OT 실험에서, 관심 있는 분자는 2개의 투명한 (일반적으로 폴리스티렌) 구슬 사이 테더드됩니다 (그림 1A)27. 이 구슬은 스프링처럼 행동 광학 트랩에 의해 잡힐 수 있습니다. 따라서, 분자상에 가해지는 힘은 집중된 레이저 빔(trap center)의 중심으로부터의 비드변위에 기초하여 계산될 수 있다. 최근에는 광학 핀셋이 공초점 현미경검사(도 1B)와 결합되어 형광 또는 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 측정40,41,42를 가능하게 합니다. 이렇게 하면 동시 측정을 가능하게 하는 완전히 새로운 실험 분야가 열리므로 힘 분광법과 형광 데이터의 정확한 상관 관계가 있습니다.
여기서는, 우리는 번역 프레임 이동을 조절하는 단백질-RNA 상호 작용을 연구하기 위하여 공초점 현미경검사법과 결합된 광학 핀셋을 사용하여 실험을 보여줍니다. 목표와 응축기 사이에 5개의 채널이 있는 플로우 셀은 라미나르 흐름을 통해 연속 적인 샘플 응용을 가능하게 합니다. 미세 유체 채널을 통해 다양한 구성 요소를 직접 주입하여 실습 시간을 줄이면서 실험 전반에 걸쳐 샘플 소비가 거의 되지 않습니다.
첫째, OT 실험의 설계를 지원하는 기본 지침이 제안되고 다양한 설정의 함정뿐만 아니라 장점이 논의됩니다. 다음으로, 샘플 및 실험 워크플로우의 준비가 설명되고, 데이터 분석을 위한 프로토콜이 제공됩니다. 예를 나타내기 위해, 우리는 RNA 스트레칭 실험으로부터 얻은 결과를 설명하고, 다른 판독 프레임으로부터 바이러스 RNA의 번역을 변화시키는 아연 핑거 항바이러스 단백질(ZAP)의 짧은 이소폼을 트랜스-작용 인자로 SARS-CoV-2 프레임 이동 RNA 요소(도 2A)를 연구하는 결과를 설명한다. 또한, 형광 라벨리보솜이 OT 공초점 분석에서 사용될 수 있음을 입증하여 번역 기계의 공정성과 속도를 모니터링하는 데 유용할 것입니다. 여기에 제시된 방법은 번역의 다양한 측면을 연구하기 위해 다른 버퍼, 리간드 또는 기타 세포 구성 요소의 효과를 빠르게 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로 일반적인 실험적 함정과 문제를 해결하는 방법에 대해 논의합니다. 아래, 실험 디자인의 몇 가지 중요한 포인트가 설명되어 있습니다.
구성 설계 원칙적으로 OT 호환 RNA 구조를 만드는 두 가지 일반적인 접근 방식이 있습니다. 첫 번째 접근법은 보완적인 DNA 손잡이로 혼성화되는 긴 RNA 분자를 채택하여 중간에 단일 좌초 RNA 서열을 측면시키는 2개의 RNA/DNA 하이브리드 영역으로 구성된 구조를 산출한다(도 2B). 이 접근법은 대부분의 OT RNA 실험에서 33,44,45에 사용됩니다.
두 번째 접근법은 짧은 (약 20 nt) overhangs15,17로 dsDNA 핸들을 활용합니다. 이 돌출은 RNA 분자로 혼성화됩니다. 디자인에서 더 복잡하더라도, dsDNA 처리의 사용은 DNA/RNA 하이브리드 시스템의 몇몇 한계를 극복합니다. 원칙적으로 매우 긴 핸들(>10kb)을 구현할 수 있어 공초점 측정에 더 편리합니다. 또한, RNA 분자는 테더 안정성을 높이기 위해 DNA 손잡이로 회개될 수 있다.
최종 라벨링 전략 구조는 강력한 분자 상호 작용을 통해 구슬에 묶여 있어야합니다. 구슬46에 손잡이의 공유 결합에 사용할 수있는 접근 방법이 있지만, 스트렙타비딘 - 비오틴 및 디곡시게닌 항체와 같은 강력하지만 비 공유 상호 작용은 OT 실험에서 일반적으로 사용된다15,33,35,45. 설명된 프로토콜에서, 구조는 비오틴 또는 디곡시게닌으로 표지되고, 구슬은 디곡시게닌에 대하여 스트렙타비딘 또는 항체로 각각 코팅된다(도 1A). 이 방법은 최대 약 60 pN(밧줄 당)47까지 힘을 적용하는 데 적합합니다. 더욱이, 다른 5' 및 3'라벨링 전략을 사용하면 구슬사이에 형성된 밧줄의 방향을 결정할 수 있다17.
형광 측정을 위한 단백질 라벨링 공초점 화상 진찰을 위해, 형광 표지를 위한 몇몇 일반적으로 이용된 접근이 있습니다. 예를 들어, 형광은 단백질에서 기본적으로 발견되거나 반응성 유기 그룹을 통해 현장 지향 돌연변이 발생에 의해 도입되는 아미노산 잔류물에 공유적으로 부착될 수 있다. 티올 또는 아민 반응성 염료는 각각 시스테인 및 리신 잔류물의 라벨링에 사용할 수 있습니다. 라벨링48,49의 특이성을 증가시키는 몇 가지 가역적인 보호 방법이 있지만, 토착 단백질은 일반적으로 여러 잔류물에서 표지될 것입니다. 형광의 작은 크기는 이점을 부여 할 수 있지만, 비 특이적 라벨은 단백질 활성을 방해할 수 있으며 따라서 신호 강도는 다를 수 있습니다49. 또한 라벨링 효율에 따라 신호 강도는 상이한 실험 간에 다를 수 있다. 따라서 실험 전에 활동 검사를 수행해야 합니다.
관심 있는 단백질에 His-tag 또는 스트렙 태그와 같은 N-또는 C 단말 태그가 포함된 경우 이러한 태그의 특정 라벨링은 또 다른 인기 있는 접근 방식을 나타냅니다. 더욱이, 태그 표적 라벨링은 플루오로포어가 단백질 활성을 방해할 가능성을 감소시키고 용해도를 향상시킬 수 있다49. 그러나 태그별 라벨링은 일반적으로 모노 플루오로포어 표지 단백질을 생성하므로 감지하기가 어려울 수 있습니다. 특정 라벨링의 또 다른 방법은 항체를 채택함으로써 달성될 수 있다.
미세 유체 설정 OT와 미세 유체 시스템의 조합은 다른 실험 조건 사이의 빠른 전환을 허용합니다. 더욱이, 현재 시스템은 유동 방향에 비해 수직 방향으로 다른 채널에서 액체의 혼합을 배제하는 유동 셀 내부의 라미나르 흐름을 유지하는 것을 활용한다. 따라서, 라미나르 유량은 실험 설계에 특히 유리하다. 현재 최대 5개의 채널을 사용하는 유동 셀이 일반적으로 사용됩니다(그림 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA는 기능에 필수적인 다양한 구조 접을 채택하여 세포의 다양한 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, RNA의 구조 및 기능은 단백질, 대사산물 또는 기타 RNA와 같은 다양한 트랜스 작용 요인에 의해 변조될 수 있다. 프레임 변속 RNA 분자는, 예를 들면, 다른 개방독서 프레임으로 리보솜을 직접 번역하는 코딩 지구에 있는 규제 RNA이고, 그 에 의해 유전자 스위치로 작동합니다. 그(것)들은 또한 단백질 또는 그밖 트랜스 인자에 결합한 후에 다른 주름을 채택할 수 있습니다. 번역에서 RNA 결합 단백질의 역할을 해부하고 RNA 구조와 안정성을 조절하는 방법을 해부하기 위해 이러한 RNA 단백질 복합체의 상호 작용 및 기계적 특징을 동시에 연구하는 것이 중요합니다. 이 연구는 단일 분자 형광 결합 광학 핀셋을 사용하여 고해상도로 RNA 단백질 복합체의 형성 및 열역학 적 풍경을 탐구하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, ZS-CoV-2 프로그래밍된 리보소말 프레임 변속 요소와 아연 핑거 항바이러스 단백질의 짧은 이소폼을 결합한 상호작용이 정교화된다. 또한, 형광 라벨리보솜은 공초점 유닛을 사용하여 모니터링하여 궁극적으로 번역 신장의 연구를 가능하게 했습니다. 형광 결합 OT 분석은 다양한 RNA 단백질 복합체 또는 번역을 조절하는 트랜스 작용 인자를 탐구하기 위해 널리 적용 될 수 있으며 RNA 기반 유전자 조절의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

이 섹션에서는, 초점은 주로 형광 광학 핀셋에 의한 RNA 단백질/리간드 상호작용의 측정에 주어집니다. 일반적인 RNA 광학 핀셋 실험 및 해당 대표 결과에 대한 설명을 보려면 see32. RNA/DNA 단백질 상호 작용 에 대한 자세한 논의를 위해 1,26,59,60을 참조하십시오</sup...

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Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

이 프로토콜은 광학 핀셋을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 연구하기위한 완벽한 실험 워크플로우를 제공합니다. 공초점 현미경 검사법과 광학 핀셋의 조합을 포함하여 몇 가지 가능한 실험 설정이 설명되어 있습니다.

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

다음 방법 문서의 전반적인 목표는 공초점 현미경 검사법과 결합된 광학 핀셋을 사용하여 단백질 또는 기타 요인과의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 유용한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 지난 10 년 동안, 단일 거대 분자의 특성을 조사하기 위해 몇 가지 정교한 기술이 개발되었습니다. 이러한 기술 중 하나는 단일 분자 광학 핀셋입니다.새로운 형광 보조 광학 핀셋으로 RNA 분자의 전개에 필요한 힘뿐만 아니라 번역 중 바인딩 이벤트를 자세히 모니터링 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 RNA 분자가 번역을 통제하는 요인을 유무에 관계없이 뻗어 있는 측정에 집중합니다. 또한 라벨이 부착된 리보솜을 사용하여 번역을 모니터링하기 위해 이 기술을 적용할 수 있는 방법을 설명합니다.이 프로토콜은 루카스 페카렉과 스테판 파크의 두 대학원생에 의해 입증될 것입니다. 이 비디오에서는 광학 핀셋 실험의 설정 및 실행을 안내할 것입니다. 또한 간단한 데이터 분석 워크플로우에 대해서도 설명합니다.이 기술의 장점은 간단하고 견고하다는 것입니다. 분자는 레이저 빔의 초점에 묶여 두 구슬 사이에 묶여 있으며, 변위 시 의 변화와 힘은 소위 힘 램프 실험에서 정확하게 측정될 수 있습니다. 테더 내부의 이차 구조는 분자의 내부 에너지에 따라 특정 힘으로 전개됩니다.여러 구조 간의 동적 전환은 일정한 힘 측정을 통해 더 자세히 조사할 수 있습니다. 더욱이, 형광 이미징의 병렬 사용은 실시간으로 결합 이벤트를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 테더의 고유한 힘 거리 프로파일은 안정성에 영향을 미치는 잠재적 인 트랜스태이트 요인을 결합 한 후 달라질 수 있습니다.첫째, 관심있는 RNA는 DNA 벡터로 복제되어야합니다. 이 서열의 상류 및 하류, 추가 부품, 핸들은 구슬 사이의 최종 DNA-RNA 구조를 연결하는 데 필요합니다. 플라스미드의 성공적인 복제 및 증폭 후, 세 가지 다른 PCR 반응이 수행됩니다.각 PCR 반응에 대해 프로토콜의 표 하나에 따라 시약을 혼합합니다. 적절한 열 사이클러에서 50 마이크로리터 알리쿼트에서 PCR을 실행합니다. 첫 번째 는 후속 시험관 내 전사를 위한 T7 프로모터와 함께 전체 구조의 이중 좌초 된 DNA를 초래합니다.두 번째 PCR은 다섯 개의 주요 핸들을 생성합니다. 마지막 반응은 세 가지 주요 핸들을 초래하는 반면. 5 개의 프라임 핸들과 3 개의 프라임 핸들은 사용 된 구슬에 따라 레이블을 지정해야합니다.3개의 프라임 핸들은 PCR 중에 디곡시게닌 라벨이 부착된 역프라이머를 사용하여 표지되며, 5개의 프라임 핸들은 생물성 화를 통해 추가 단계로 레이블을 지정해야 합니다. 5개의 프라임 핸들의 3개의 주요 생체화는 T 40 및 폴리머라제를 사용하여 수행됩니다. 반응은 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 수행됩니다.다음으로, T7 폴리머라제를 사용하여 체외 내 전사를 수행한다. RNA의 길이에 따라 2~4시간 동안 37도에서 반응을 배양한다. 마지막 단계에서, 손잡이는 이중 좌초된 손잡이 사이의 단일 좌초 된 영역을 가진 최종 DNA-RNA 구조를 얻기 위해 시험관 내 전사로부터 RNA로 어닐링된다.원하는 RNA-DNA 하이브리드를 음닐하려면 손잡이와 RNA를 아닐링 버퍼에 섞는다. 열, 10 분 동안 최대 85도의 혼합물을 가열한 다음 샘플을 4도로 천천히 식힙니다. 어닐드 샘플을 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 1/10부와 3권의 얼음 냉간 에탄올을 혼합하고 최소 한 시간 동안 마이너스 80도를 배양합니다.원심 분리시 샘플을 15, 000 xg에서 4도에서 30 분 동안 분리합니다. 상체를 버리고 진공 상태에서 펠릿을 말리십시오. 재부유된 펠릿의 작은 알리쿼트(aliquots)는 액체 질소로 동결되어 사용될 때까지 영하 80도까지 보관됩니다.먼저 주사기에서 표백제를 제거하고 RNase 무료 물 1 mL를 채웁니다. 0.5 개의 어금니 나트륨 티오술파테의 50 마이크로 리터를 추가하고 하나의 바로 시스템을 씻어. 미세 유체 시스템은 시스템의 기포를 피하기 위해 건조하게 실행되지 않도록주의하십시오.다음으로, 나머지 나트륨 티오술파테액을 버리고 주사기를 새로운 것으로 대체한다. 그런 다음 RNase 무료 물 0.5mL 이상으로 다시 씻으십시오. 기계의 광학 시스템을 설정하려면 두 방울의 침지 오일을 목표에 넣습니다.유동 셀을 제자리에 놓고 액체가 유동 셀에 닿을 때까지 목표를 상승시보입니다. 그런 다음 유량 셀 위에 침지 오일 2 방울을 넣습니다. 이제 트랩 스티어링 유닛과 트래핑 레이저를 켭니다.목표는 기계의 진단 카메라의 Z 파인더 도구를 사용하여 조정됩니다. 마이크로 나사를 돌리면 Z 축은 두 번째 와 세 번째 반사 사이의 챔버 의 중간으로 조정됩니다. 굴절 링이 가장 큰 곳입니다.진단 카메라를 달 모드로 전환하고 트래핑 레이저를 약 50 %로 줄인 다음 응축기를 낮추고 위치를 조정하여 약 10 개의 라이트 밴드를 볼 수 있습니다. 측정 챔버에는 5개의 채널이 있으며 실험 전에는 다른 설정 가능성을 고려해야 합니다. 간단한 힘 램프 실험을 위해 구슬 버퍼 구슬은 편리한 채널 배열입니다.형광 리보솜 이나 거래 인자와 같은 네 번째 화합물을 가진 측정의 경우 구슬 구슬 버퍼 계수는 더 나은 배열이지만 구슬을 잡기가 더 어려워집니다. 어닐링 된 구조의 알리쿼트는 3 개의 마이크로 리터 AD 비드 서스펜션, 1 개의 마이크로 리터 RNase 억제제 및 실온에서 분석 버퍼의 8 마이크로 리터로 10 ~ 20 분 동안 배양됩니다. 그런 다음 샘플은 500 마이크로리터 분석 버퍼로 희석되어 각 채널에 넣습니다.두 번째 종류의 구슬의 경우, 분석 구슬의 0.8 마이크로리터는 분석 버퍼의 1mL와 혼합되어 해당 채널로 투여된다. 채널은 열어 저압으로 세척됩니다. 이제 트랩핑 레이저를 켭니다.구슬을 잡기 위해 레이저는 서로 떨어져 이동하고 AD 비드는 함정 하나에 잡힙다. 다음으로 무대는 SA 비드 채널로 이동하고 비드는 트랩 2에 잡힌다. 구슬을 잃지 않도록 하거나 동일한 트랩에서 두 번째 트랩을 잡으려면 스테이지가 버퍼 채널로 이동하고 모든 채널이 닫힙습니다.버퍼에서 트랩 보정이 수행됩니다. 잡힌 구슬은 후속 측정을 위한 시각적 템플릿으로 설정해야 합니다. 그리고 유사성 점수는 비교를 보장하기 위해 측정 사이에 90 % 이상 유지해야합니다.마지막으로 구슬은 서로 더 가깝게 이동하고 하나의 밧줄을 잡기 시작할 수 있습니다. 이것은 몇 초 동안 구슬을 닫은 다음 천천히 구슬을 다시 출발합니다. 밧줄 형성은 두 구슬을 서로 떼어낼 때 측정된 힘의 증가를 초래한다.테더의 수와 품질은 오버스트레칭 고원을 찾아서 확인할 수 있으며, 궤적을 자유롭게 조인트 체인 또는 웜과 같은 체인 모델과 비교할 수 있습니다. 오버 스트레칭 고원은 단일 밧줄에 대한 50 에서 60 피코 뉴턴 사이여야한다. 형광 측정을 수행하려면 공초점 레이저와 광자 수를 단위 및 광학 핀셋 기계에 켭니다.그 후, 원하는 파장 및 소프트웨어 인터페이스의 흥분 레이저를 켜고 불소에 따라 레이저의 힘을 5% 이상으로 설정합니다. 이제 이미징은 소프트웨어의 이미지 또는 kymograph 기능을 사용하여 시작할 수 있습니다. 잘 초점을 맞춘 이미지를 얻으려면 공초점 현미경과 광학 트랩의 초점 평면이 정렬되어 있는지 확인하십시오.이를 위해, 블루 레이저 채널에서 폴리스티렌 구슬의 자동 불발성을 사용할 수 있다. 구슬의 자동 불발성이 가장 높은 직경에 도달 할 때까지 광학 트랩의 초점 평면으로 위아래로 이동합니다. 이 위치에서, 테더드 분자에서 일어나는 형광 신호는 검출될 수 있다.두 함수 모두 관심 영역을 선택하는 것이 중요합니다. 측정 버퍼 조성 전반에 걸쳐 구슬을 다른 채널로 이동하거나 미세 유체 시스템에서 제공되는 버퍼를 변경하여 쉽게 변경할 수 있습니다. 광표백을 피하려면 측정하지 않을 때 항상 흥분 레이저를 끕니다.장치에서 원시 데이터 출력에는 많은 노이즈가 자주 포함되어 있습니다. 따라서 분산된 데이터를 추가로 분석하기 위해 먼저 미리 처리해야 합니다. 첫 번째 단계는 낮은 패스 버터 워스 필터로 샘플을 다운하고 데이터를 필터링하는 것입니다, 좋은 결과를 얻었다.힘 경사로 실험의 경우, 전개 이벤트는 웜과 같은 체인 또는 자유롭게 조인트 체인 모델을 사용하여 장착할 수 있는 제1 거리 곡선의 접히고 전개된 영역에 표시되어야 합니다. 상수 력 데이터의 경우, 시간이 지남에 따라 의 거리를 플로팅할 수 있으며 주어진 힘에서 우세한 변형을 정량화하기 위해 히스토그램을 생성하는 것이 유용하다. 여기서 필터 매개 변수는 다른 접이식 상태를 구별하는 데 중요한 것으로 나타났습니다.이 기술로 달성 할 수있는 것을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 대표적인 결과가 표시됩니다. 이것은 힘 램프 실험에서 표준 힘 거리 곡선처럼 보이는 방법입니다. 이 경우 SARS-코로나바이러스-2 프레임 이동 요소를 연구했습니다.우리는 15 피코 뉴턴 주위에 여러 단계에서 전개 관찰. 방향이 반전되고 구슬이 다시 가까워지면 밧줄이 약간 낮은 힘으로 다시 접습니다. 아연 손가락 항바이러스 단백질 ZAP의 존재에서 동일한 RNA를 측정했을 때, 유사한 전개 패턴이 관찰되었다.그러나 RNA의 이차 구조는 다시 접지하지 않았다. 이것은 단백질 결합이 RNA 운동학에 미칠 수 있는 어떤 큰 영향을 보여주기 위하여 좋은 보기입니다. 일정한 힘 데이터를 살펴보면 전개되는 운동학을 더 조사할 수 있습니다.시간이 지남에 따라 거리는 다른 힘에 대한 플롯과 다른 관찰 상태의 히스토그램이 오른쪽에 추가됩니다. 10 piconewton에서, RNA는 접힌 상태에 완전히 이다. 11.5 piconewton에서 그것은 상태 사이 전환, 그리고 13 piconewton에서 RNA는 전개 된 상태에서 영구적으로.그러나, SARS-코로나바이러스-2 프레임 이동 소자를 ZAP와 함께 측정했을 때, RNA는 11 piconewton에서 완전히 전개된 상태에 있었고, 심지어 10 piconewton에서 접힌 상태로 거의 전환되지 않았다. 이는 ZAP가 단일 좌초프레임 이동 요소에 바인딩되어 보조 구조의 형성을 방지한다는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 우리는 공초점 현미경 검사법과 결합된 몇몇 광학 핀셋 데이터를 볼 것입니다.이 실험에서, 형광염은 이중 가닥 핵산을 라벨을 붙이는 데 사용되었으며, 이는 특별히 증가하는 힘으로 비하여 사용되었다. kymograph는 구슬이 서로 떨어져 이동함에 따라 형광 강도가 증가하고 밧줄이 너무 많이 뻗어 나면 완전히 사라진다는 것을 보여줍니다. 마지막 그림에서 형광으로 표시된 리보솜은 채널 4를 통해 첨가되었다.본 실험에서 RNA 밧줄에 특이적인 리보솜 결합이 관찰되었다. 이 비디오가 광학 핀셋에 대한 통찰력을 주었고 이 놀라운 기술을 수행할 수 있는 것이 무엇인지 바랍니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

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소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

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체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...