Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Vi takker Anuja Kibe og jun. prof. Redmond Smyth for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi takker Tatyana Koch for ekspert teknisk assistanse. Vi takker Kristyna Pekarkova for hjelpen med å spille inn eksperimentelle videoer. Arbeidet i vårt laboratorium støttes av Helmholtz-foreningen og midler fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) Grant Nr. 948636 (til NC).

1. Prøvepreparering
<ol><li>Klone sekvensen av interesse inn i vektoren som inneholder Lambda DNA fragmenter, som tjener som håndtak sekvenser (Figur 2)43,50.</li>
	<li>Generer først en DNA-mal for påfølgende in vitro-transkripsjon via PCR (figur 2B, reaksjon 1). På dette PCR-trinnet blir T7-promotoren lagt til i 5' enden av sansen DNA-molekyl32,33,43,50.<sup class="xref...

Her demonstrerer vi bruken av fluorescens-koblede optiske pinsett for å studere interaksjoner og dynamisk oppførsel av RNA-molekyler med ulike ligander. Nedenfor diskuteres kritiske trinn og begrensninger i den nåværende teknikken.
Kritiske trinn i protokollen Når det gjelder mange andre metoder, er kvaliteten på prøven avgjørende for å oppnå pålitelige data. Derfor, for å oppnå høyest mulig kvalitetsprøver, er det verdt det å bruke tid på å optimalisere p...

Overføring av genetisk informasjon fra DNA til proteiner gjennom mRNAer er en kompleks biokjemisk prosess, som er nøyaktig regulert på alle nivåer gjennom makromolekylære interaksjoner inne i celler. For translasjonsregulering gir RNA-proteininteraksjoner en kritisk rolle for raskt å reagere på ulike stimuli og signaler1,2. Noen RNA-proteininteraksjoner påvirker mRNA-stabiliteten og endrer dermed tiden en RNA er translasjonelt aktiv. Andre RNA-protein interaksjoner er forbundet med omkodingsmekanismer som stop-codon readthrough, bypassing eller programmert ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nylig har en rekke RNA-bindende proteiner (RBPer) vist seg å samhandle med stimulatoriske mRNA-elementer og oversettelsesmaskineriet for å diktere når og hvor mye omkoding som vil forekomme i cellen7,8,9,10,11. For å dissekere rollen som RNA-bindende proteiner i oversettelse og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det derfor avgjørende å studere interaksjonsprinsippene og mekaniske egenskapene til disse RNA-proteinkompleksene i detalj.
Tiår med arbeid har lagt grunnlaget for å studere flertrinns- og flerkomponentprosessen for oversettelse, som er avhengig av intrikat kommunikasjon mellom RNA og proteinkomponentene i oversettelsesmaskineriet for å oppnå hastighet og nøyaktighet12,13,14. Et avgjørende neste skritt for å forstå komplekse regulatoriske hendelser er å bestemme krefter, tidsskalaer og strukturelle determinanter under oversettelse med høy presisjon12,15,16,17. Studien av RNA-konformasjonsdynamikk og spesielt hvordan transvirkende hjelpefaktorer virker på RNA-strukturen under oversettelse har blitt ytterligere opplyst av fremveksten av enkeltmolekylverktøy, inkludert optiske pinsett eller nullmodusbølgeledere16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optisk pinsett (OT) representerer en svært presis enkeltmolekylteknikk, som har blitt brukt til å studere mange slags RNA-avhengige dynamiske prosesser, inkludert transkripsjon, og oversettelse26,27,28,29,30,31,32. Bruken av optiske pinsett har gjort det mulig å undersøke molekylære interaksjoner, nukleinsyrestrukturer og termodynamiske egenskaper, kinetikk og energi av disse prosessene i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pinsettanalyse er basert på entrapment av mikroskopiske objekter med en fokusert laserstråle. I et typisk OT-eksperiment er interessemolekylet bundet mellom to gjennomsiktige (vanligvis polystyren) perler (figur 1A)27. Disse perlene blir deretter fanget av optiske feller, som oppfører seg som fjærer. Dermed kan kraften som påføres molekylet beregnes basert på perlens forskyvning fra midten av den fokuserte laserstrålen (fellesenteret). Nylig har optisk pinsett blitt kombinert med konfektmikroskopi (figur 1B), noe som muliggjør fluorescens eller Förster resonansenergioverføring (FRET) målinger40,41,42. Dette åpner et helt nytt felt av mulige eksperimenter som tillater samtidig måling og derfor presis korrelasjon av kraftspektroskopi- og fluorescensdata.
Her demonstrerer vi eksperimenter ved hjelp av de optiske pinsettene kombinert med konfikal mikroskopi for å studere protein-RNA-interaksjoner som regulerer translasjonell frameshifting. Mellom målsettingen og kondensatoren muliggjør en strømningscelle med fem kanaler kontinuerlig prøveapplikasjon med laminær strømning. Gjennom mikrofluidiske kanaler kan ulike komponenter injiseres direkte, noe som reduserer den praktiske tiden, samt tillater svært lite prøveforbruk gjennom hele eksperimentet.
For det første foreslås en grunnleggende retningslinje for å bistå utformingen av OT-eksperimenter, og fordeler samt fallgruver i ulike oppsett diskuteres. Deretter beskrives utarbeidelsen av prøver og eksperimentelle arbeidsflyter, og en protokoll for dataanalysen er gitt. For å representere et eksempel skisserer vi resultatene fra RNA-strekkeksperimenter for å studere SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet (figur 2A) med transvirkende faktor den korte isoformen av sinkfinger antiviralt protein (ZAP), som endrer oversettelsen av viral RNA fra en alternativ leseramme43. I tillegg er det demonstrert at fluorescensmerkede ribosomer kan brukes i denne OT-konfiskeringsanalysen, noe som vil være nyttig for å overvåke prosessiviteten og hastigheten til oversettelsesmaskineriet. Metoden som presenteres her, kan brukes til raskt å teste effekten av forskjellige buffere, ligander eller andre cellulære komponenter for å studere ulike aspekter ved oversettelse. Til slutt diskuteres vanlige eksperimentelle fallgruver og hvordan du feilsøker dem. Nedenfor er noen viktige punkter i eksperimentell design skissert.
Konstruere design I prinsippet er det to vanlige tilnærminger for å skape en OT-kompatibel RNA-konstruksjon. Den første tilnærmingen bruker et langt RNA-molekyl som er hybridisert med komplementære DNA-håndtak, og gir dermed en konstruksjon som består av to RNA / DNA-hybridregioner som flankerer en enkeltstrenget RNA-sekvens i midten (figur 2B). Denne tilnærmingen brukes i de fleste OT RNA-eksperimenter33,44,45.
Den andre tilnærmingen utnytter dsDNA-håndtak med korte (rundt 20 nt) overheng15,17. Disse overhengene blir deretter hybridisert med RNA-molekylet. Selv om det er mer komplisert i design, overvinner bruken av dsDNA-håndtak noen av begrensningene i DNA / RNA-hybridsystemet. I prinsippet kan selv svært lange håndtak (>10kb) implementeres, noe som er mer praktisk for konfiskeringer. I tillegg kan RNA-molekylet ligateres til DNA-håndtak for å øke tetherstabiliteten.
Strategi for sluttmerking Konstruksjonen må knyttes til perler via en sterk molekylær interaksjon. Mens det er tilnærminger tilgjengelig for kovalent binding av håndtak til perler46, brukes sterke, men ikke-kovalente interaksjoner som streptavidin-biotin og digoxigenin-antistoff ofte i OT-eksperimenter15,33,35,45. I den beskrevne protokollen er konstruksjonen merket med biotin eller digoksigenin, og perlene er belagt med streptavidin eller antistoffer mot henholdsvis digoxigenin (figur 1A). Denne tilnærmingen vil være egnet for påføring av krefter opp til ca. 60 pN (per tether)47. Videre tillater bruken av forskjellige 5' og 3 ' merkingsstrategier å bestemme orienteringen av tether dannet mellom perlene17.
Proteinmerking for fluorescensmålinger For den kondokale avbildningen er det flere ofte brukte tilnærminger for fluorescensmerking. For eksempel kan fluoroforer festes kovalent til aminosyrerester som finnes innfødt i proteiner eller introdusert av stedsstyrt mutagenese gjennom en reaktiv organisk gruppe. Tiol- eller aminreaktive fargestoffer kan brukes til merking av henholdsvis cystein- og lysinrester. Det finnes flere reversible beskyttelsesmetoder for å øke spesifisiteten til merkingen av48,49, men innfødte proteiner vil vanligvis bli merket ved flere rester. Selv om den lille størrelsen på fluoroforen kan gi en fordel, kan ikke-spesifikk merking forstyrre proteinaktiviteten og dermed kan signalintensiteten variere49. Avhengig av etiketteffektivitetssignalintensiteten kan det også variere mellom forskjellige eksperimenter. Derfor bør en aktivitetskontroll utføres før eksperimentet.
I tilfelle proteinet av interesse inneholder en N- eller C-terminal tag, for eksempel en His-tag eller strep-tag, representerer spesifikk merking av disse taggene en annen populær tilnærming. Videre reduserer tag-målrettet merking sjansen for at fluoroforen forstyrrer proteinaktiviteten og kan forbedre løseligheten49. Tag-spesifikk merking gir imidlertid vanligvis mono-fluoroformerkede proteiner, noe som kan være utfordrende å oppdage. En annen måte å spesifikk merking kan oppnås ved å bruke antistoffer.
Oppsett av mikrofluidikk Kombinasjonen av OT med et mikrofluidikksystem muliggjør en rask overgang mellom ulike eksperimentelle forhold. Videre utnytter nåværende systemer å opprettholde laminærstrømmen inne i strømningscellen, noe som utelukker blanding av væsker fra andre kanaler i vinkelrett retning i forhold til strømningsretningen. Derfor er laminær strømning spesielt fordelaktig for eksperimentell design. For tiden brukes flytceller med opptil 5 kanaler ofte (figur 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA vedtar forskjellige strukturelle folder, som er avgjørende for sine funksjoner og dermed kan påvirke ulike prosesser i cellen. I tillegg kan strukturen og funksjonen til en RNA moduleres av ulike transvirkende faktorer, for eksempel proteiner, metabolitter eller andre RNAer. Frameshifting RNA molekyler, for eksempel, er regulatoriske RNAer plassert i koding regioner, som direkte oversette ribosomer til en alternativ åpen leseramme, og dermed fungere som genbrytere. De kan også vedta forskjellige folder etter binding til proteiner eller andre transfaktorer. For å dissekere rollen som RNA-bindende proteiner i oversettelse og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det avgjørende å studere samspillet og mekaniske egenskapene til disse RNA-proteinkompleksene samtidig. Dette arbeidet illustrerer hvordan man bruker enkeltmolekyl-fluorescens-koblede optiske pinsett for å utforske konformasjons- og termodynamisk landskap av RNA-proteinkomplekser med høy oppløsning. Som et eksempel utarbeides samspillet mellom SARS-CoV-2 programmert ribosomal frameshifting element med transvirkende faktor kort isoform av sinkfinger antiviralt protein. I tillegg ble fluorescensmerkede ribosomer overvåket ved hjelp av den konfekale enheten, noe som til slutt ville muliggjøre studiet av oversettelsesforlengelse. Fluorescens koblet OT-analyse kan brukes mye for å utforske forskjellige RNA-proteinkomplekser eller transvirkende faktorer som regulerer oversettelsen og kan lette studier av RNA-basert genregulering.

I denne delen fokuseres det hovedsakelig på målinger av RNA-protein/ligand interaksjoner av fluorescens optisk pinsett. For en beskrivelse av generelle RNA optisk pinsett eksperimenter og tilsvarende representative resultater, se32. For mer detaljert diskusjon av RNA/DNA-proteininteraksjonene, se også1,2,26,59,60.
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Denne protokollen presenterer en komplett eksperimentell arbeidsflyt for å studere RNA-proteininteraksjoner ved hjelp av optisk pinsett. Flere mulige eksperimentelle oppsett er skissert, inkludert kombinasjonen av optisk pinsett med konfikal mikroskopi.

Optiske pinsett for å studere RNA-proteininteraksjoner i oversettelsesregulering

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Det overordnede målet med følgende metodeartikkel er å demonstrere en protokoll som er nyttig for å studere RNA-interaksjoner med proteiner eller andre faktorer ved hjelp av optisk pinsett kombinert med konfokal mikroskopi. I løpet av det siste tiåret har flere sofistikerte teknikker blitt utviklet for å undersøke egenskapene til enkelt makromolekyler. En av disse teknikkene er enkeltmolekyl optisk pinsett.Med den nye fluorescens assistert optisk pinsett, ikke bare krefter som kreves for utfoldelse av RNA molekyler, samt bindende hendelser under oversettelse kan overvåkes i detalj. Her fokuserer vi på målinger der RNA-molekyler strekkes med og uten å handle faktorer som regulerer oversettelsen. Vi illustrerer også hvordan teknikken kan brukes til å overvåke oversettelse ved hjelp av merkede ribosomer.Protokollen vil bli demonstrert av to avgangsstudenter i min gruppe, Lukas Pekarek og Stefan Park. I denne videoen skal vi veilede deg gjennom oppsett og utførelse av et optisk pinsetteksperiment. Vi skisserer også den enkle arbeidsflyten for dataanalyse.Fordelen med denne teknikken er at den er grei og robust. Et molekyl er bundet mellom to perler, festet i fokus av laserstråler, og endring og kraft ved forskyvning kan måles nøyaktig i såkalte kraft-rampe eksperimenter. Sekundære strukturer inne i en tether utfolder seg med en viss kraft avhengig av molekylets indre energi.Denne dynamiske overgangen mellom flere strukturer kan undersøkes nærmere med konstante kraftmålinger. Videre kan parallell bruk av fluorescerende avbildning brukes til å visualisere bindingshendelser i sanntid. En distinkt kraftavstandsprofil for en tether kan variere etter binding av potensielle transakterende faktorer som påvirker stabiliteten.For det første må RNA av interesse klones inn i en DNA-vektor. Oppstrøms og nedstrøms av denne sekvensen, flere deler, er håndtakene nødvendige for å tether den endelige DNA-RNA-konstruksjonen mellom perlene. Etter vellykket kloning og forsterkning av plasmidet utføres tre forskjellige PCR-reaksjoner.For hver PCR-reaksjon blander du reagensene i henhold til tabell én i protokollen. Kjør PCR i 50 mikroliter aliquots i en passende termisk syklist. Den første resulterer i et dobbeltstrenget DNA av hele konstruksjonen med T7-promotoren for påfølgende in-vitro transkripsjon.Den andre PCR produserer de fem hovedhåndtakene. Mens den siste reaksjonen resulterer i de tre hovedhåndtakene. Både 5 prime og 3 prime håndtak må merkes i henhold til de brukte perlene.De tre hovedhåndtakene er merket under PCR ved hjelp av en digoxigenin merket omvendt primer, og de fem prime håndtakene må merkes i et ekstra trinn gjennom biotinylering. De tre førsteklasses biotinylering av de fem hovedhåndtakene utføres ved hjelp av T 40 og en polymerase. Reaksjonen utføres i en til to timer ved romtemperatur.Deretter utfører du in-vitro transkripsjonen ved hjelp av T7 polymerase. Inkuber reaksjonen på 37 grader i to til fire timer, avhengig av lengden på RNA. I et siste trinn er håndtakene glødet med RNA fra in-vitro-transkripsjonen for å oppnå den endelige DNA-RNA-konstruksjonen med den eneste strandede regionen av interesse mellom de doble strandede håndtakene.For å anneal ønsket RNA-DNA hybrid, bland håndtakene og RNA i glødebuffer. Varm opp, glødeblandingen opp til 85 grader i 10 minutter, og avkjøl deretter prøven sakte til fire grader. Bland den glødede prøven med 1/10 av volumet på tre molar natriumacetat, og tre bind iskald etanol og inkuber minus 80 grader i minst en time.Sentrifuger prøvene ved 15 000 xg i 30 minutter ved fire grader. Kast supernatanten og tørk pelletsen under vakuum. Små aliquots av den resuspenderte pelletsen fryses i flytende nitrogen og holdes på minus 80 grader til de brukes.Fjern først blekemiddelet ut av sprøytene og fyll ut en ml RNase fritt vann. Tilsett 50 mikroliter 0,5 molar natriumtiosulfat og vask systemet med en bar. Vær forsiktig så det mikrofluidiske systemet aldri går tørt for å unngå luftbobler i systemet.Kast deretter den gjenværende natriumtiosulfatoppløsningen og erstatt sprøytene med nye. Vask deretter igjen med minst 0,5 ml RNase fritt vann. For å sette opp maskinens optiske system, sett to dråper nedsenkningsolje på målet.Sett strømningscellen på plass og stigning av målet til væsken berører strømningscellen. Legg deretter to dråper nedsenkningsolje på toppen av strømningscellen. Slå nå på fellestyringsenheten og overlappingslaseren.Målet justeres ved hjelp av Z-søkerverktøyet til maskinens diagnostiske kameraer. Ved å dreie mikroskruen justeres Z-aksen til midten av kammeret mellom den andre og den tredje refleksjonen. Hvor brytningsringene er de største.Sett diagnosekameraene i månemodus og reduser overlappingslaseren til rundt 50 %Senk deretter kondensatoren og juster posisjonen slik at du ser omtrent 10 lysbånd. Målekammeret har fem kanaler, og før eksperimentet bør ulike oppsettsmuligheter vurderes. For et enkelt kraftrampereksperiment er perler-bufferperler et praktisk kanalarrangement.For målinger med den fjerde forbindelsen, som fluorescerende ribosomer eller transakterende faktorer, er perler-perler-bufferfaktor et bedre arrangement, men det gjør det vanskeligere å fange perler. En aliquot av den glødede konstruksjonen inkuberes med tre mikroliter AD-perlefjæring, en mikroliter RNase-hemmere og åtte mikroliter av analysebufferen ved romtemperatur i 10 til 20 minutter. Deretter fortynnes prøven i 500 mikroliteranalysebuffer og settes inn i den respektive kanalen.For den andre typen perler blandes 0,8 mikroliter analyseperler med en ml analysebuffer og administreres i den tilsvarende kanalen. Kanalene åpnes og vaskes med lavt trykk. Slå nå på overlappingslaseren.For å fange perler, blir laserne flyttet fra hverandre og en AD-perle er fanget i felle en. Deretter flyttes scenen til SA-perlekanalen, og en perle fanges i felle to. For å unngå å miste perlene, eller for å fange en annen i samme felle, flyttes scenen til bufferkanalen og alle kanaler lukkes.I bufferen utføres en fellekalibrering. De fangede perlene bør settes som visuelle maler for etterfølgende målinger. Og likhetspoengene bør holdes over 90% mellom målinger for å garantere sammenlignbarhet.Til slutt flyttes perlene nærmere hverandre, og man kan begynne å fange en enkelt tether. Dette gjøres ved å flytte perlene nær i noen sekunder og deretter sakte forlate perlene igjen. En tetherformasjon resulterer i en økning av målt kraft ved å trekke de to perlene bort fra hverandre.Antallet og kvaliteten på tethers kan kontrolleres ved å finne overstretching platået og sammenligne banen med den fritt skjøtede kjeden eller ormlignende kjedemodellen. Det overstretching platået skal være mellom 50 og 60 piconewton for en enkelt tether. For å utføre fluorescensmålingene, slå på konfektlasere og fotonantall på enhet og optisk pinsettmaskin.Etterpå slår du på eksitasjonslaseren til ønsket bølgelengde og programvaregrensesnittet og setter laserens kraft til 5% eller høyere, avhengig av fluorofor. Nå kan bildebehandling startes ved hjelp av bildet eller kymograffunksjonene til programvaren. For å få godt fokuserte bilder, sørg for at fokusplanet til det konfokale mikroskopet og de optiske fellene er justert.Til dette formål kan autofluorescence av polystyrenperler i den blå laserkanalen brukes. Beveg deg opp og ned med fokusplanet til de optiske fellene til autofluorescence av perlene når sin høyeste diameter. I denne posisjonen kan fluorescenssignalene som finner sted på det tethered molekylet oppdages.For begge funksjonene er det viktig å velge de aktuelle interesseområdene. Gjennom hele målebuffersammensetningen kan enkelt endres ved enten å flytte perlene til forskjellige kanaler, eller ved å endre bufferen som leveres i mikrofluidisk system. For å unngå fotobleking må du alltid slå av eksitasjonslaseren når du ikke måler.Rådatautgangen fra enheten inneholder ofte mye støy. Derfor, for å analysere spredte data ytterligere, har man først å forhåndsbehandle dem. Det første trinnet er å ned prøve og filtrere dataene med low pass Butterworth-filteret, gode resultater ble oppnådd.For kraftrampeforsøk må de utfoldende hendelsene merkes ved de tilsvarende brettede og utfoldede områdene i den første avstandskurven kan monteres ved hjelp av ormlignende kjede eller fritt leddede kjedemodeller. For de konstante kraftdataene kan avstanden over tid plottes, og det er nyttig å generere et histogram for å kvantifisere den dominerende konformasjonen ved en gitt kraft. Her vises det at filterparametrene er avgjørende for å skille mellom forskjellige foldetilstander.For bedre forståelse av hva som kan oppnås med denne teknikken, vises noen representative resultater. Slik ser en standard kraftavstandskurve fra et kraft-rampeeksperiment ut. I dette tilfellet studerte vi SARS-coronavirus-2 rammeskifteelementet.Vi observerte utfolde seg i flere trinn rundt 15 piconewton. Når retningen er reversert og perlene kommer nærmere igjen, bretter tetheren seg tilbake med litt lavere kraft. Da vi målte samme RNA i nærvær av sinkfingerens antivirale protein ZAP, ble det observert et lignende mønster av utfoldelse.Men den sekundære strukturen til RNA omdav ikke. Dette er et godt eksempel for å vise hvilken stor innflytelse proteinbinding kan ha på RNA kinetikk. Ser på konstant kraftdata kan utfoldende kinetikk undersøkes nærmere.Avstanden over tid er plottet for forskjellige krefter, og histogrammet til de forskjellige observerte tilstandene legges til høyre. Ved 10 piconewton er RNA helt i foldet tilstand. På 11.5 piconewton bytter den mellom stater, og ved 13 piconewton er RNA permanent i utfoldet tilstand.Men da SARS-coronavirus-2 rammeskifteelementet ble målt sammen med ZAP, var RNA helt i utfoldet tilstand ved 11 piconewton, og viste til og med svært liten overgang til en brettet tilstand på 10 piconewton. Dette indikerer at ZAP binder seg til det enkelt strandede rammeskifteelementet og forhindrer dannelsen av en sekundær struktur. Til slutt vil vi se på noen optiske pinsettdata kombinert med konfikal mikroskopi.I dette eksperimentet ble det brukt et fluorescerende fargestoff som merker doble strandede nukleinsyrer, ikke spesielt med økende kraft. Kymografien viser at når perlene flyttes fra hverandre, øker fluorescensintensiteten og den forsvinner helt når tetheren er strukket for mye og bryter. I den siste figuren ble fluorescerende merkede ribosomer lagt til gjennom kanal fire.I dette eksperimentet ble det observert spesifikk ribosombinding til RNA-tetheren. Vi håper denne videoen ga deg et innblikk i optiske pinsett og hva som kan utføres denne utrolige teknikken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering av beslektede RNA-proteinkomplekser fra celler under anvendelse av oligonukleotid-rettet Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescens anisotropi som et verktøy for å studere protein-protein interaksjoner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativ Immunofluorescence å måle globale lokalisert oversettelse

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated celle-gjennomtrengende peptider å studere intracellulær Protein-protein interaksjoner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomet hele kvantifisering av oversettelse i spirende gjær av ribosom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskala kolorimetrisk analyser av intracellulær laktat og Pyruvate i Rundormer Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaksjoner med og membran Permeabilization av Brain mitokondrier av amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...