Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Vi tackar Anuja Kibe och jun. Prof. Redmond Smyth för att de kritiskt granskar manuskriptet. Vi tackar Tatyana Koch för teknisk experthjälp. Vi tackar Kristyna Pekarkova för hjälpen med att spela in experimentella videor. Arbetet i vårt laboratorium stöds av Helmholtz Association och finansiering från Europeiska forskningsrådets (ERC) anslag nr. 948636 (till NC).

1. Provberedning
<ol><li>Klona intressesekvensen i vektorn som innehåller Lambda DNA-fragment, som fungerar som handtagssekvenser (figur 2)43,50.</li>
	<li>Generera först en DNA-mall för efterföljande in vitro-transkription via PCR (figur 2B; reaktion 1). I detta PCR-steg läggs T7-promotorn till i 5' slutet av avkännings-DNA-molekylen32,33,43,50.<...

Här visar vi användningen av fluorescenskopplade optiska pincett för att studera interaktioner och dynamiskt beteende hos RNA-molekyler med olika ligands. Nedan diskuteras kritiska steg och begränsningar av den nuvarande tekniken.
Kritiska steg i protokollet Liksom för många andra metoder är provets kvalitet avgörande för att få tillförlitliga data. För att få prover av högsta möjliga kvalitet är det därför värt att spendera tid för att optimera procedur...

Överföring av genetisk information från DNA till proteiner genom mRNAs är en komplex biokemisk process, som regleras exakt på alla nivåer genom makromolekylära interaktioner inuti celler. För translationell reglering ger RNA-proteininteraktioner en kritisk roll för att snabbt reagera på olika stimuli och signaler1,2. Vissa RNA-proteininteraktioner påverkar mRNA-stabiliteten och ändrar därmed tiden då ett RNA är translationellt aktivt. Andra RNA-proteininteraktioner är associerade med recodingmekanismer såsom stop-codon readthrough, bypassing eller programmerad ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nyligen har ett antal RNA-bindande proteiner (RBPs) visat sig interagera med stimulerande mRNA-element och översättningsmaskineriet för att diktera när och hur mycket omkodning som kommer att ske i cellen7,8,9,10,11. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det därför avgörande att studera interaktionsprinciperna och mekaniska egenskaperna hos dessa RNA-proteinkomplex i detalj.
Årtionden av arbete har lagt grunden för att studera översättningsprocessen i flera steg och flera komponenter, som bygger på invecklad kommunikation mellan översättningsmaskineriets RNA- och proteinkomponenter för att uppnå hastighet och noggrannhet12,13,14. Ett viktigt nästa steg för att förstå komplexa regulatoriska händelser är att bestämma krafter, tidsskalor och strukturella bestämningsfaktorer under översättning med hög precision12,15,16,17. Studien av RNA-konformationsdynamik och särskilt hur transverkande hjälpfaktorer verkar på RNA-strukturen under översättningen har belysts ytterligare av framväxten av enmolekylverktyg, inklusive optiska pincett eller nolllägesvågledare16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optisk pincett (OT) representerar en mycket exakt enmolekylsteknik, som har tillämpats för att studera många typer av RNA-beroende dynamiska processer inklusive transkription och översättning26,27,28,29,30,31,32. Användningen av optiska pincett har gjort det möjligt att undersöka molekylära interaktioner, nukleinsyrastrukturer och termodynamiska egenskaper, kinetik och energier av dessa processer i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pincettanalys är baserad på entrapment av mikroskopiska objekt med en fokuserad laserstråle. I ett typiskt OT-experiment är molekylen av intresse bunden mellan två genomskinliga (vanligtvis polystyren) pärlor (figur 1A)27. Dessa pärlor fångas sedan av optiska fällor, som beter sig som fjädrar. Således kan kraften som appliceras på molekylen beräknas baserat på pärlans förskjutning från mitten av den fokuserade laserstrålen (trap center). Nyligen har optiska pincett kombinerats med konfokal mikroskopi (figur 1B), vilket möjliggör fluorescens- eller Fret-mätningar (Förster resonance energy transfer)40,41,42. Detta öppnar ett helt nytt fält av möjliga experiment som möjliggör samtidig mätning och därmed exakt korrelation av kraftspektroskopi och fluorescensdata.
Här demonstrerar vi experiment med optisk pincett i kombination med konfokal mikroskopi för att studera protein-RNA-interaktioner som reglerar translationell frameshifting. Mellan målet och kondensorn möjliggör en flödescell med fem kanaler kontinuerlig provtillämpning med laminärt flöde. Genom de mikrofluidiska kanalerna kan olika komponenter injiceras direkt, vilket minskar den praktiska tiden samt möjliggör mycket liten provförbrukning under hela experimentet.
För det första föreslås en grundläggande riktlinje för att hjälpa utformningen av OT-experiment och fördelar samt fallgropar för olika inställningar diskuteras. Därefter beskrivs förberedelsen av prover och experimentella arbetsflöden och ett protokoll för dataanalysen tillhandahålls. För att representera ett exempel beskriver vi resultaten från RNA stretching experiment för att studera SARS-CoV-2 frameshifting RNA element (Figur 2A) med den transverkande faktorn den korta isoformen zink-finger antiviralt protein (ZAP), som ändrar översättningen av virala RNA från en alternativ läsram43. Dessutom visas det att fluorescensmärkta ribosomer kan användas i denna OT-konfokala analys, vilket skulle vara användbart för att övervaka översättningsmaskineriets processivitet och hastighet. Metoden som presenteras här kan användas för att snabbt testa effekten av olika buffertar, ligands eller andra cellulära komponenter för att studera olika aspekter av översättning. Slutligen diskuteras vanliga experimentella fallgropar och hur man felsöker dem. Nedan beskrivs några viktiga punkter i experimentell design.
Konstruera design I princip finns det två vanliga metoder för att skapa en OT-kompatibel RNA-konstruktion. Det första tillvägagångssättet använder en lång RNA-molekyl som hybridiseras med kompletterande DNA-handtag, vilket ger en konstruktion bestående av två RNA/DNA-hybridregioner som flankerar en enkelsträngad RNA-sekvens i mitten (figur 2B). Detta tillvägagångssätt används i de flesta OT RNA-experiment33,44,45.
Den andra metoden drar nytta av dsDNA-handtag med korta (cirka 20 nt) överhäng15,17. Dessa överhäng hybridiseras sedan med RNA-molekylen. Även om det är mer komplicerat i design, övervinner användningen av dsDNA-handtag några av begränsningarna i DNA / RNA-hybridsystemet. I princip kan även mycket långa handtag (>10kb) genomföras, vilket är bekvämare för konfokala mätningar. Dessutom kan RNA-molekylen ligeras till DNA-handtag för att öka tjuderstabiliteten.
Strategi för slutmärkning Konstruktionen måste bindas till pärlor via en stark molekylär interaktion. Även om det finns metoder för kovalent bindning av handtag till pärlor46, används starka men icke-kovalenta interaktioner såsom streptavidin-biotin och digoxigenin-antikropp ofta i OT-experiment15,33,35,45. I det beskrivna protokollet är konstruktionen märkt med biotin eller digoxigenin, och pärlorna är belagda med streptavidin eller antikroppar mot digoxigenin (figur 1A). Detta tillvägagångssätt skulle vara lämpligt för att tillämpa krafter upp till cirka 60 pN (per tjuder)47. Dessutom gör användningen av olika 5' och 3' märkningsstrategier det möjligt att bestämma orienteringen av tjudret som bildas mellan pärlorna17.
Proteinmärkning för fluorescensmätningar För den konfokala avbildningen finns det flera vanliga metoder för fluorescensmärkning. Till exempel kan fluoroforer kovalent fästas vid aminosyrarester som finns infödda i proteiner eller introduceras av platsstyrd mutagenes genom en reaktiv organisk grupp. Tiool- eller aminreaktiva färgämnen kan användas för märkning av cystein- respektive lysinrester. Det finns flera reversibla skyddsmetoder för att öka specificiteten hos märkning48,49, men inhemska proteiner skulle vanligtvis märkas vid flera rester. Även om fluoroforens lilla storlek kan ge en fördel, kan icke-specifik märkning störa proteinaktiviteten och därmed kan signalintensiteten variera49. Beroende på märkningens effektivitet kan signalintensiteten också skilja sig mellan olika experiment. Därför bör en aktivitetskontroll utföras före experimentet.
Om proteinet av intresse innehåller en N- eller C-terminaltagg, till exempel en His-tag eller strep-tag, representerar specifik märkning av dessa taggar en annan populär metod. Dessutom minskar taggriktad märkning risken för att fluoroforen stör proteinaktiviteten och kan öka lösligheten49. Taggspecifik märkning ger dock vanligtvis monofluoformärkta proteiner, vilket kan vara utmanande att upptäcka. Ett annat sätt att specifik märkning kan uppnås genom att använda antikroppar.
Konfiguration av mikrofluidik Kombinationen av OT med ett mikrofluidiksystem möjliggör en snabb övergång mellan olika experimentella tillstånd. Dessutom drar strömsystem nytta av att upprätthålla det laminära flödet inuti flödescellen, vilket utesluter blandning av vätskor från andra kanaler i vinkelrät riktning i förhållande till flödesriktningen. Därför är laminärt flöde särskilt fördelaktigt för den experimentella designen. För närvarande används ofta flödesceller med upp till 5 kanaler (figur 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA antar olika strukturella veck, som är väsentliga för dess funktioner och därmed kan påverka olika processer i cellen. Dessutom kan strukturen och funktionen hos ett RNA moduleras av olika transverkande faktorer, såsom proteiner, metaboliter eller andra RNAs. Frameshifting RNA-molekyler, till exempel, är reglerande RNAs belägna i kodningsregioner, som direkt översätter ribosomer till en alternativ öppen läsram och därmed fungerar som genbrytare. De kan också anta olika veck efter bindning till proteiner eller andra transfaktorer. För att dissekera RNA-bindande proteiners roll i översättning och hur de modulerar RNA-struktur och stabilitet är det viktigt att studera samspelet och mekaniska egenskaper hos dessa RNA-proteinkomplex samtidigt. Detta arbete illustrerar hur man använder enmolekyl-fluorescenskopplade optiska pincett för att utforska det konformationella och termodynamiska landskapet av RNA-proteinkomplex med hög upplösning. Som ett exempel, interaktionen mellan SARS-CoV-2 programmerade ribosomal frameshifting element med den transverkande faktorn kort isoform av zink-finger antiviralt protein utarbetas. Dessutom övervakades fluorescensmärkta ribosomer med hjälp av den konfokala enheten, vilket i slutändan skulle möjliggöra studier av översättningsförlängning. Fluorescenskopplad OT-analys kan tillämpas i stor utsträckning för att utforska olika RNA-proteinkomplex eller transverkande faktorer som reglerar översättning och kan underlätta studier av RNA-baserad genreglering.

I detta avsnitt ges fokus främst på mätningar av RNA-protein/ligand interaktioner av fluorescens optisk pincett. För en beskrivning av allmänna RNA optiska pincettexperiment och motsvarande representativa resultat, se32. För mer detaljerad diskussion av RNA/DNA-proteininteraktionerna, se också1,2,26,59,60.
<p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Detta protokoll presenterar ett komplett experimentellt arbetsflöde för att studera RNA-proteininteraktioner med optisk pincett. Flera möjliga experimentella inställningar beskrivs inklusive kombinationen av optisk pincett med konfokal mikroskopi.

Optisk pincett för att studera RNA-proteininteraktioner i översättningsreglering

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Det övergripande målet med följande metodartikel är att visa ett protokoll som är användbart för att studera RNA-interaktioner med proteiner eller andra faktorer med optisk pincett i kombination med konfokal mikroskopi. Under det senaste decenniet har flera sofistikerade tekniker utvecklats för att undersöka egenskaperna hos enskilda makromolekyler. En av dessa tekniker är optiska pincett med en molekyl.Med de nya fluorescensassisterade optiska pincetterna kan inte bara krafter som krävs för utfällning av RNA-molekyler, liksom bindningshändelser under översättning övervakas i detalj. Här fokuserar vi på mätningar där RNA-molekyler sträcks med och utan att transacting faktorer som reglerar översättning. Vi illustrerar också hur tekniken kan tillämpas för att övervaka översättning med hjälp av märkta ribosomer.Protokollet kommer att demonstreras av två doktorander i min grupp, Lukas Pekarek och Stefan Park. I den här videon kommer vi att vägleda dig genom installationen och körningen av ett optiskt pincettexperiment. Vi beskriver också det enkla arbetsflödet för dataanalys.Fördelen med denna teknik är att den är enkel och robust. En molekyl är fastbunden mellan två pärlor, fastspända i fokus för laserstrålar, och förändring och kraft vid förskjutning kan mätas exakt i så kallade kraftrampexperiment. Sekundära strukturer inuti ett tjuder utvecklas vid en viss kraft beroende på molekylens inre energi.Denna dynamiska övergång mellan flera strukturer kan undersökas ytterligare med konstanta kraftmätningar. Dessutom kan parallell användning av fluorescerande avbildning användas för att visualisera bindningshändelser i realtid. En distinkt kraftavståndsprofil för en tjuder kan variera efter bindning av potentiella transacting faktorer som påverkar dess stabilitet.För det första måste RNA av intresse klonas till en DNA-vektor. Uppströms och nedströms denna sekvens, ytterligare delar, handtagen behövs för att binda den slutliga DNA-RNA-konstruktionen mellan pärlorna. Efter framgångsrik kloning och förstärkning av plasmid utförs tre olika PCR reaktioner.För varje PCR-reaktion, blanda reagenserna enligt tabell ett i protokollet. Kör PCR i 50 mikroliter alikvoter i en lämplig termisk cykelcyklist. Den första resulterar i ett dubbelsträngat DNA av hela konstruktionen med T7-promotorn för efterföljande in vitro-transkription.Den andra PCR producerar de fem främsta handtagen. Medan den sista reaktionen resulterar i de tre främsta handtagen. Både 5 prime och 3 prime handtag måste märkas enligt de använda pärlor.De tre främsta handtagen är märkta under PCR med hjälp av en digoxigenin märkt omvänd primer, och de fem främsta handtagen måste märkas i ett extra steg genom biotinylering. De tre främsta biotinyleringen av de fem främsta handtagen utförs med T 40 och ett polymeras. Reaktionen utförs i en till två timmar vid rumstemperatur.Utför sedan in vitro-transkriptionen med T7-polymeras. Inkubera reaktionen vid 37 grader i två till fyra timmar, beroende på längden på RNA. I ett sista steg glödgas handtagen med RNA från in vitro-transkriptionen för att erhålla den slutliga DNA-RNA-konstruktionen med den enda strandade intresseregionen mellan de dubbelsträngade handtagen.För att glödga den önskade RNA-DNA hybriden, blanda handtagen och RNA i glödgningsbuffert. Värm, glödgningsblandningen upp till 85 grader i 10 minuter och kyl sedan långsamt ner provet till fyra grader. Blanda glödggasprovet med 1/10 volym tre molarnatrietacetat och tre volymer iskall etanol och inkubera minus 80 grader i minst en timme.Centrifugera proverna vid 15 000 x g i 30 minuter vid fyra grader. Kassera supernatanten och torka pelleten under vakuum. Små alikvoter av den återsuspenderade pelleten fryses i flytande kväve och hålls på minus 80 grader tills de används.Ta först ut blekmedlet ur sprutorna och fyll i en ml RNase fritt vatten. Tillsätt 50 mikroliter av 0,5 molar natriumtiosulfat och tvätta systemet med en bar. Var försiktig så att det mikrofluidiska systemet aldrig torkar för att undvika luftbubblor i systemet.Kassera sedan den återstående natriumtiosulfatlösningen och byt ut sprutorna med nya. Tvätta sedan igen med minst 0,5 ml RNase fritt vatten. För att ställa in maskinens optiska system, sätt två droppar nedsänkningsolja på målet.Sätt flödescellen på plats och höj målet tills vätskan vidrör flödescellen. Lägg sedan två droppar nedsänkningsolja ovanpå flödescellen. Slå nu på fällans styrenhet och svällningslasern.Målet justeras med hjälp av Z-finderverktyget för maskinens diagnoskameror. Genom att vrida mikroskruven justeras Z-axeln till mitten av kammaren mellan den andra och den tredje reflektionen. Där refraktionsringarna är störst.Byt diagnostikkamerorna till månläge och minska svällningslasern till cirka 50 %Sänk sedan kondensorn och justera dess position så att du ser cirka 10 ljusband. Mätkammaren har fem kanaler, och före experimentet bör olika installationsmöjligheter övervägas. För ett enkelt kraftrampexperiment är pärlor-buffertpärlor ett bekvämt kanalarrangemang.För mätningar med den fjärde föreningen, som fluorescerande ribosomer eller transacting faktorer, pärlor-pärlor-buffertfaktor är ett bättre arrangemang, men det gör det svårare att fånga pärlor. En alikvot av den glödgade konstruktionen inkuberas med tre mikroliter AD pärla suspension, en mikroliter RNase inhibitorer och åtta mikroliter av analysbufferten vid rumstemperatur i 10 till 20 minuter. Därefter späds provet i 500 mikroliteranalysbuffert och sätts in i respektive kanal.För den andra typen av pärlor blandas 0,8 mikroliter assaypärlor med en ml analysbuffert och administreras i motsvarande kanal. Kanalerna öppnas och tvättas med lågt tryck. Slå på svällningslasern.För att fånga pärlor flyttas lasrarna från varandra och en AD-pärla fångas i fälla en. Därefter flyttas steget till SA-pärlan och en pärla fångas i fälla två. För att undvika att förlora pärlorna, eller för att fånga en andra i samma fälla, flyttas scenen till buffertkanalen och alla kanaler är stängda.I bufferten utförs en svällningskalibrering. De fångade pärlorna bör ställas in som visuella mallar för efterföljande mätningar. Och likhetspoängen bör hållas över 90% mellan mätningarna för att garantera jämförbarhet.Slutligen flyttas pärlorna närmare varandra och man kan börja fånga en enda tjuder. Detta görs för att flytta pärlorna nära i några sekunder och sedan långsamt lämna pärlorna igen. En tjuderbildning resulterar i en ökning av uppmätt kraft när de drar de två pärlorna bort från varandra.Antalet och kvaliteten på tjuder kan kontrolleras genom att hitta den översträckta platån och jämföra banan med den fritt ledade kedjan eller maskliknande kedjemodellen. Den översträckta platån bör vara mellan 50 och 60 piconewton för en enda tjuder. För att utföra fluorescensmätningarna, slå på konfokala lasrar och fotonräkning på enhets- och optisk pincettmaskin.Slå sedan på excitationslasern för önskad våglängd och programvarugränssnittet och ställ in laserns effekt på 5% eller högre, beroende på fluoroforen. Nu kan avbildning startas med hjälp av programvarans bild- eller kymografifunktioner. För att få välfokuserade bilder, se till att fokalplanet i det konfokala mikroskopet och de optiska fällorna är justerade.För detta ändamål kan autofluorescens av polystyrenpärlor i den blå laserkanalen användas. Flytta upp och ner med de optiska fällornas brännplan tills pärlornas autofluorescens når sin högsta diameter. I denna position kan fluorescenssignalerna som äger rum vid den tjudrade molekylen detekteras.För båda funktionerna är det viktigt att välja lämpliga regioner av intresse. Under hela mätningsbuffertens sammansättning kan enkelt ändras genom att antingen flytta pärlorna till olika kanaler eller genom att ändra bufferten som levereras i det mikrofluidiska systemet. För att undvika fotobleaching, stäng alltid av excitationslasern när du inte mäter.Rådatautgången från enheten innehåller ofta mycket brus. För att ytterligare analysera spridda data måste man därför först förbehandla dem. Det första steget är att ta ner provet och filtrera data med butterworthfiltret med lågt pass, bra resultat erhölls.För kraftrampsexperiment måste de utfällbara händelserna markeras i motsvarande vikta och utfällda regioner i den första avståndskurvan med hjälp av maskliknande kedjemodeller eller fritt ledade kedjemodeller. För konstantstyrkadata kan avståndet över tiden plottas och det är användbart att generera ett histogram för att kvantifiera den dominerande konformationen vid en given kraft. Här visas att filterparametrarna är avgörande för att skilja olika vikningstillstånd.För att bättre förstå vad som kan uppnås med denna teknik visas några representativa resultat. Så här ser en standardstyrka-avståndskurva från ett kraftrampexperiment ut. I det här fallet studerade vi SARS-coronavirus-2 ramskiftande element.Vi observerade utvecklas i flera steg runt 15 piconewton. När riktningen är omvänd och pärlorna kommer närmare igen, omvecklar tjudret tillbaka med något lägre kraft. När vi mätte samma RNA i närvaro av zinkfingret antivirala protein ZAP, observerades ett liknande mönster av utfällning.Men den sekundära strukturen av RNA omdrendes inte. Detta är ett bra exempel för att visa vilket stort inflytande proteinbindning kan ha på RNA-kinetik. Om man tittar på konstant kraftdata kan den utveckliga kinetiken undersökas ytterligare.Avståndet över tiden ritas för olika krafter och histogrammet av de olika observerade tillstånden läggs till höger. Vid 10 piconewton är RNA helt i vikt tillstånd. Vid 11.5 piconewton växlar det mellan påstår, och på 13 piconewton RNAEN är permanent i ett utveckat statligt.Men när SARS-coronavirus-2 ramskiftande element mättes tillsammans med ZAP, var RNA helt i ett utfällt tillstånd vid 11 piconewton, och visade till och med mycket liten övergång mot ett vikt tillstånd vid 10 piconewton. Detta indikerar att ZAP binder till det enda strandade ramförskjutningselementet och förhindrar bildandet av en sekundär struktur. Slutligen kommer vi att titta på några optiska pincettdata i kombination med konfokal mikroskopi.I detta experiment användes ett fluorescerande färgämne som märker dubbelsträngade nukleinsyror, icke specifikt med ökande kraft. Kymografin visar att när pärlorna flyttas ifrån varandra ökar fluorescensintensiteten och den försvinner helt när tjudret sträcks för mycket och bryts. I den sista figuren lades fluorescerande ribosomer till genom kanal fyra.I detta experiment observerades specifika ribosombindning till RNA-tjudern. Vi hoppas att den här videon gav dig en inblick i optiska pincett och vad som kan utföras denna otroliga teknik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering av besläktade RNA-proteinkomplex från celler med användning av oligonukleotid-riktad Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Fluorescensanisotropi som ett verktyg för att studera protein-proteininteraktioner

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Kvantitativa immunofluorescens åtgärd globala lokaliserad Översättning

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylerade Cell-penetrerande peptider att studera intracellulära Protein-protein interaktioner

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Småskaliga kolorimetriska analyser av intracellulära laktat och pyruvat i den nematoder Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vi

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...