Name: optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Anuja Kibe ve Jun. Prof. Redmond Smyth'e makaleyi eleştirel bir şekilde inceledikleri için teşekkür ederiz. Uzman teknik yardım için Tatyana Koch'a teşekkür ederiz. Kristyna Pekarkova'ya deneysel videoların kaydediltiren yardımı için teşekkür ederiz. Laboratuvarımızdaki çalışmalar Helmholtz Derneği tarafından desteklenmekte ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) Grant Nr. 948636 (NC'ye) fon sağlamıştır.

1. Numune hazırlama
<ol><li>İlgi sırasını, sap dizileri olarak hizmet eden Lambda DNA parçalarını içeren vektöre klonlayın (Şekil 2)43,50.</li>
	<li>İlk önce PCR ile sonraki in vitro transkripsiyon için bir DNA şablonu oluşturun (Şekil 2B; reaksiyon 1). Bu PCR adımında, T7 promotörü dna molekülünün 5' ucuna eklenir32,33,43,50.<s...

Burada, çeşitli ligandlarla RNA moleküllerinin etkileşimlerini ve dinamik davranışlarını incelemek için floresan bağlantılı optik cımbızların kullanımını gösteriyoruz. Aşağıda, mevcut tekniğin kritik adımları ve sınırlamaları tartışılmıştır.
Protokolde kritik adımlar Diğer birçok yöntemde olduğu gibi, numunenin kalitesi güvenilir veri elde etmek için çok önemlidir. Bu nedenle, mümkün olan en yüksek kalitede numuneler elde etmek ...

Genetik bilgilerin DNA'dan proteinlere mRNA'lar yoluyla aktarılması, hücrelerin içindeki makromoleküler etkileşimler yoluyla tüm seviyelerde hassas bir şekilde düzenlenen karmaşık bir biyokimyasal süreçtir. Çevirisel düzenleme için, RNA-protein etkileşimleri çeşitli uyaranlara ve sinyallere hızlı bir şekilde tepki vermek için kritik bir rol oynar1,2. Bazı RNA-protein etkileşimleri mRNA stabilitesini etkiler ve böylece bir RNA'nın çevirisel olarak aktif olduğu zamanı değiştirir. Diğer RNA-protein etkileşimleri stop-codon readthrough, bypass veya programlanmış ribozomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7 gibi yeniden kodlama mekanizmaları ile ilişkilidir. Son zamanlarda, hücrede ne zaman ve ne kadar yeniden kodlama olacağını dikte etmek için uyarıcı mRNA elemanları ve çeviri makineleri ile etkileşime giren bir dizi RNA bağlayıcı protein (RBP) gösterilmiştir7,8,9,10,11. Bu nedenle, RNA bağlayıcı proteinlerin çevirideki rolünü ve RNA yapısını ve stabilitesini nasıl modüle ettiklerini incelemek için, bu RNA-protein komplekslerinin etkileşim ilkelerini ve mekanik özelliklerini ayrıntılı olarak incelemek çok önemlidir.
Onlarca yıllık çalışma, hız ve doğruluk elde etmek için çeviri makinelerinin RNA ve protein bileşenleri arasındaki karmaşık iletişime dayanan çok adımlı ve çok bileşenli çeviri sürecini incelemek için temel atmıştır12,13,14. Karmaşık düzenleyici olayları anlamanın önemli bir sonraki adımı, çeviri sırasındaki kuvvetleri, zaman ölçeklerini ve yapısal belirleyicileri yüksek hassasiyetle belirlemektir12,15,16,17. RNA konformasyonel dinamiklerinin incelenmesi ve özellikle trans-etkili yardımcı faktörlerin çeviri sırasında RNA yapısı üzerinde nasıl hareket ettiği, optik cımbız veya sıfır mod dalga kılavuzları dahil olmak üzere tek moleküllü araçların ortaya çıkmasıyla daha da aydınlatılmıştır16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Optik cımbızlar (OT), transkripsiyon ve çeviri dahil olmak üzere birçok RNA'ya bağımlı dinamik süreci incelemek için uygulanan son derece hassas bir tek molekül tekniğini temsil eder26,27,28,29,30,31,32. Optik cımbız kullanımı moleküler etkileşimlerin, nükleik asit yapılarının ve termodinamik özelliklerin, kinetiğin ve enerjiklerinin ayrıntılı olarak araştırılmasına izin almıştır16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optik cımbız tahlilleri, mikroskobik nesnelerin odaklanmış bir lazer ışını ile tuzağa getirilmesine dayanır. Tipik bir OT deneyinde, ilgi molekülü iki şeffaf (genellikle polistiren) boncuk (Şekil 1A)27 arasında birbirine bağlıdır. Bu boncuklar daha sonra yaylar gibi davranan optik tuzaklar tarafından yakalanır. Böylece moleküle uygulanan kuvvet, boncukun odaklanmış lazer ışınının (tuzak merkezi) merkezinden yer değiştirmesi esas alınarak hesaplanabilir. Son zamanlarda optik cımbız konfokal mikroskopi (Şekil 1B) ile birleştirilerek floresan veya Förster rezonans enerji transferi (FRET) ölçümleri40,41,42 olarak mümkün olmuştur. Bu, eşzamanlı ölçüme ve dolayısıyla kuvvet spektroskopisi ve floresan verilerinin kesin korelasyonuna izin vererek yepyeni bir olası deney alanı açar.
Burada, çevirisel çerçevelemeyi düzenleyen protein-RNA etkileşimlerini incelemek için konfokal mikroskopi ile birlikte optik cımbız kullanarak deneyler gösteriyoruz. Amaç ve kondenser arasında, beş kanallı bir akış hücresi laminer akış ile sürekli numune uygulaması sağlar. Mikroakışkan kanallar aracılığıyla, çeşitli bileşenler doğrudan enjekte edilebilir, bu da uygulamalı zamanı azaltır ve deney boyunca çok az numune tüketimine izin verir.
İlk olarak, OT deneylerinin tasarımına yardımcı olacak temel bir kılavuz önerilmektedir ve avantajların yanı sıra çeşitli kurulumların tuzakları tartışılmaktadır. Daha sonra, örneklerin ve deneysel iş akışlarının hazırlanması açıklanır ve veri analizi için bir protokol sağlanır. Bir örneği temsil etmek için, sars-CoV-2 çerçeve değiştirme RNA elemanını (Şekil 2A) trans-etkili faktörle incelemek için RNA germe deneylerinden elde edilen sonuçları özetliyoruz, çinko-parmak antiviral proteininin (ZAP) kısa izoformunu, viral RNA'nın alternatif bir okuma çerçevesinden çevirisini değiştiren43. Ek olarak, çeviri makinelerinin prosesliğini ve hızını izlemek için yararlı olacak bu OT konfokal testinde floresan etiketli ribozomların kullanılabileceği gösterilmiştir. Burada sunulan yöntem, çevirinin çeşitli yönlerini incelemek için farklı tamponların, ligandların veya diğer hücresel bileşenlerin etkisini hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Son olarak, yaygın deneysel tuzaklar ve bunların nasıl giderileceği tartışılır. Aşağıda, deneysel tasarımda bazı önemli noktalar özetlenmiştir.
Tasarım oluşturma Prensip olarak, OT uyumlu bir RNA yapısı oluşturmak için iki ortak yaklaşım vardır. İlk yaklaşım, tamamlayıcı DNA tutamaçlarıyla melezlenen uzun bir RNA molekülü kullanmaktadır, böylece ortada tek iplikli bir RNA dizisini kuşatan iki RNA / DNA melez bölgesinden oluşan bir yapı elde edilir (Şekil 2B). Bu yaklaşım çoğu OT RNA deneyinde 33,44,45'te kullanılır.
İkinci yaklaşım, kısa (yaklaşık 20 nt) çıkıntilı dsDNA tutamaçlarından yararlanır15,17. Bu çıkıntılar daha sonra RNA molekülü ile melezlenir. Tasarımda daha karmaşık olmasına rağmen, dsDNA tutamaklarının kullanımı DNA / RNA-hibrid sisteminin bazı sınırlamalarının üstesinden geliyor. Prensip olarak, konfokal ölçümler için daha uygun olan çok uzun tutamaklar (>10kb) bile uygulanabilir. Ek olarak, RNA molekülü, bağ stabilitesini artırmak için DNA tutamaklarına bağlanabilir.
Son etiketleme stratejisi Yapı, güçlü bir moleküler etkileşim yoluyla boncuklara bağlanmalıdır. Sapların boncuklara doğru kurcalanabilir bağlanması için yaklaşımlar mevcut olsa da, streptavidin-biotin ve digoksigenin-antikor gibi güçlü ancak yaygın olmayan etkileşimler OT deneylerinde yaygın olarak kullanılmaktadır15,33,35,45. Açıklanan protokolde, yapı biotin veya digoksigenin ile etiketlenmiştir ve boncuklar sırasıyla streptavidin veya digoksigenin'e karşı antikorlarla kaplanmıştır (Şekil 1A). Bu yaklaşım, yaklaşık 60 pN'a (bağlama başına)47'ye kadar kuvvet uygulamak için uygundur. Ayrıca, farklı 5' ve 3' etiketleme stratejilerinin kullanılması, boncuklar arasında oluşan bağın yönünün belirlenmesine izin verir17.
Floresan ölçümleri için protein etiketleme Konfokal görüntüleme için floresan etiketleme için yaygın olarak kullanılan birkaç yaklaşım vardır. Örneğin, floroforlar proteinlerde doğal olarak bulunan veya reaktif organik bir grup aracılığıyla bölgeye yönlendirilmiş mutajensis tarafından tanıtılan amino asit kalıntılarına aktif olarak bağlanabilir. Sistein ve lizin kalıntılarının etiketlenebilmesi için sırasıyla tiyol veya amin reaktif boyalar kullanılabilir. Etiketlemenin özgüllüğünü artırmak için birkaç ters çevrilebilir koruma yöntemi vardır48,49, ancak yerel proteinler genellikle birden fazla kalıntıda etiketlenir. Floroforun küçük boyutu bir avantaj sağlasa da, spesifik olmayan etiketleme protein aktivitesini etkileyebilir ve bu nedenle sinyal yoğunluğu değişebilir49. Ayrıca, etiketleme verimliliğine bağlı olarak sinyal yoğunluğu farklı deneyler arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, denemeden önce bir etkinlik denetimi yapılmalıdır.
İlgi proteini, His-tag veya strep-tag gibi bir N veya C-terminal etiketi içeriyorsa, bu etiketlerin özel etiketlemesi başka bir popüler yaklaşımı temsil eder. Ayrıca, etiket hedefli etiketleme, floroforun protein aktivitesini engelleme şansını azaltır ve çözünürlüğü artırabilir49. Bununla birlikte, etikete özgü etiketleme genellikle mono-florofor etiketli proteinler verir ve bu da tespit edilmesi zor olabilir. Spesifik etiketlemenin başka bir yolu antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Mikroakışkanlar kurulumu OT'nin mikroakışkanlar sistemi ile kombinasyonu, farklı deneysel koşullar arasında hızlı bir geçiş sağlar. Ayrıca, akım sistemleri akış hücresinin içindeki laminar akışı korumaktan yararlanır, bu da diğer kanallardan gelen sıvıların akış yönüne göre dik yönde karıştırılmasını önler. Bu nedenle, laminar akış özellikle deneysel tasarım için avantajlıdır. Şu anda, 5 kanala kadar akış hücreleri yaygın olarak dirilmektedir (Şekil 3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacterial Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli HB101</td>
			<td>lab collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cloning of the vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31424</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-16-dUTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093070910</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4737</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Melford Labs</td>
			<td>D11000</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>11786181</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814320001</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Oxygen scavanger system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN78.3</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>529552-1KG</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio Clontech</td>
			<td>R050A</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0296L</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Molox</td>
			<td>1000379515</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rNTPS</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>R0481</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulophate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6672-500G</td>
			<td>Bleach deactivation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>confocal measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td>Biotinylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 exonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0363S</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA polymerase</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>in vitro transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0267S</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq ligase</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>L6060L</td>
			<td>Gibson assembly, cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20 BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td>
			<td>Nanotemper</td>
			<td>MO-L011</td>
			<td>Used for ribosome labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purefrex 2.0</td>
			<td>GeneFrontier</td>
			<td>PF201-0.25-EX</td>
			<td>Ribosomes used for the labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle T7 forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CTTAATACGACTCACTATAGGTC 
			CTTTCTGTGGACGCC - 3&#8217;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -&#160; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3&#39; , used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; handle reverse</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#8217; - CATAAATACCTCTTTACTAATATA 
			TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3&#8217;, used to generate 5&#39; handle in PCR 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle forward</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC 
			AG - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; handle reverse 5&#8217;labeled with digoxigenin</td>
			<td>Microsynth</td>
			<td>custom order</td>
			<td>5&#39; -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3&#39;, used to generate 3&#39; handle in PCR 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMZ_OT</td>
			<td>produced in-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>further description in &#34;Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control&#34; 
			Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley 
			bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atom</td>
			<td>https://atom.io/packages/ide-python</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluelake</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InkScape 0.92.3</td>
			<td>https://inkscape.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POTATO</td>
			<td>https://github.com/lpekarek/POTATO.git</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAstructure</td>
			<td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>https://www.spyder-ide.org/</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 &#181;m, 5 ml, 1.0% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-15-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 &#181;m, 2 ml, 0.1% w/v</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TERUMO SS+03L1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-trap</td>
			<td>Lumicks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;optical tweezers coupled with confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical tweezers to study rna-protein interactions in translation regulation

RNA, işlevleri için gerekli olan ve böylece hücredeki çeşitli süreçleri etkileyebilen çeşitli yapısal kıvrımları benimsemiştir. Ek olarak, bir RNA'nın yapısı ve işlevi proteinler, metabolitler veya diğer RNA'lar gibi çeşitli trans-etkili faktörler tarafından modüle edilebilir. Örneğin, karek değiştirme RNA molekülleri, ribozomları alternatif bir açık okuma çerçevesine yönlendiren ve böylece gen anahtarları olarak hareket eden kodlama bölgelerinde bulunan düzenleyici RNA'lardır. Ayrıca proteinlere veya diğer trans faktörlere bağlanmasından sonra farklı kıvrımları benimseyebilirler. RNA bağlayıcı proteinlerin çevirideki rolünü ve RNA yapısını ve stabilitesini nasıl modüle ettiklerini incelemek için, bu RNA-protein komplekslerinin etkileşim ve mekanik özelliklerini aynı anda incelemek çok önemlidir. Bu çalışma, RNA-protein komplekslerinin konformasyonsal ve termodinamik manzarasını yüksek çözünürlükte keşfetmek için tek moleküllü floresan bağlantılı optik cımbızın nasıl kullanılacağını göstermektedir. Örnek olarak, SARS-CoV-2 programlı ribozomal çerçeve değiştirme elemanının çinko-parmak antiviral proteininin trans-etkili faktör kısa izoformu ile etkileşimi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ek olarak, floresan etiketli ribozomlar konfokal ünite kullanılarak izlendi ve bu da sonuçta çeviri uzamasının incelenmesini sağlayacaktı. Floresan bağlantılı OT tahlili, çeviriyi düzenleyen çeşitli RNA-protein komplekslerini veya trans-etkili faktörleri araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir ve RNA tabanlı gen düzenleme çalışmalarını kolaylaştırabilir.

Bu bölümde ağırlıklı olarak floresan optik cımbız ile RNA-protein/ligand etkileşimlerinin ölçümlerine odaklanılmalıdır. Genel RNA optik cımbız deneylerinin ve buna karşılık gelen temsili sonuçların açıklaması için bkz. RNA/DNA-protein etkileşimlerinin daha ayrıntılı tartışılması için ayrıca bkz.
...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation at JoVE.com

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Bu protokol, optik cımbız kullanarak RNA-protein etkileşimlerini incelemek için eksiksiz bir deneysel iş akışı sunar. Optik cımbızın konfokal mikroskopi ile kombinasyonu da dahil olmak üzere çeşitli olası deneysel kurulumlar özetlenmiştir.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Aşağıdaki yöntem makalesinin genel amacı, konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş optik cımbız kullanarak proteinlerle veya diğer faktörlerle RNA etkileşimlerini incelemek için yararlı bir protokol göstermektir. Son on yılda, tek makromoleküllerin özelliklerini araştırmak için çeşitli sofistike teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerden biri de tek molekülli optik cımbızdır.Yeni floresan destekli optik cımbızla, sadece RNA moleküllerinin açılmak için gerekli kuvvetlerin yanı sıra çeviri sırasındaki bağlama olayları ayrıntılı olarak izlenebilir. Burada, RNA moleküllerinin çeviriyi düzenleyen faktörlerle ve işlemeden gerildiği ölçümlere odaklanıyoruz. Ayrıca, etiketli ribozomlar kullanılarak çeviriyi izlemek için tekniğin nasıl uygulanabileceğini de göstermektedir.Protokol, grubumdaki iki yüksek lisans öğrencisi Lukas Pekarek ve Stefan Park tarafından gösterilecek. Bu videoda, optik cımbız deneyinin kurulumu ve yürütülmesinde size rehberlik edeceğiz. Ayrıca basit veri analizi iş akışını da özetliriz.Bu tekniğin avantajı basit ve sağlam olmasıdır. Bir molekül iki boncuk arasında bağlanır, lazer ışınlarının odağına bağlanır ve yer değiştirme üzerine değişim ve kuvvet, kuvvet rampası deneylerinde tam olarak ölçülebilir. Bir bağın içindeki ikincil yapılar, molekülün iç enerjiye bağlı olarak belirli bir kuvvette ortaya çıkıyor.Birden fazla yapı arasındaki bu dinamik geçiş, sabit kuvvet ölçümleri ile daha fazla araştırılabilir. Ayrıca, floresan görüntülemenin paralel kullanımı, bağlama olaylarını gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için kullanılabilir. Bir bağın belirgin bir kuvvet mesafesi profili, stabilitesini etkileyen potansiyel işlem faktörlerinin bağlanmasından sonra değişebilir.İlk olarak, ilgi çekici RNA bir DNA vektörüne klonlandırılmalıdır. Bu dizinin yukarı ve aşağı akışı, boncuklar arasında son DNA-RNA yapısını bağlamak için ek parçalar, tutamaklar gereklidir. Plazmidde başarılı klonlama ve amplifikasyondan sonra üç farklı PCR reaksiyonu gerçekleştirilir.Her PCR reaksiyon için, reaktifleri protokoldeki tablo bire göre karıştırın. PCR'ı uygun bir termal çevrimde 50 mikroliter aliquots'ta çalıştırın. İlki, sonraki in-vitro transkripsiyon için T7 promotörü ile tüm yapının çift iplikli DNA'sı ile sonuçlanır.İkinci PCR beş asal tutamak üretir. Oysa son reaksiyon üç asal tutamakla sonuçlanır. Kullanılan boncuklara göre hem 5 asal hem de 3 asal tutamak etiketlendirilmelidir.Üç asal tutamak PCR sırasında ters astar etiketli bir digoksitin kullanılarak etiketlenir ve beş asal tutamak biyotinilasyon yoluyla ekstra bir adımda etiket edilmelidir. Beş asal sapın üç asal biyotinilasyonu T 40 ve bir polimeraz kullanılarak gerçekleştirilir. Reaksiyon oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca gerçekleştirilir.Daha sonra, T7 polimeraz kullanarak in-vitro transkripsiyonu gerçekleştirin. RNA'nın uzunluğuna bağlı olarak reaksiyonun 37 derecesini iki ila dört saat boyunca kuluçkaya yatırın. Son bir adımda, tutamaklar, çift iplikli tutamaklar arasındaki tek iplikli ilgi alanı ile son DNA-RNA yapısını elde etmek için in-vitro transkripsiyondan RNA ile tavlanır.İstenilen RNA-DNA melezini tavlamak için sapları ve RNA'yı tavlama tamponunda karıştırın. Isı, tavlama karışımı 10 dakika boyunca 85 dereceye kadar ve ardından numuneyi yavaşça dört dereceye kadar soğutun. Tavlanmış numuneyi üç azı dişi sodyum asetat hacminin 1/10'u ve üç hacimli buz soğuk etanol ile karıştırın ve en az bir saat boyunca eksi 80 derece kuluçkaya yatırın.Numuneleri 15.000 xg'de 30 dakika boyunca dört derecede santrifüj edin. Süpernatant atın ve peletin vakum altında kurutun. Yeniden kullanılan peletlerin küçük aliquotları sıvı nitrojen içinde dondurulur ve kullanılana kadar eksi 80 derecede tutulur.İlk önce çamaşır suyunu şırınnalardan çıkarın ve bir mL RNase içermeyen su doldurun. 50 mikroliter 0,5 molar sodyum tiyosülfat ekleyin ve sistemi tek çubukla yıkayın. Sistemdeki hava kabarcıklarını önlemek için mikroakışkan sistemin asla kuru olmadığına dikkat edin.Daha sonra, kalan sodyum tiyosülfat çözeltisini atın ve şırıngları yenileriyle değiştirin. Daha sonra en az 0,5 mL RNase içermeyen su ile tekrar yıkayın. Makinenin optik sistemini kurmak için hedefe iki damla daldırma yağı koyun.Akış hücresini yerine yerleştirin ve sıvı akış hücresine dokunana kadar hedefi yükseltin. Daha sonra akış hücresinin üzerine iki damla daldırma yağı koyun. Şimdi tuzak direksiyon ünitesini ve bindirme lazerini açın.Amaç, makinenin tanı kameralarının Z bulucu aracı kullanılarak ayarlanır. Mikro vida döndürülerek, Z ekseni ikinci ve üçüncü yansıma arasındaki odanın ortasına ayarlanır. Kırılma halkalarının en büyük olduğu yer.Tanı kameralarını ay moduna geçirin ve bindirme lazerini yaklaşık% 50'ye düşürün, ardından kondenseri 20'ye düşürün ve konumunu yaklaşık 10 ışık bandı görecek şekilde ayarlayın. Ölçüm odasının beş kanalı vardır ve deneyden önce farklı kurulum olanakları göz önünde bulundurulmalıdır. Basit bir kuvvet rampası deneyi için boncuk-tampon boncukları uygun bir kanal düzenlemesidir.Floresan ribozomlar veya işlem faktörleri gibi dördüncü bileşikle yapılan ölçümler için boncuk-boncuk tampon faktörü daha iyi bir düzenlemedir, ancak boncuk yakalamayı zorlaştırır. Tavlanmış yapının bir aliquot'ı üç mikroliter AD boncuk süspansiyonu, bir mikroliter RNaz inhibitörü ve 10 ila 20 dakika boyunca oda sıcaklığında test tamponunun sekiz mikroliteri ile inkübe edilir. Daha sonra numune 500 mikroliter test tamponunda seyreltilir ve ilgili kanala konur.İkinci tür boncuklar için, 0,8 mikroliter tahlil boncukları bir mL tahlil tamponu ile karıştırılır ve ilgili kanala uygulanır. Kanallar açılır ve düşük basınçla yıkanır. Şimdi bindirme lazerini aç.Boncukları yakalamak için lazerler birbirinden ayrılır ve bir AD boncuk tuzak bire yakalanır. Daha sonra sahne SA boncuk kanalına taşınır ve bir boncuk ikinci tuzağa yakalanar. Boncukları kaybetmemek veya aynı tuzakta ikincisini yakalamak için aşama arabellek kanalına taşınır ve tüm kanallar kapatılır.Tamponda, bir bindirme kalibrasyonu gerçekleştirilir. Yakalanan boncuklar sonraki ölçümler için görsel şablonlar olarak ayarlanmalıdır. Ve benzerlik puanı, karşılaştırılabilmeyi garanti etmek için ölçümler arasında% 90'ın üzerinde tutulmalıdır.Son olarak, boncuklar birbirine yakınlaştırılır ve tek bir bağ yakalamaya başlayabilir. Bu, boncukları birkaç saniyeliğine yakın bir şekilde hareket ettirerek ve ardından boncukları yavaşça tekrar terk ederek yapılır. Bir bağ oluşumu, iki boncuk birbirinden uzaklaştıktan sonra ölçülen kuvvetin artmasına neden olur.Bağlamaların sayısı ve kalitesi, aşırı uzanma platosu bulunarak kontrol edilebilir ve yörüngeyi serbestçe birleşmiş zincir veya solucan benzeri zincir modeli ile karşılaştırabilir. Geniş plato, tek bir bağ için 50 ila 60 piconewton arasında olmalıdır. Floresan ölçümlerini gerçekleştirmek için konfokal lazerleri açın ve ünite ve optik cımbız makinesinde foton sayımını açın.Daha sonra, istenen dalga boyunun ve yazılım arayüzünün uyarlama lazerini açın ve florofora bağlı olarak lazerin gücünü% 5 veya daha yüksek olarak ayarlayın. Artık yazılımın görüntü veya kimograf fonksiyonları kullanılarak görüntüleme başlatılabilir. İyi odaklanmış görüntüler elde etmek için, konfokal mikroskop ve optik tuzakların odak düzleminin hizalı olduğundan emin olun.Bu amaçla mavi lazer kanalındaki polistiren boncukların otoflüoresansı kullanılabilir. Boncukların otofluoresansı en yüksek çapa ulaşana kadar optik tuzakların odak düzlemi ile yukarı ve aşağı hareket edin. Bu pozisyonda, bağlı molekülde gerçekleşen floresan sinyalleri tespit edilebilir.Her iki işlev için de uygun ilgi alanlarını seçmek önemlidir. Ölçüm boyunca tampon bileşimi, boncukların farklı kanallara taşınması veya mikroakışkan sistemde sağlanan tamponun değiştirilmesiyle kolayca değiştirilebilir. Fotobleaching önlemek için, ölçüm değilken her zaman excitation lazer kapatın.Cihazdan gelen ham veri çıkışı genellikle çok fazla gürültü içerir. Bu nedenle, dağınık verileri daha fazla analiz etmek için, önce bunları önceden işlemek gerekir. İlk adım, numuneyi aşağı çekmek ve verileri düşük geçişli Butterworth filtresiyle filtrelemektir, iyi sonuçlar elde edilmiştir.Kuvvet rampası deneyleri için, açılan olayların ilk mesafe eğrisinin ilgili katlanmış ve açılmamış bölgelerinde işaretlenmiş olması gerekir solucan benzeri zincir veya serbestçe eklemlenmiş zincir modelleri kullanılarak takılabilir. Sabit kuvvet verileri için, zaman üzerindeki mesafe çizilebilir ve belirli bir kuvvetteki baskın uygunluğu ölçmek için bir histogram oluşturmak yararlıdır. Burada, filtre parametrelerinin farklı katlama durumlarını ayırt etmek için çok önemli olduğu gösterilmiştir.Bu teknikle neler başarılabilir daha iyi anlamak için bazı temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bir kuvvet rampası deneyinden standart bir kuvvet mesafesi eğrisi böyle görünür. Bu durumda SARS-coronavirus-2 kare değiştirme elemanını inceledik.15 piconewton civarında birden fazla adımda açılma gözlemledik. Yön tersine çevrildiğinde ve boncuklar tekrar yaklaştığında, bağ biraz daha düşük kuvvette geri katlanır. Çinko parmak antiviral protein ZAP varlığında aynı RNA'yı ölçtürürken, benzer bir açılma patörü gözlendi.Ancak RNA'nın ikincil yapısı yeniden kata çıkmadı. Bu, protein bağlamanın RNA kinetiği üzerinde ne kadar büyük bir etkisi olabileceğini göstermek için iyi bir örnektir. Sürekli kuvvet verilerine bakıldığında, ortaya çıkan kinetikler daha fazla araştırılabilir.Zaman içinde mesafe farklı kuvvetler için çizilir ve sağda farklı gözlemlenen durumların histogramı eklenir. 10 piconewton'da, RNA tamamen katlanmış durumdadır. 11.5 piconewton'da eyaletler arasında geçiş yapılır ve 13 piconewton'da RNA kalıcı olarak açılmamış bir durumdadır.Bununla birlikte, SARS-coronavirus-2 kare kaydırma elemanı ZAP ile birlikte ölçüldüğünde, RNA 11 piconewton'da tamamen açılmış durumdaydı ve hatta 10 piconewton'da katlanmış bir duruma doğru çok az geçiş gösterdi. Bu, ZAP'ın tek bir iplikli çerçeve kaydırma elemanına bağlandığını ve ikincil bir yapının oluşumunu engellediğini gösterir. Son olarak, konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş bazı optik cımbız verilerine bakacağız.Bu deneyde, çift iplikli nükleik asitleri etiketleyen bir floresan boya kullanıldı, özellikle artan kuvvetle değil. Kimograf, boncuklar birbirinden uzaklaştıkça floresan yoğunluğunun arttığını ve bağ çok fazla gerildikten ve koptuğunda tamamen kaybolduğunu göstermektedir. Son rakamda floresan etiketli ribozomlar kanal 4'e eklendi.Bu deneyde RNA bağına özgü ribozom bağlanması gözlenmiştir. Umarız bu video size optik cımbızlar ve bu inanılmaz tekniğin neler yapabileceği hakkında bir fikir vermiştir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...