Name: microinjection method for anopheles gambiae embryos
Uploaded: 2021-07-07T13:00:00
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Estamos agradecidos a Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell y Madeline Nottoli por la cría de mosquitos. La financiación fue proporcionada por la Iniciativa de Malaria de la Universidad de California, Irvine. AAJ es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.

1. Preparación de mosquitos para la microinyección
<ol><li>Separe una jaula13 (~ 5000 cm3) con ~ 100 machos y 200-300 hembras 1-2 días adultos post-eclosión mosquitos y déjelos aparearse durante 2 días.</li>
	<li>Después del período de apareamiento, proporcione a los mosquitos una comida de sangre utilizando 2 ml de sangre con un dispositivo de alimentación artificial o animales vivos anestesiados dependiendo de las prácticas insectarias14. Al día si...

<ol>
	<li>Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Needle+Microinjection:+A+Brief+History.">Needle Microinjection: A Brief History.</a> Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Meredith, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+and+expression+of+an+anti-malarial+gene+in+transgenic+Anopheles+gambiae+significantly+reduces+Plasmodium+infections.">Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections.</a> PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li><li>Carballar-Lejarazu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+gambiae.">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li><li>Sim&#245;es, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anopheles+FBN9+immune+factor+mediates+Plasmodium+species-specific+defense+through+transgenic+fat+body+expression.">The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression.</a> Develomental &amp; Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).</li><li>Arik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Akt+signaling+in+the+mosquito+fat+body+increases+adult+survivorship.">Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship.</a> FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).</li><li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+olfactory+centres+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature Communications. 7, 13010 (2016).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Dong, Y., Sim&#245;es, M. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+transgenic+multistage+effector-gene+combinations+for+Plasmodium+falciparum+suppression+in+Anopheles.">Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles.</a> Science Advances. 6 (20), (2020).</li><li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+malaria+vector,+Anopheles+gambiae,+with+the+piggyBac+transposable+element.">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).</li><li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Anopheles+research.+Chapter+3:+Specific+Anopheles+techniques.+3.1+Embryonic+Techniques.+3.1.1+Microinjection+methods+for+Anopheles+Embryos.">Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos.</a> BEI resources. , (2015).</li><li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito,+Anopheles+stephensi.">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).</li><li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pragmatic+selection+of+larval+mosquito+diets+for+insectary+rearing+of+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti.">Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).</li><li>Carballar-Lejaraz&#250;, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission.">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li></ol>

Con la mayor disponibilidad de tecnologías de ingeniería genética precisas y flexibles como CRISPR/Cas9, los organismos transgénicos pueden desarrollarse de una manera más directa y estable de lo que era posible anteriormente. Estas herramientas han permitido a los investigadores crear cepas transgénicas de mosquitos vectores que están muy cerca de lograr las propiedades deseadas de refractariedad a patógenos (modificación de la población) o esterilidad hereditaria (supresión de la población). Sin embargo, pa...

Las técnicas de microinyección se han utilizado para manipular experimentalmente organismos desde principios de 19001. La microinyección se ha utilizado para estudiar tanto las funciones biológicas básicas como para introducir cambios importantes en la biología de un organismo deseado. La técnica de microinyección ha sido de particular interés para los biólogos vectoriales y ha sido ampliamente utilizada para manipular genomas vectoriales2-11. Los experimentos de transgénesis en vectores de artrópodos a menudo tienen como objetivo hacer que los vectores sean menos eficientes en la transmisión de patógenos al promulgar cambios que disminuyen la aptitud de un vector o aumentan la refractariedad a los patógenos que transmiten. Los mosquitos transmiten una variedad de patógenos humanos y tienen un impacto significativo en la morbilidad y la mortalidad en todo el mundo. El género de mosquitos Anopheles transmite los patógenos parásitos de la malaria humana, Plasmodium spp. Los experimentos de ingeniería genética con Anopheles han tenido como objetivo comprender mejor la biología y reducir la capacidad vectorial de estos mosquitos en los esfuerzos por desarrollar nuevas estrategias de eliminación de la malaria.
Los mosquitos vectores que contribuyen con la mayor cantidad de infecciones de malaria en todo el mundo se encuentran en el complejo de especies anopheles gambiae. Sin embargo, la mayoría de los experimentos exitosos de transgénesis se han realizado en el vector de la malaria del subcontinente indio, Anopheles stephensi. Si bien existen muchas cepas de Anopheles gambiae adaptadas al laboratorio, el número de líneas transgénicas de Anopheles gambiae spp. reportadas en la literatura no se compara con el de Anopheles stephensi. Se cree que el embrión de Anopheles gambiae es más difícil de inyectar y lograr una transgénesis exitosa que Anopheles stephensi,aunque se desconocen las razones de estas diferencias. Este protocolo describe un método que ha demostrado ser consistentemente exitoso en el logro de la transgénesis de embriones de Anopheles gambiae a través de la microinyección. El protocolo se basa en un método previamente desarrollado por Hervé Bossin y Mark Benedict12 con algunos detalles adicionales y alteraciones añadidas que se han encontrado para aumentar la eficiencia de la transgénesis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Microinjection Buffer</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td >1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td ></td>
			<td >Neatly and straightly cut into 2x1 cm piece</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene)</td>
			<td >Fisher Brand</td>
			<td ></td>
			<td >Ends cut</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >De-ionized or double-distilled water (ddH20)&#160;</td>
			<td >Mili-Q</td>
			<td ></td>
			<td >In a wash bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting microscope&#160;</td>
			<td >Leica&#160;</td>
			<td >Leica MZ12</td>
			<td >For embryo alignment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >No. 5 size&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass container&#160;</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td >No. 3140</td>
			<td >125 x 65</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass slide&#160;</td>
			<td >Fisher Brand</td>
			<td >No. 12-549-3</td>
			<td >75x26 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator</td>
			<td >Barnsted Lab-line</td>
			<td >Model No. 150</td>
			<td >28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCl</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >50 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Latex dental film&#160;</td>
			<td >Crosstex International</td>
			<td >No. 19302</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microinjector</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td ></td>
			<td >XenoWorks Digital Microinjector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microloader Pipette tips&#160;</td>
			<td >Eppendorf&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >20 &#181;L microloader epT.I.P.S.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micromanipulator</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td ></td>
			<td >XenoWorks Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette&#160;</td>
			<td >Rainin&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette puller&#160;</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >Sutter P-2000 micropipette puller</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td >Leica</td>
			<td >DM 1000 LED or M165 FC</td>
			<td >For microinjection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minimum fiber filter paper&#160;</td>
			<td >Fisher Brand</td>
			<td >No. 05-714-4</td>
			<td >Chromatography Paper, Thick&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquitoes&#160;</td>
			<td >MR4, BEI Resources</td>
			<td ></td>
			<td >Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaHPO4 buffer&#160;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >1 mM, ph 6.8</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nylon mesh</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paint brush</td>
			<td >Blick</td>
			<td >No. 05831-7040</td>
			<td >Fine, size 4/0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Plastic, (60x15 mm, 90x15 mm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium acetate</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >&#160;3M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quartz glass capillaries&#160;</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >No. QF100-70-10</td>
			<td >With filament, 1 mm OD,&#160; ID 0.7 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water PCR grade&#160;</td>
			<td >Roche</td>
			<td >No. 03315843001</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection method for anopheles gambiae embryos

Las técnicas de microinyección embrionaria son esenciales para muchos estudios moleculares y genéticos de especies de insectos. Proporcionan un medio para introducir fragmentos de ADN exógenos que codifican genes de interés, así como rasgos favorables en la línea germinal de insectos de una manera estable y heredable. Las cepas transgénicas resultantes pueden estudiarse para detectar cambios fenotípicos resultantes de la expresión del ADN integrado para responder a preguntas básicas o utilizarse en aplicaciones prácticas. Aunque la tecnología es sencilla, requiere del investigador paciencia y práctica para lograr un nivel de habilidad que maximice la eficiencia. Aquí se muestra un método para la microinyección de embriones del mosquito africano de la malaria, Anopheles gambiae. El objetivo es entregar por microinyección ADN exógeno al embrión para que pueda ser absorbido en las células germinales (polos) en desarrollo. La expresión del ADN inyectado de transposasas, integrasas, recombinasas u otras nucleasas (por ejemplo, proteínas asociadas a CRISPR, Cas) puede desencadenar eventos que conducen a su inserción covalente en los cromosomas. An. gambiae transgénico generado a partir de estas tecnologías se han utilizado para estudios básicos de componentes del sistema inmunológico, genes involucrados en la alimentación sanguínea y elementos del sistema olfativo. Además, estas técnicas se han utilizado para producir cepas de An. gambiae con rasgos que pueden ayudar a controlar la transmisión de parásitos de la malaria.

Un ejemplo representativo de la aplicación del protocolo de microinyección descrito se puede encontrar en Carballar-Lejarazú et al5. La intención aquí era insertar un sistema autónomo de impulsores genéticos en la línea germinal de una cepa de laboratorio, G3, de An. gambiae. El sistema fue diseñado para dirigirse al locus ortólogo cardinal (Agcd)en el tercer cromosoma de esta especie, que codifica una hemo peroxidasa que cataliza la conversión de 3-hidroxiqui...

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Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Este protocolo es significativo porque proporciona un método de microinyección específico para un Anopheles gambiae, que ha sido históricamente difícil de transformar utilizando técnicas comunes de ingeniería genética. La principal ventaja de esta técnica es que crea de forma fiable Anopheles gambiae transgénicos. Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia estrategias novedosas para la eliminación de la malaria al facilitar la creación de mosquitos adecuados para la supresión de la población o la modificación de las poblaciones de Anopheles gambiae de tipo silvestre.Esta metodología se puede adaptar fácilmente a diferentes especies de mosquitos. Nuestra tecnología de microinyección requiere paciencia y práctica. Hay una curva de aprendizaje.Para comenzar, use un aspirador para colocar de 20 a 30 hembras en un tubo cónico transparente de 50 mililitros. Asegúrese de que el tubo esté abierto en ambos extremos y esté cubierto con película dental de látex en un extremo y malla de nylon y papel de filtro en el otro, donde los mosquitos pondrán sus huevos. Coloque el tubo lleno de mosquitos en una pequeña placa de Petri llena de agua de doble destilación, luego coloque el tubo y el plato en una incubadora a 28 grados centígrados durante 45 minutos.Retire el tubo de la incubadora e inserte el tubo en una jaula vacía. Golpee suavemente el tubo para permitir que los mosquitos salgan volando. Retire el tubo de la jaula una vez que todos los mosquitos hayan volado.Cuando el tubo esté libre de mosquitos, desenrosque el anillo inferior, retire el nylon y use fórceps para quitar cuidadosamente el papel de filtro con los huevos del tubo. Coloque el papel de filtro cargado de huevos en una placa de Petri de plástico que contenga una capa de papel de filtro humedecida con agua. Coloque una membrana en un portaobjetos de vidrio limpio y use pinzas limpias para cubrir la membrana con un trozo de papel de filtro, dejando aproximadamente un milímetro del filtro de membrana descubierto.Humedezca el papel de filtro con agua desionizada, luego use el cepillo para transferir suavemente de 30 a 50 embriones al borde de la membrana y alinee los huevos verticalmente a lo largo de la membrana. Oriente los óvulos en la misma dirección para que cuando se observen los óvulos bajo el microscopio de microinyección, el extremo posterior esté en una posición hacia abajo y forme un ángulo de 15 grados con la aguja. Forrar todo el borde de la membrana con huevos.Use una punta de microcargador para llenar las agujas con dos microlitros de mezcla de ADN. Inserte la aguja en el soporte de la aguja y conecte el tubo de la bomba de presión automatizada. Alinee la aguja para que haga un ángulo de 15 grados con el plano de la diapositiva.Abra la punta de la aguja tocando cuidadosamente el primer huevo, luego inserte la punta de la aguja a unos 10 micrómetros en el polo posterior. Una inyección exitosa conducirá a un pequeño movimiento del citoplasma dentro del óvulo. Use los controles de la etapa coaxial del microscopio para pasar al siguiente óvulo para continuar la inyección.Para asegurarse de que la punta de la aguja permanezca abierta y no se haya obstruido, presione el botón Inyectar antes de ingresar a otro embrión y visualice la pequeña gota en la abertura de la aguja. Si la aguja se obstruye, presione el botón Borrar para limpiar la aguja y repita la prueba de visualización de gotas. Ajuste la presión según sea necesario si la abertura de la punta de la aguja se hace un poco más grande para asegurarse de que el tamaño de la gota permanezca pequeño.Inyecte alrededor de 40 a 50 huevos con una aguja. Después de que se completen las inyecciones, enjuague los huevos en un recipiente de vidrio forrado con papel de filtro y lleno con 50 mililitros de agua desionizada. Usando este protocolo, se insertó un sistema autónomo impulsado por genes en la línea germinal de una cepa de laboratorio G3 de Anopheles gambiae.El sistema fue diseñado para apuntar al ortólogo cardinal, o Agcd, en el tercer cromosoma de esta especie. Se muestra el plásmido pCO37. Contiene Streptococcus pyogenes Cas9 endonucleasa bajo control de los elementos reguladores del gen nanos ortholog.Además, tiene un ARN guía bajo el control de un promotor del gen U6 y el casete de marcador dominante 3XP3 CFP que expresa la proteína fluorescente cian. Los enfoques moleculares verificaron la inserción precisa de pares de bases de ADN de aproximadamente 10 kilos, que se designó como AgNosCd-1. Extensos análisis de seguimiento mostraron que AgNosCd-1 era altamente eficiente en el accionamiento, creaba pocos alelos resistentes y no tenía una carga genética importante debido a la integración y expresión del sistema de impulsor genético.Los mosquitos que contenían el impulso genético homocigoto eran mutantes de pérdida de función, con larvas, pupas y adultos recién surgidos que tenían un fenotipo de ojos rojos. Al intentar este protocolo, mantenerse a los 88 años es crucial para una buena eclosión de los huevos de color gris claro y evitar los huevos blancos.

Research

JoVE Journal

Genetics

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Asistida por láser citoplasmática microinyección en el ganado cigotos

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Investigación

Genética

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

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Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

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Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

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