Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

ويقر المؤلفان بامتنان بتمويل صندوق مارسدن النيوزيلندي (المنحة UOO1305)، ومنحة من كلية الطب، جامعة شولالونغكورن، بانكوك، تايلاند (م. نيمي). وهم يودون أن يشكروا جامعة أوتاجو على منح ج. مدني منحة دراسية لنيل درجة الدكتوراه. كما يود المؤلفان التعبير عن امتنانهما للبروفيسور ستيفان راونسر وزميليه الدكتور أمير أبلباوم والدكتور ديفاناياغاباراثي فيناياغام على دعمهم وإشرافهم خلال زيارة قام بها ج. مدني لمدة 6 أشهر في معهد ماكس بلانك للفسيولوجيا الجزيئية (MPIMP)، دورتموند، ألمانيا. كما يشكر المؤلفون دائرة التبادل الأكاديمي الألمانية (DAAD) على تزويد ج. مدني بمنحة بحثية (57381332) لزيارة MPIMP.

1. إعداد المخزونات الطازجة أو المجمدة من التحول الخلايا ADΔ و ADΔΔ المختصة
<ol><li>تلقيح 25 مل من 2x YPCD [أي 2x YPD; 2٪ (ث / v) استخراج الخميرة، 2٪ (ث / v) بيبتون، 4٪ (ث / v) dextrose)، 0.079 ٪ (ث / الخامس) CSM (خليط الملحق الكامل)]35 المتوسطة مع مستعمرة خميرة واحدة واحتضان بين عشية وضحاها (س / ن) لمدة 16 ساعة في 30 د...

على الرغم من التقدم الأخير في التحليل الهيكلي للبروتينات الغشاء، لا يوجد هيكل 3D لCD1، أو أي ناقل PDR أخرى، متاح حاليا. لذا ، فإن اكتساب المعرفة بهيكل Cdr1 وميزاته الكيميائية الحيوية أمر مهم ، لأن هذا لن يوفر فقط نظرة ثاقبة على التصميم العقلاني للأدوية الجديدة للتغلب على مقاومة الأدوية بوساطة eff...

استخراج بروتينات الأغشية المتكاملة من بيئتها الدهنية الأصلية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على هيكلها ووظيفتها1،2،3،4. التركيب الدهني المعقد للأغشية البيولوجية5 يضمن أن التفاعلات الهامة للغاية بين البروتين والدهون يمكن أن تحدث6. تحافظ الدهون على السلامة الهيكلية لبروتينات الأغشية ، مما يمكنها من العمل بشكل صحيح في وجهة (ق) مقصورة الغشاء الخاصة بها7،8. لذلك ، فإن الخطوة الأولى الحاسمة في تنقية بروتين الغشاء هي استخراج البروتين من بيئته الأصلية دون التأثير على بنيته و / أو وظيفته.
هناك العديد من العقبات التي تحول دون توصيف بنية بروتينات الأغشية ، ومعظمها يتعلق بطبيعتها الكارهة للماء ، وصعوبات التعبير عن بروتينات الأغشية المطوية والوظيفية بشكل صحيح بالكميات المطلوبة لتصوير البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM)9و10و11و12. هناك ثلاثة أنواع من أنظمة التعبير البروتيني الغشائي:متجانسة 9، heterologous13،14،15، ونظم التعبير في المختبر 16،17. مستويات التعبير المنخفضة في كثير من الأحيان ، أو التكاليف الباهظة ، للعديد من أنظمة التعبير لا تترك سوى عدد قليل من المضيفين كخيار مفضل لإنتاج بروتينات الأغشية. وهي تشمل المضيف البكتيري ، الإشريكية القولونية، والخمائر S. cerevisiae وPichia pastoris، وeukaryotes أعلى مثل خلايا الحشرات Sf9 أو خطوط خلايا الثدييات18. جميع تقنيات التعبير عن البروتين الغشاء لها مزايا وعيوب. ومع ذلك، S. cerevisiae هو ربما أفضل دراسة كائن حي نموذج eukaryotic مناسبة لإنتاج البروتين الغشاء. هو متعدد الاستخدامات للغاية مع التطبيقات في الهندسة الوراثية، واكتشاف المخدرات، والبيولوجيا الاصطناعية، والتعبير عن بروتينات الغشاء eukaryotic14،19،20،21.
في هذه الدراسة، تم استخدام براءة اختراع S. cerevisiae غشاء البروتين التعبير التكنولوجيا21، مع S. cerevisiae ADΔ14 و ADΔΔ22 كمضيفين المفضل(الشكل 1A)،إلى الإفراط في التعبير ودراسة الرئيسية C. albicans مضخة efflux متعددة المخدرات Cdr1. كل من سلالات S. cerevisiae هي مشتقات AD1-8u- 23 التي تحتوي إما على ura3 (ADΔ) أو كل من جينات ura3 و his1 (ADΔΔ) المحذوفة للقضاء على أي uracil إيجابي زائف أو محولات الهستيدين الأولية الناشئة من خلال التكامل غير المرغوب فيه في URA3 أو loci الجينوم HIS1. حذف مضخات efflux 7 الرئيسية متعددة المخدرات23، المشار إليها في الشكل 1A، يجعل ADΔΔ حساسة بشكل رائع لمعظم xenobiotics. مكسب من وظيفة معامل النسخ المتحول Pdr1-3 يسبب التعبير الزائد التأسيسية من البروتينات غشاء heterologous مثل Cdr1 (المثمنات الحمراء في الشكل 1A)بعد دمج كاسيت التحول heterologous-ORF التي تحتوي على (الشكل 1A) في الموضع PDR5 الجينومي (المستطيل الأزرق في الشكل 1A) عن طريق اثنين من أحداث إعادة التركيب متجانسة. يمكن تأكيد توطين غشاء البلازما المناسب لبروتينات MGFPHis الموسومة C-terminally عن طريق المجهر الكونفوجال(الشكل 1A)، ويمكن استخدام العلامة الخاصة به لتنقية تقارب النيكل للبروتين الموسوم. غير أن استنساخ بعض ناقلات ABC الفطرية (مثل المبيضات krusei ABC1)إلى البلازميدات المشتقة من pABC3 لم يكن ممكنا لأنه لم يكن من الممكن نشرها في الإشريكية القولونية بسبب سمية الخلية. هذا دفع إلى تطوير استنساخ خطوة واحدة من البروتينات الغشائية14،24 الموسومة إما في N - أو C - terminus مع تقارب مختلف ، epitope ، أو مراسل العلامات مباشرة إلى S. cerevisiae ADΔΔ (الشكل 1C). س. سيريفيسياي ADΔΔ سلالات التعبير عن مختلف المسوخ CDR1 يمكن أيضا أن تنشأ بكفاءة بهذه الطريقة باستخدام ما يصل إلى خمسة شظايا PCR الفردية التي تتداخل من قبل 25 نقطة أساس (الشكل 1C). باستخدام هذا البروتوكول، يمكن استنساخ العديد من ORFs ذات الأهمية، والتعبير عنها، ووصفها بتكلفة منخفضة وكفاءة عالية في غضون فترة زمنية قصيرة جدا. كفاءة التحول يقلل فقط ~ 2 أضعاف مع كل جزء PCR إضافية.
إذا رغبت في ذلك، يمكن أيضا أن يتم التلاعب مستويات التعبير بسهولة من قبل تصميم التمهيدي لضبط مستويات التعبير المتوقع وصولا الى أي مكان بين 0.1٪-50٪ من مستويات التعبير عادة عالية، التأسيسية25. الأمثل، متعدد الوظائف، pABC314 ناقلات استنساخ مشتق، pABC3-XLmGFPHis26 (الشكل 1B) يحتوي على موقع شق بروتياز HRV-3C (X؛ ليفلفك| سباق الجائزة الكبرى), بروتياز أن أداء أفضل في 4 °C من فيروس التبغ حفر المستخدمة بشكل متكرر (TEV) بروتياز27. L هو خمسة الأحماض الأمينية (GSGGS) الرابط، mGFP هو متحولة أحادية (A206K)28،29 نسخة من الخميرة تعزيز البروتين الأخضر الفلوري البديل yEGFP330،وله هو ربط الأحماض الأمينية الثلاثة (GGS) تليها ستة الهستيدين (HHHHHH) النيكل تقارب البروتين الوسم.
وقد استخدمت هذه التكنولوجيا التعبير بنجاح في اكتشاف المخدرات ودراسة البروتينات الغشاء. تم حل الهيكل الأول لهدف عقار أزول الفطري ، S. cerevisiae Erg1131، باستخدام هذه التكنولوجيا. كما مكنت من التوصيف المفصل ل C. albicans Cdr132،33،34 وإنشاء جزيء Cdr1 ناقص السيستين35 مناسب للدراسات المترابطة السيستين للتحقق من أي بنية عالية الدقة في المستقبل. العديد من ناقلات ABC الأخرى من مسببات الأمراض الفطرية البشرية الرئيسية (أي، C. albicans، المبيضات glabrata، المبيضات أوريس، المبيضات krusei، المبيضات استخدام، Cryptococcus neoformans، أسبيرجيلوس fumigatus، البنسليوم marneffei، ومجمع الأنواع سوساريوم سولاني) كما درست بالتفصيل باستخدام هذا التعبير منصة24،36،37،38،39. وقد مكن هذا من توليد لوحة من سلالات S. cerevisiae overexpressing مضخات efflux التي تم استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية لاكتشاف رواية الفلورسنت efflux مضخة ركيزة النيل الأحمر40 ومحددة 41 وواسعة الطيف14,33,42,43,44 مثبطات مضخة efflux. استخدام هذا النظام مكن أيضا من اكتشاف clorgyline كأول من نوعه واسع الطيف الفطرية متعددة الأدوية efflux مضخة المانع42.
solubilization كاملة من البروتينات الغشاء وإنشاء غشاء متجانس البروتين- micelle إعداد خالية من الدهون الذاتية، ويتطلب تركيزات المنظفات عالية45. ولكن للأسف، وهذا أيضا في كثير من الأحيان تعطيل البروتين غشاء5،8،45،46. تتأثر خصائص مونومرات المنظفات وتجميعها في المحلول بالخصائص الفيزيائية للذيل الكاره للماء ، وطول وتفريع سلسلة الألكيل ، أو وجود نواة عطرية أو سلسلة جانبية من الفلوروالكيل ، أو عدد وحدات البوليوكسيثيلين. وبالتالي، فإن فحص المنظفات هو خطوة أولى مهمة لتحديد المنظفات الأكثر ملاءمة لتزيل بروتين الغشاء وتنقية.
C. albicans هو الممرض الفطري البشري الرئيسي للأفراد الذين يعانون من نقص المناعة التي يمكن أن تسبب خطيرة، وتهدد الحياة الالتهابات الغازية47،ويمكن أن تصبح مقاومة للأدوية المضادة للفطريات أزول48،49. واحدة من الآليات الرئيسية للمقاومة C. albicans multidrug هو التعبير المفرط عن Cdr150، وهو نوع II ATP ملزمة كاسيت (ABC) الناقل51 من عائلة ABCG الفرعية الموجودة في غشاء البلازما. كامل الحجم الناقلات ABCG الفطرية (التي تتكون من اثنين من نطاقات الربط النيوكليوتيدات [NBDs] واثنين من المجالات transmembrane [TMDs]) هي أكثر شيوعا المعروفة باسم مقاومة الأدوية الجنبية (PDR) الناقلين وتتميز طوبولوجيا المجال المقلوب فريدة من نوعها [NBD-TMD]2. توجد ناقلات PDR فقط في النباتات52و53 والفطريات54. على الرغم من أهميتها، لا توجد هياكل لنقل PDR، على الرغم من أن هياكل لنقل ABCG نصف الحجم البشري قد تم حلها مؤخرا مما ساعد على إنشاء النموذج الأولي الأول لCDR133. ومع ذلك، تشير أدلتنا التجريبية الأخيرة إلى أن هذا النموذج معيب ربما لأن ناقلات PDR الفطرية لديها NBDs غير متماثلة مميزة مما يؤدي إلى آلية نقل فريدة من نوعها. ولذلك، فإن هناك حاجة إلى هيكل عالي الدقة من Cdr1 لكل من التصميم العقلاني لمثبطات مضخة efflux الجديدة التي قد تساعد في التغلب على مقاومة الأدوية بوساطة efflux ، وتقديم رؤى حول آلية عمل هذه العائلة الناقلة ABC الهامة.
كان الهدف من هذه الدراسة هو وضع بروتوكولات موثوقة للتعبير ، والتشحيم ، وتنقية Cdr1 في مضيف التعبير S. cerevisiae المعدل وراثيا ، بهدف نهائي هو الحصول على بنية عالية الدقة ل Cdr1. كجزء من هذه العملية، تم تصميم علامة مزدوجة mGFPHis protease-cleavable(الشكل 1B)مع وصلة 16 بقايا فصل العلامة من C-terminus من Cdr1، والتي تحسنت ملزمة من 6x المرفقة له علامة تقارب لراتنج تقارب النيكل ومكن من رصد مستويات التعبير Cdr1 في الخلايا الحية وخلال عملية تنقية كامل. كما تم تطوير بروتوكول قابل للاستنساخ لمستحضرات بروتين غشاء بلازما الخميرة الصغيرة التي تحتوي على حوالي 10٪ C. albicans Cdr1 (كما يقدر تلطيخ Coomassie بعد SDS-PAGE) ، والذي يمكن استخدامه لتوصيف البيوكيميائية ل Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

يعتمد التوصيف الكيميائي الحيوي والبيوفيزيائي الناجح لناقلات ABC بشكل كبير على اختيار نظام التعبير heterologous. على مدى العقدين الماضيين، قمنا بتطوير منصة التعبير عن بروتين غشاء الخميرة التي تم استخدامها لدراسة العديد من البروتينات الغشاء الفطرية الهامة. يتم حذف التعبير المضيف Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ في سبع ناقلات ABC الذاتية الرئيسية ويحتوي على عامل النسخ Pdr1-3 مع طفرة في اكتساب الوظيفة التي تمكن من التعبير الزائد التأسيسي لجينات بروتين الغشاء heterologous متكاملة بشكل ثابت كنسخ واحدة في مكان PDR5 الجينومي. إن إنشاء ناقلات بلازميد متعددة الاستخدامات وتحسين استراتيجيات الاستنساخ من خطوة واحدة يمكن من الاستنساخ السريع والدقيق ، والتطين ، والتعبير عن ناقلات HETEROLOGOUS ABC. هنا، ونحن نصف تطوير واستخدام رواية protease-cleavable mGFPHis علامة مزدوجة (أي الخميرة أحادية الألوان تعزيز البروتين الفلوري الأخضر yEGFP3 تنصهر إلى علامة تنقية تقارب الستة الهستيدين) التي تم تصميمها لتجنب التدخل المحتمل للوسم مع البروتين من الفائدة وزيادة الكفاءة الملزمة للوسم له لراتنجات النيكل تقارب. إن دمج mGFPHis إلى بروتين الغشاء ORF (إطار القراءة المفتوح) يتيح سهولة تحديد كمية البروتين من خلال فحص المواد الهلامية البولي أكريلاميد والكشف عن منتجات التدهور التي تحتفظ بعلامة mGFPHis. نحن نظهر كيف تسهل هذه الميزة فحص المنظفات لتليين بروتين الغشاء. يتم تقديم بروتوكول لعزل فعالة وسريعة وموثوق بها من الاستعدادات غشاء البلازما على نطاق صغير من C-الميؤوس من شفائها المبيضات albicans متعددة المخدرات efflux الناقل Cdr1 مفرط التعبير في S. cerevisiae ADΔΔ. يولد بروتوكول عزل غشاء البلازما هذا على نطاق صغير أغشية بلازما عالية الجودة في غضون يوم عمل واحد. يمكن استخدام مستحضرات غشاء البلازما لتحديد أنشطة إنزيمات المتغيرات المتحولة Cdr1 و Cdr1.

تم تحقيق وتيرة عالية من التحول من S. cerevisiae ADΔΔ (~ 4 ×10 4 المحولات / ميكروغرام) مع pYES2 (الشكل 2B). كما هو متوقع، لم يعط التحكم في الحمض النووي (أي ddH2O فقط) أي محولات، وأعطى 1 ميكروغرام من CDR1الخطي - شريط كاسيت التحولmGFPHis (الشكل 1A) ~ 50 محولات<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

تقدم هذه المقالة بروتوكول عزل غشاء البلازما على نطاق صغير لتوصيف المبيضات albicans ABC (ATP ملزمة كاسيت) البروتين Cdr1، مفرط التعبير في Saccharomyces cerevisiae. تم تصميم علامة مزدوجة من طراز protease-cleavable C-terminal mGFPHis مع وصلة من 16 بقايا بين Cdr1 والعلامة لتسهيل تنقية وفحص المنظفات من Cdr1.

إعداد غشاء البلازما على نطاق صغير لتحليل المبيضات albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

على نطاق صغير بروتوكول عزل غشاء البلازما وmGFPHis علامة مزدوجة، وتوفير طريقة اقتصادية وسريعة وموثوق بها وسهلة لتوصيف البروتينات الغشاء في كائن نموذج eukaryotic، Saccharomyces cerevisiae. أكبر ميزة لهذه التكنولوجيا هي سهولة وسرعة التي يمكن تحديد مستويات التعبير عن البروتين الغشاء، وأنشطة ATP والمنظفات الأنسب لتنقيتها. هذه التكنولوجيا هي سهلة الاستعمال للغاية.ومع ذلك، نقطة واحدة هامة أن نتذكر هو حصاد الخلايا كما OD 600 من 2، مما يضمن انخفاض التلوث الميتوكوندريا وأعلى أنشطة ATPase ممكن. تبدأ قبل زراعة مستعمرة خميرة واحدة في 10 ملليلتر من المتوسط YPD في 30 درجة مئوية لمدة سبع إلى ثماني ساعات في 200 تناوب في الدقيقة الواحدة. استخدام 10 ملليلتر من ثقافة ما قبل تلقيح 40 ملليلتر من المتوسطة YPD الطازجة.ثم احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 200 دوران في الدقيقة الواحدة حتى تصل كثافة الخلية إلى OD 600 من واحد إلى ثلاثة. في اليوم التالي حصاد 40 وحدة الكثافة البصرية، أو ODU، من خلايا الوجه لوغاريتمي عن طريق الطرد المركزي في 4، 200 مرة G لكل خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إعادة تعليق وغسل الخلايا مع 40 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج الجليد الباردة العقيمة.كرر الغسيل باستخدام ملليلتر واحد من الماء البارد المثلج مع الطرد المركزي بين خطوات الغسيل. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الماء المثلج البارد العقيم ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 ملليلتر تبريد مسبق على الجليد. حصاد الخلايا في 3، 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية.أسبيرات supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من العازلة المتجانسة تستكمل حديثا مع واحد ملليمولار فينال ميثيل sulfa نيل فلوريد، أو PMSF. تخزين تعليق الخلية في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. إذابة الجليد الخلايا على الجليد لمدة ساعة تقريبا.ثم أضف الجليد الباردة 0.5 ملليمتر قطرها حبات السيليكا إلى 500 ميكرولتر من تعليق الخلية للوصول إلى حجم إجمالي قدره ملليلتر واحد. لكسر الخلايا، دوامة تعليق الخلية في أقصى كثافة اهتزاز لمدة دقيقة واحدة، لمدة ست دورات، مع فترة تبريد ثلاث دقائق على الجليد بعد كل دورة. بعد الدوامة، قم بعمل ثقب رفيع في الجزء السفلي من الأنبوب مع شفرة مشرط ساخنة وجمع الخلايا المكسورة المتجانسة في أنبوب طرد مركزي آخر بارد 1.5 ملليلتر صغير مع دوران منخفض السرعة لمدة 10 ثوان.الطرد المركزي تجانس الخلية التي تم جمعها في 5، 156 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. نقل 450 ميكرولتر من supernatant في الجليد الباردة 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة المتجانسة العازلة تكملها واحدة PMSF ملليمولار الطازجة. لحصاد أغشية البلازما الطرد المركزي تعليق الخلية في 17, 968 مرات G لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية.إزالة supernatant وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة التجانس تستكمل حديثا مع PMSF ملليمولار واحد. ثم تخفيف بيليه غشاء البلازما عن طريق تحريك مع تلميح ماصة 100 ميكرولتر وإعادة تعليق بيليه عن طريق تكرار pipetting صعودا وهبوطا. قياس تركيز البروتين لإعداد غشاء البلازما مع مجموعة من البروتين المقايسة التي تتوافق مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على عامل الحد والمنظفات.تخزين أغشية البلازما في ناقص 80 درجة مئوية، أو الاحتفاظ بها على الجليد للاستخدام الفوري. صب أربعة إلى خمسة ملليلتر من فصل هلام في جهاز هلام تجميعها تصل إلى سنتيمترين من الأعلى. طبقة بعناية 1-2 ملليلتر من 0.1٪ SDS على رأس والسماح للهلاميد بولي لتعيين لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد ساعة إزالة طبقة 0.1٪ SDS من هلام فصل البوليمر وشطف الجل مع الماء المقطر مزدوجة لإزالة آثار SDS. صب مزيج هلام التراص على هلام فصل. وضع مشط في هلام التراص وإزالة أي فقاعات الهواء من جميع أنحاء المشط.ثم السماح للهلام التراص لتعيين لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المشط ثم شطف فتحات هلام بالماء. وضع هلام في خزان هلام وملء خزان هلام إلى الأعلى مع تشغيل العازلة.مزيج خمسة إلى 10 ميكرولتر من عينات غشاء البلازما مع كميات متساوية من اثنين من صبغة تحميل البروتين وتحميل على الفور خليط العينة في فتحات هلام الفردية، غارقة في تشغيل العازلة. تحميل البروتين علامات الوزن الجزيئي في نطاق من 10 إلى 245 كيلودالتون في فتحة منفصلة لتمكين تقدير حجم شظايا البروتين الفردية. أداء الكهربائي هلام في 200 فولت حتى صبغة التحميل الأزرق يصل إلى الجزء السفلي من هلام.فحص الجل لفلورسينس GFP في هلام مع نظام التصوير هلام. بعد التصوير الفلوري إصلاح البروتينات في 10 إلى 20 ملليلتر من محلول تحديد هلام البروتين عن طريق التحريض لطيف من هلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف مرتين لمدة 10 دقائق مع 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج ووضع الجل في 10 ملليلتر من محلول وصمة عار كوماسي الغروية مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتصور عصابات البروتين.لتحسين التصور من عصابات البروتين، دي وصمة عار الجل مرة أو مرتين في 20 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة لمدة ساعة واحدة قبل تسجيل الصور مع نظام التصوير هلام. تم تحقيق وتيرة عالية من التحول من Saccharomyces cerevisiae دلتا دلتا D مع PS2 plasmid التحكم الإيجابي. لم يتم الحصول على محولات يوروسيل بروتروترون للسيطرة السلبية.تم الحصول على حوالي 50 URA الخلية prototroph CDR1-mGFPHis تحويل بعد احتضان خلايا دلتا دلتا AD تحولت على CSM ناقص لوحات URA لمدة ثلاثة أيام. تم القضاء على المحول الصغير الذي لا يمكن أن ينمو على لوحات أغار وحدات حماية الشعب. تم قياس عينات CDR1-mGHPHis بتركيزات متفاوتة كميا مع الفلورسينس داخل الجل.كانت كثافة الفلورسينس mGFP خطية على مدى نطاق التركيز بأكمله مع الحد الأدنى من مضان الخلفية. وأشار اختلاف كثافة الخلية إلى أن كسر 40 وحدة من الخلايا أسفر عن أعلى جودة من أغشية البلازما مع أعلى نشاط CDR1 ATPase. ومع ذلك ، فإن غلة أغشية البلازما زادت بما يتناسب مع زيادة كثافات الخلايا.تم اختبار قدرة 31 المنظفات مع خصائص مختلفة لslubilize CDR1-mGHPHis من أغشية البلازما الخام من دلتا دلتا AD، خلايا CDR1-mGHPHis مع صفحة SDS. بيتا وألفا DDM وفوس الكولين 13 كانت أفضل المنظفات لsolubilize CDR1-mGHPHis. ومع ذلك, فوس الكولين 13 يسبب التحلل المائي الجزئي من CDR1-mGHPHis.تم فصل بروتين غشاء البلازما الخام solubilized مع 1٪ المنظفات باستخدام superos ستة زيادة 10 300 GL حجم العمود الاستبعاد. وأظهرت الكروماتوجرامات من Maltosides وLMNG استخراج البروتينات معظم CDR1-mGHPHis التملص كذروة غاوسية على شكل جيد في 15.5 ملليمتر CDR1-mGHPHis solubilized مع الجلوكوز التي تحتوي على المنظفات ألمح كذروة مجمعة أو واسعة مجمعة. وأشارت القمم الأعلى ل DDM إلى أن جزءا كبيرا من DMN G solubilized CDR1-mGHPHis قد يتم تشويهه.في الكروماتوجرامات FSCC لzwitterionic فوس الكولين واثنين من المنظفات غير الأيونية فقط Digitonin وأعطى كروماتوغرام مماثلة لDDM. أعطى فوس الكولين 13 ذروة حادة على شكل متناظرة ، لكنه ألمح مع حجم elution أقل بكثير من ذلك لDDM. كما أن العلامة المزدوجة المحسنة تحسن غلة التنقية وساعدت في تحديد توطين بروتينات الأغشية والاتجار بها واستقرارها الحراري.يمكن أيضا استخدام تقنية التعبير heterologous في فحص الأدوية عالية الإنتاجية ، والتوصيف التفصيلي للعديد من بروتينات الأغشية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

بروتوكول إنتاج رواية لتصنيع على نطاق صغير من بروبيوتيك المخمرة للأغذية

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

توصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

إعداد نموذج للإعلام-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات تحليل ميكروفيسيلس العين

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

التنميط على نطاق الجينوم لتفاعلات ربط عامل النسخ والحمض النووي في المبيضات البيضاء: طريقة CUT &amp; RUN شاملة وسير عمل تحليل البيانات

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...