Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

作者感激地感谢新西兰马斯登基金（Grant UOO1305）的资助，以及来自泰国曼谷朱拉隆功大学医学院的整笔赠款（ M. Niimi）。他们要感谢奥塔哥大学向马达尼大学提供博士学位奖学金。作者还感谢斯特凡·劳恩瑟教授及其同事阿米尔·阿佩尔鲍姆博士和迪瓦纳亚加巴拉蒂·维纳亚加姆博士在德国多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所（MPIMP）对G·马达尼进行为期6个月的访问期间给予的支持和监督。作者还感谢德国学术交流局（DAAD）向G.马达尼提供了一项研究补助金（57381332），以访问MPIMP。

1. 准备新鲜或冷冻的转化库存，使AD+和AD+细胞具有能力
<ol><li>接种 25 mL 的 2 倍 Ypcd [即 2 倍 Ypd; 2% （w/v） 酵母提取物， 2% （w/v） 丙酮， 4% （w/v） 德克斯特罗斯）， 0.079% （w/v） CSM （完全补充混合物）]35 介质与单个酵母菌落和孵育过夜 （o/n） 16 小时在 30 °C 与摇晃在 200 转每分钟 （rpm）.。</li>
	<li>接种 225 mL 的 2x YPCD 介质与 25 mL o/n 培养，并检查细胞光学密度在 600 nm （OD...

尽管膜蛋白结构分析最近取得了进展，但目前尚无Cdr1或任何其他PDR运输机的3D结构。因此，了解Cdr1结构及其生化特征非常重要，因为这不仅能深入了解新药的合理设计，克服以流体为媒介的耐药性，而且能深入了解ABC蛋白重要亚系的功能机制。
膜蛋白结构特征的主要要求之一是正确折叠和完整膜蛋白的表达，其数量为X射线结晶或低温-EM所需。选择表达系统时的重要标准是易...

从原生脂质环境中提取整体膜蛋白会显著影响其结构和功能1、2、3、4。生物膜5的复杂脂质组成确保了至关重要的蛋白质-脂质相互作用可能发生6。脂质保持膜蛋白的结构完整性，从而使它们能够在膜室目标7，8正确运作。因此，膜蛋白纯化的关键第一步是从其原生环境中提取蛋白质，而不影响其结构和/或功能。
膜蛋白的结构存在许多障碍，其中大多数与膜蛋白的疏水性质有关，难以以X射线晶体学或低温电子显微镜（Cryo-EM）9、10、11、12所需的数量表达适当折叠和功能膜蛋白。膜蛋白表达系统有三种类型：同源性9、异质13、14、15和体外表达系统16、17。许多表达系统的表达水平往往很低，或成本过高，因此只有少数宿主成为生产膜蛋白的首选。它们包括细菌宿主，大肠杆菌，酵母S.塞雷维西亚和皮希亚面食，和更高的真核生物，如Sf9昆虫细胞或哺乳动物细胞系18。所有膜蛋白表达技术各有优缺点：然而，S.Cerevisiae也许是研究得最好的真核模型有机体，适合膜蛋白的生产。它具有高度多功能性，在基因工程、药物发现、合成生物学和真核膜蛋白14、19、20、21的表达方面具有很强的应用性。
在这项研究中，使用了一项获得专利的S.cerevisiae膜蛋白表达技术21，以S.Cerevisiae AD+14和AD+22为首选宿主（图1A），以过度表达和研究主要的C.藻类多药排泄泵Cdr1。S. cerevisiae菌株均为 AD1-8u-23的衍生物，具有ura3 （AD+） 或ura3及其1 （AD+） 基因，以消除任何通过URA3或HIS1基因组洛奇的不需要整合产生的假阳性尿素或组织丁原体转化剂。图1A中指出的7种主要多药排泄物泵23的删除，使得AD+对大多数异种生物非常敏感。功能增益突变转录因子Pdr1-3通过两个同源重组事件整合了基因组PDR5点的异质-ORF转化盒（图1A）后，导致Cdr1（图1A中的红色八角形）等异质膜蛋白的构成过度表达。C-终端mGFPHis标记蛋白的适当等离子膜定位可以通过共聚焦显微镜（图1A）确认，他的标签可用于标记蛋白质的镍亲和纯化。然而，将一些真菌ABC运输机（例如，坎迪达·克鲁塞ABC1）克隆成pABC3衍生质粒是不可能的，因为它们由于细胞毒性而无法在大肠杆菌中传播。这促使膜蛋白14、24的单步克隆的发展，这些蛋白在N-或C终点站被标记为具有各种亲和力、表位或记者标签，直接进入S.Cerevisiae AD+（图1C）。塞雷维西亚AD+菌株过度表达各种CDR1突变体也可以有效地创建这种方式，使用多达5个单独的PCR片段重叠25个基点（图1C）。利用此协议，许多感兴趣的ORF可以在很短的时间内以低成本和高效率进行克隆、表达和定性。每增加一个 PCR 片段，转化效率只会降低 ±2 倍。 
如果需要，表达水平也可以很容易地通过入门设计操纵，以可预测地将表达水平调低到通常高，构成表达水平25的0.1%-50%之间。优化的，多功能的， pABC314衍生克隆载体， pABC3 - XLmGFPHis26 （图 1B）包含一个 HRV - 3C 蛋白酶位点（ X ：列夫夫克|GP），一种蛋白酶，在4°C下表现优于常用的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶27。L是一种五氨基酸（GSGGS）链接器，mGFP是一种单体突变体（A206K）28、29版酵母增强绿荧光蛋白变异yEGFP33 30，而他的是一个三氨基酸连结剂（GGS），其次是六异丁（HHHHH）镍亲和蛋白纯化标签。
这种表达技术已成功地应用于药物发现和膜蛋白的研究。真菌偶佐尔药物靶点的第一个结构，S.塞雷维西亚Erg1131，是利用这项技术解决的。它还使C.藻类Cdr132，33，34的详细特征和创建一个赛斯坦缺乏Cdr1分子35适合赛尔坦交叉链接研究，以验证任何未来的高分辨率结构。许多其他ABC运输机从主要的人类真菌病原体（即， C. 阿尔比肯斯，坎迪达格拉布拉塔，坎迪达奥里斯，坎迪达克鲁塞，坎迪达使用，隐球菌新福尔曼斯，阿斯珀吉卢斯富米加图斯，青霉素马内菲，和富萨里姆索拉尼物种复合体）也已使用这个表达平台24，36，37，38，39详细研究。这使得在高通量屏幕上使用的S.cerevisiae菌株的面板能够过度表达的污水泵，从而发现新型荧光浮流泵基材尼罗河红色40和特异性41和广谱14、33、42、43、44 efflux泵抑制剂。该系统的使用也使发现木糖线作为同类广谱真菌多药排泄泵抑制剂42。
膜蛋白的完全溶化和创建无内源脂质的同质膜蛋白-鼠类制剂，需要高洗涤剂浓度45。但不幸的是，这也经常灭活膜蛋白5，8，45，46。洗涤剂单体的特性和溶液中的聚合受疏水尾部的物理特性、烷基链的长度和分支、芳香核或氟烷基侧链的存在或聚氧乙烯单元的数量的影响。因此，洗涤剂筛选是确定最适合膜蛋白溶解和纯化的洗涤剂的重要第一步。
C.藻类是人体免疫功能低下的主要真菌病原体，可引起严重、危及生命的侵入性感染47种，可对偶祖抗真菌药物产生抗药性48、49。C.藻类耐多药性的主要机制之一是Cdr150的过度表达，这是位于等离子膜中的ABCG亚家庭II型ATP绑定盒式（ABC）运输机51。全尺寸真菌 ABCG 运输机（由两个核苷酸结合域 [NBD] 和两个跨膜域 [TMD] 组成） 更通常被称为全热带耐药性 （PDR） 运输机，其特点是其独特的倒置域拓扑 [NBD-TMD]2.PDR运输机只在植物52，53和真菌54发现。尽管PDR运输机的重要性，没有结构，虽然结构为人类半尺寸ABG运输机最近已经解决，这有助于创造Cdr133的第一个试探性模型。然而，我们最近的实验证据表明，这种模型存在缺陷，可能是因为真菌PDR运输机具有特有的不对称性NBD，很可能形成一种独特的运输机制。因此，Cdr1 的高分辨率结构既需要合理设计有助于克服以埃夫卢斯为媒介的耐药性的新颖的 efflux 泵抑制剂，又需要深入了解这一重要的 ABC 运输机系列的行动机制。
本研究的目的是为转基因 的S.Cerevisiae 表达宿主的Cdr1表达、溶解和纯化制定可靠的协议，最终目的是为Cdr1获得高分辨率结构。作为此过程的一部分，一个蛋白酶可切割的 mGFPHis 双标签 （图 1B）设计与 16 残渣链接器分离标签从 Cdr1 的 C 总站， 这改善了附加的 6x 他的亲和力标签与镍亲和树脂的结合， 并使监测 Cdr1 表达水平在活细胞和整个净化过程中.还开发了含有约 10%C.藻类 Cdr1（根据SDS-PAGE之后库马西染色估计）的小规模酵母血浆膜蛋白制剂的可重复协议，可用于Cdr1的生化表征。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

ABC运输机的生化和生物物理特征的成功在很大程度上取决于异质表达系统的选择。在过去的二十年里，我们开发了一个酵母膜蛋白表达平台，用于研究许多重要的真菌膜蛋白。表达宿主 Saccharomyces cerevisiae AD+在七个主要的内源ABC转运器中被删除，它包含转录因子Pdr1-3与功能增益突变，使异质膜蛋白基因的构成过度表达稳定地整合为基因组 PDR5 位点的单拷贝。多功能质粒载体的创建和单步克隆策略的优化使异种ABC运输机能够快速准确地进行克隆、突变和表达。在这里，我们描述了一个新的蛋白酶可切割mGFPHis双标签（即单体酵母增强绿色荧光蛋白yEGFP3融合到六希丁亲和纯化标签）的发展和使用，旨在避免标签可能干扰感兴趣的蛋白质，并提高他的标签对镍亲和力树脂的结合效率。mGFPHis 与膜蛋白 ORF（开放读取框架）的融合，通过检测聚丙烯酰胺凝胶和检测保留 mGFPHis 标签的降解产品，可以轻松量化蛋白质。我们演示了此功能如何促进膜蛋白溶化的洗涤剂筛选。介绍了一个协议，高效，快速和可靠的隔离小规模等离子膜制剂的C终端标签 念珠菌 多药废水运输机Cdr1过度表达在 S.塞雷维西亚 AD+，提出了。这种小规模等离子膜隔离协议可在一个工作日内生成高质量的等离子膜。等离子膜制剂可用于确定Cdr1和Cdr1突变变异的酶活动。

使用 pYES2（图 2B）实现了S. cerevisiae AD+的高频率转换 （+4 x10 4变压剂/μg）。不出所料，无DNA（即仅限ddH2O）控制没有给出变压剂，线性CDR1-mGFPHis转换盒式磁带（图1A）的1微克给+50变压器（图2C）与优化的AD+转换协议。CDR1-mGFPHis变压剂还测试了它们在不可发酵碳源上生长的能力，以?...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

本文提出了一个小规模的等离子膜隔离协议，用于描述在糖浆中过度表达的念珠菌ABC（ATP结合盒式）蛋白质Cdr1。 蛋白酶可切割的 C 端 mGFPHis 双标签，Cdr1 和标签之间有 16 残留链接器，旨在促进 Cdr1 的净化和洗涤剂筛选。

用于分析 念珠菌 Cdr1-mGFPHis分析的小尺度等离子膜制备

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

小尺度等离子体膜分离协议和mGFPHis双标签，提供了一个经济，快速，可靠，简单的方法来描述膜蛋白在真核模型生物体，糖体切口。这项技术的最大优点是膜蛋白表达水平、ATP的活动和洗涤剂最适合其纯化的易用性和速度。这项技术非常方便用户使用。然而，需要记住的一个重要点是将细胞收获为OD 600的2，这确保了低线粒体污染和尽可能高的ATPase活动。首先，在30摄氏度的10毫升YPD介质中预先培育一个酵母菌群，每分钟200次旋转7至8小时。使用 10 毫升预培养物为 40 毫升新鲜 YPD 介质接种疫苗。然后以每分钟200次旋转的速度在30摄氏度的夜间孵育细胞，直到细胞密度达到1到3的OD 600。第二天，通过在摄氏4度下以每5分钟4200次G的离心离心方式，收获40个对数面细胞的光学密度单位（ODU）。用40毫升冰冷无菌双蒸馏水重新悬浮和清洗细胞。使用一毫升冰冷水重复清洗，在洗涤步骤之间离心。将颗粒重新悬挂在一毫升冰冷无菌水中，并将细胞悬浮液转移到冰上预冷的 1.5 毫升微型离心机管中。在摄氏4度下，在3，300倍G下采集细胞，3分钟。吸气超纳坦，并重新悬浮细胞颗粒在500微升同质化缓冲器新鲜补充一毫摩尔芬纳甲基硫化物，或PMSF。将电池悬架存放在零下 80 摄氏度，直到进一步使用。将冰上的细胞解冻约一小时。然后在细胞悬浮物的500微升中加入直径为0.5毫米的冰冷硅珠，达到1毫升的总体积。要打破细胞，将细胞以最大震动强度涡流悬浮一分钟，持续六个周期，每个周期后在冰上冷却三分钟。旋转后，用加热的手术刀刀片在管子底部打一个薄孔，将破碎的细胞同质化为另一个冰冷的1.5毫升微型离心机管，低速旋转10秒。将收集的细胞同质化为 5，156 倍 G，在 4 摄氏度下进行 5 分钟，以清除细胞碎片。将450微升超高离群值转移到冰冷1.5毫升微离心机管中，并加入1毫升冰冷同质化缓冲器，辅以1毫升新鲜PMSF。要收获等离子膜，在摄氏17，968次时将细胞悬浮离心，在4摄氏度下一小时。取出超高分子，加入100微升同质缓冲器，新鲜补充一毫摩尔PMSF。然后用 100 微升移液器尖端搅拌松开等离子膜颗粒，然后通过上下重复管道重新悬挂颗粒。用与含有还降剂和洗涤剂的缓冲剂相容的蛋白质检测试剂盒测量等离子膜制剂的蛋白质浓度。将等离子膜储存在零下80摄氏度，或将其保存在冰上立即使用。将四到五毫升分离的凝胶倒入组装的凝胶装置中，从顶部向下倒两厘米。小心地将 0.1% SDS 的 1 到 2 毫升层放在上面，让聚丙烯酰胺凝胶在室温下固定 60 分钟。一小时后，从聚合分离凝胶中取出 0.1% SDS 层，用双蒸馏水冲洗凝胶，以去除 SDS 的痕迹。将堆叠凝胶混合到分离凝胶上。将梳子放入堆叠凝胶中，并从梳子周围去除任何气泡。然后让堆叠凝胶在室温下固定 60 分钟。取下梳子，然后用水冲洗凝胶槽。将凝胶放入凝胶罐中，用运行缓冲器将凝胶罐填充到顶部。将等离子膜样品的5至10微升混合，其体积相当于蛋白质加载染料的2倍，并立即将样品混合物装入单独的凝胶槽中，浸入运行缓冲中。将蛋白质分子量标记在 10 到 245 Kilodalton 之间加载到单独的插槽中，以便对单个蛋白质片段进行大小估计。在 200 伏特下执行凝胶电泳，直到蓝色装载染料到达凝胶底部。使用凝胶成像系统检查凝胶内 GFP 荧光。荧光成像后，通过在室温下轻轻搅拌凝胶15分钟，将蛋白质固定在10至20毫升的蛋白质凝胶固定溶液中。然后用10毫升双蒸馏水冲洗两次10分钟，并将凝胶放入10毫升胶体Kumasi染色液中，在室温下轻轻摇晃1小时，使蛋白质带可视化。为了改善蛋白质带的可视化，在用凝胶成像系统记录图像之前，在20毫升双蒸馏水中去污一到两次凝胶一小时。通过正控质粒PS2实现了对甲三角洲的高频率转化。没有获得欧洲细胞原体变压剂的负控制。在CSM减去URA板上孵育转化的AD三角洲细胞三天后，获得了约50个URA细胞原体CDR1-mGFPHis变压剂。不能在 YPG 茄板上生长的娇小变压剂被淘汰。不同浓度的 CDR1-mGHPHis 样品通过凝胶内荧光进行量化。mGFP 荧光强度在整个浓度范围内是线性的，背景荧光最小。改变细胞密度表明，打破40 ODU的细胞产生最高质量的等离子体膜与最高的CDR1 ATPase活性。然而，等离子体膜的产量随着细胞密度的增加而增加。使用 SDS 页面测试了 31 种具有各种特性的洗涤剂从 AD Delta Delta 的粗等离子膜、CDR1-mGHPHis 细胞中溶化 CDR1-mGHPHis 的能力。贝塔和阿尔法 Ddm 和福斯胆碱 13 是最好的洗涤剂， 以溶化 Cdr1 - mghphis 。然而，福斯胆碱13导致CDR1-mGHPHis的部分水解。粗等离子膜蛋白溶化与1%洗涤剂分离使用suos六增加10 300GL大小排除列。马尔托赛德和LMNG提取蛋白质的色谱图显示，大多数CDR1-mGHPHis在15.5毫米CDR1-mGHPHis的优美形状的高斯峰中躲避，其含葡萄糖的洗涤剂被暗示为聚合或广泛聚集的峰值。DDM 的较高峰值表明，DMN G 溶化 CDR1-mGHPHis 的很大一部分可能已变性。在FSCC色谱中，只有Digitoin和两种非离子洗涤剂的色谱，并且给DDM一个类似的色谱。Fos-choline 13 给出了一个对称的锐利形状的峰值，但它暗示的逃生量明显低于 DDM。优化的双标签还提高了纯化率，并有助于确定膜蛋白的本地化、贩运和热稳定性。异质表达技术也可用于高通量药物筛选，以及许多其他膜蛋白的详细表征。

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

流式细胞仪定量测定GLUT4转位到质膜

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

科研

生物学

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

测绘在细胞膜分子扩散，多目标跟踪（MTT）

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

小规模的核提取物，基因表达机具功能分析

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

成像质膜变形随着pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

对于益生菌发酵食品的小规模生产新生产协议

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

样品制备质谱术分析

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis MLKL 介导的血浆膜破裂特征

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

基于性光谱的眼微血管蛋白质组学样品制备

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

白色念珠菌中转录因子-DNA结合相互作用的全基因组分析：全面的CUT&amp;RUN方法和数据分析工作流程

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

用于分析 念珠菌 Cdr1-mGFPHis分析的小尺度等离子膜制备

用于分析念珠菌 Cdr1-mGFPHis分析的小尺度等离子膜制备