Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Forfatterne anerkender taknemmeligt finansiering fra New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) og et bloktilskud fra Det Medicinske Fakultet, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). De vil gerne takke Otago Universitet for at give G. Madani et ph.d.-stipendium. Forfatterne ønsker også at udtrykke deres taknemmelighed over for professor Stefan Raunser og hans kolleger, Dr. Amir Apelbaum, og Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, for deres støtte og tilsyn under et 6-måneders besøg af G. Madani på Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Tyskland. Forfatterne takker også den tyske Academic Exchange Service (DAAD) for at give G. Madani et forskningstilskud (57381332) til at besøge MPIMP.

1. Udarbejdelse af friske eller frosne lagre af transformationskomne ADΔ- og ADΔΔ-celler
<ol><li>Pod 25 mL af 2x YPCD [dvs. 2x YPD; 2% (w/v) gærekstrakt, 2% (w/v) peptone, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (komplet supplementblanding)]35 medium med en enkelt gærkoloni og inkubere natten over (o/n) i 16 timer ved 30 °C med rysten ved 200 omdrejninger pr. minut (rpm).</li>
	<li>Pod 225 mL 2x YPCD medium med 25 mL o/n-kulturen, og kontroller den optiske celletæthed ved 600 nm (OD600...

På trods af de seneste fremskridt i den strukturelle analyse af membranproteiner er der i øjeblikket ingen 3D-struktur til Cdr1 eller nogen anden PDR-transportør. Så at få kendskab til Cdr1-strukturen og dens biokemiske funktioner er vigtigt, da dette ikke kun vil give indsigt i rationelt design af nye lægemidler til at overvinde efflux-medieret lægemiddelresistens, men også i funktionsmekanismen for en vigtig underfamilie af ABC-proteiner.
Et af de vigtigste krav til strukturel karakt...

Ekstraktionen af integrerede membranproteiner fra deres oprindelige lipidmiljø kan dramatisk påvirke deres struktur og funktion1,2,3,4. Den komplekse lipidsammensætning af biologiske membraner5 sikrer, at kritisk vigtige protein-lipidinteraktioner kan forekomme6. Lipider opretholder membraneproteinernes strukturelle integritet, hvilket gør det muligt for dem at fungere korrekt i deres membranrumsdestination(r) 7,8. Derfor er et kritisk første skridt i membranproteinrensningen udvindingen af proteinet fra dets oprindelige miljø uden at påvirke dets struktur og / eller funktion.
Der er mange hindringer for at karakterisere strukturen af membranproteiner, hvoraf de fleste er relateret til deres hydrofobiske natur, og vanskelighederne ved at udtrykke korrekt foldede og funktionelle membranproteiner i de mængder, der kræves til røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM)9,10,11,12. Der findes tre typer membranproteinudtrykssystemer: homologe9, heterologe13,14,15og in vitro-ekspressionssystemer 16,17. De ofte lave udtryksniveauer, eller de uoverkommelige omkostninger, af mange udtrykssystemer efterlader kun få værter som den foretrukne mulighed for at producere membranproteiner. De omfatter bakteriel vært, Escherichia coli, gær S. cerevisiae og Pichia pastoris, og højere eukaryoter såsom Sf9 insektceller eller pattedyr cellelinjer18. Alle membranproteinekspressionsteknologier har fordele og ulemper; men S. cerevisiae er måske den bedst studerede eukaryote model organisme egnet til membranproteinproduktion. Det er meget alsidigt med anvendelser inden for genteknologi, lægemiddelopdagelse, syntetisk biologi og ekspression af eukaryotemembranproteiner14,19,20,21.
I denne undersøgelse blev der anvendt en patenteret S. cerevisiae membranproteinudtryksteknologi21 med S. cerevisiae ADΔ14 og ADΔΔ22 som de foretrukne værter (Figur 1A) til at overekspressere og studere de store C. albicans multid effruglux pumpe Cdr1. Begge S. cerevisiae stammer er derivater af AD1-8u- 23, der har enten ura3 (ADΔ) eller både ura3 og his1 (ADΔΔ) gener slettet for at fjerne eventuelle falske positive uracil eller histidin prototroph transformanter som følge af uønsket integration på URA3 eller HIS1 genomisk loci. Sletningen af de 7 store multidrug efflux pumper23, angivet i figur 1A, gør ADΔΔ udsøgt følsomme over for de fleste xenobiotika. Gain-of-function mutant transskription faktor Pdr1-3 forårsager konstituerende overekspression af heterologe membran proteiner såsom Cdr1 (røde ottekanter i figur 1A) efter integration af heterolog-ORF-holdige transformation kassette (Figur 1A) på genomiske PDR5 græshoppe (blå rektangel i figur 1A) via to homologe rekombination begivenheder. Korrekt plasmamembran lokalisering af C-terminalt mGFPHis mærkede proteiner kan bekræftes af konfokal mikroskopi (Figur 1A), og hans tag kan bruges til nikkel-affinitet rensning af det mærkede protein. Kloning nogle svampe ABC transportører (f.eks Candida krusei ABC1) i pABC3-afledte plasmider var dog ikke muligt, fordi de ikke kunne formeres i Escherichia coli på grund af celletoksicitet. Dette førte til udviklingen af et-trins kloning af membranproteiner14,24 mærket på enten deres N- eller C-endestation med forskellige affinitet, epitope eller reporter tags direkte ind i S. cerevisiae ADΔΔ (Figur 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-stammer, der overekspresserer forskellige CDR1-mutanter, kan også skabes effektivt på denne måde ved at bruge op til fem individuelle PCR-fragmenter, der overlapper med 25 bp (Figur 1C). Ved at anvende denne protokol kan mange ORF'er af interesse klones, udtrykkes og karakteriseres til lave omkostninger og med høj effektivitet inden for meget kort tid. Transformationseffektiviteten reducerer kun ~ 2 gange med hvert ekstra PCR-fragment.
Hvis det ønskes, kan udtryksniveauer også let manipuleres af primerdesign til forudsigeligt at justere udtryksniveauer ned til et sted mellem 0,1%-50% af de normalt høje, konstituerende udtryksniveauer25. Den optimerede, multifunktionelle, pABC314 derivatkloningsvektor, pABC3-XLmGFPHis26 (Figur 1B) indeholder et HRV-3C protease kavalergangssted (X; LEVLFQ| GP), en protease, der klarer sig bedre ved 4 °C end den ofte anvendte tEV-protease (Tobacco ætsinfektionsvirus)27. L er en fem aminosyre (GSGGS) linker, mGFP er en monomerisk mutant (A206K)28,29 version af gær forbedret grøn fluorescens protein variant yEGFP330, og Hans er en tre aminosyre linker (GGS) efterfulgt af seks-histidin (HHHHHH) nikkel-affinitet protein tag.
Denne ekspressionsteknologi er med succes blevet brugt i lægemiddelopdagelse og studiet af membranproteiner. Den første struktur for en svampe azol stof mål, S. cerevisiae Erg1131, blev løst ved hjælp af denne teknologi. Det gjorde det også muligt detaljeret karakterisering af C. albicans Cdr132,33,34 og oprettelsen af en cysteine-mangelfuld Cdr1molekyle 35 egnet til cystein-crosslinking undersøgelser for at kontrollere enhver fremtidig høj opløsning struktur. Mange andre ABC-transportører fra store menneskelige svampepatogener (dvs. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei og Fusarium solani artskompleks) er også blevet undersøgt i detaljer ved hjælp af denne udtryksplatform24,36,37,38,39. Dette har gjort det muligt for generering af et panel af S. cerevisiae stammer overekspressere efflux pumper, der er blevet brugt i high-throughput skærme til at opdage den nye fluorescerende efflux pumpe substrat Nile rød40 og specifikke41 og bredspektret14,33,42,43,44 efflux pumpe hæmmere. Brugen af dette system også gjort det muligt at opdage clorgyline som den første af sin art bredspektret svampe multidrug efflux pumpe hæmmer42.
Fuldstændig opløselighed af membranproteiner og oprettelsen af et homogent membranproteinmikrollerpræparat uden endogene lipider kræver høje vaskemiddelkoncentrationer45. Men desværre inaktiverer dette også ofte membranproteinet5,8,45,46. Egenskaberne af vaskemiddelmonomerer og deres sammenlægning i opløsning påvirkes af den hydrofobiske hales fysiske egenskaber, længden og forgrening af alkylkæden, tilstedeværelsen af en aromatisk kerne eller fluorokylal sidekæde eller antallet af polyoxyethylenenheder. Derfor er vaskemiddelscreening et vigtigt første skridt til at bestemme det mest egnede vaskemiddel til membranproteinslubilisering og rensning.
C. albicans er et stort humant svampepatogen af immunkompromitterede individer, der kan forårsage alvorlige, livstruende invasive infektioner47, og det kan blive resistent over for azol svampedræbende lægemidler48,49. En af de vigtigste mekanismer i C. albicans multidrug modstand er overekspression af Cdr150, som er en type II ATP-bindende kassette (ABC) transporter51 af ABCG subfamily placeret i plasmamembranen. Fuld størrelse svampe ABCG transportører (bestående af to nukleotid bindende domæner [NBDs] og to transmembrane domæner [TMDs]) er mere almindeligt kendt som pleiotropisk lægemiddelresistens (PDR) transportører og er kendetegnet ved deres unikke omvendt domæne topologi [NBD-TMD]2. PDR transportører findes kun i planter52,53 og svampe54. På trods af deres betydning er der ingen strukturer for PDR-transportører, selv om strukturer til menneskelige halv størrelse ABCG transportører for nylig er blevet løst, som hjalp med at skabe den første foreløbige model for Cdr133. Vores seneste eksperimentelle beviser tyder imidlertid på, at denne model er fejlbehæftet muligvis fordi svampe PDR transportører har karakteristiske asymmetriske NBDs resulterer muligvis i en unik transportmekanisme. En høj opløsning struktur Cdr1 er derfor nødvendig for både rationelt design af nye efflux pumpe hæmmere, der kan hjælpe med at overvinde efflux-medieret lægemiddelresistens, og at give indsigt i virkningsmekanismen af denne vigtige ABC transporter familie.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle pålidelige protokoller for udtryk, opløselighed og rensning af Cdr1 i den genetisk modificerede S. cerevisiae udtryk vært, med det endelige formål at opnå en høj opløsning struktur for Cdr1. Som en del af denne proces, en protease-cleavable mGFPHis dobbelt tag (Figur 1B) blev designet med en 16-rest linker adskille tag fra C-endestation af Cdr1, som forbedret binding af vedlagte 6x Hans affinitet tag til nikkel-affinitet harpiks og muliggjorde overvågning af Cdr1 udtryksniveauer i levende celler og under hele rensningsprocessen. En reproducerbar protokol for små gærplasmamembranproteinpræparater, der indeholder ca. 10% C. albicans Cdr1 (som anslået af Coomassie farvning efter SDS-PAGE) blev også udviklet, som kunne bruges til biokemisk karakterisering af Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

Den vellykkede biokemiske og biofysiske karakterisering af ABC-transportører afhænger i høj grad af valget af det heterologe ekspressionssystem. I løbet af de sidste to årtier har vi udviklet en gærmembranproteinekspressionsplatform, der er blevet brugt til at studere mange vigtige svampemembranproteiner. Udtrykket vært Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ slettes i syv store endogene ABC transportører, og den indeholder transskription faktor Pdr1-3 med en gain-of-function mutation, der muliggør konstituerende overekspression af heterologe membran protein gener stabilt integreret som enkelt kopier på genomisk PDR5 græshoppe. Oprettelsen af alsidige plasmid vektorer og optimering af et-trins kloning strategier muliggør hurtig og præcis kloning, mutagenese, og udtryk for heterologe ABC transportører. Her beskriver vi udviklingen og brugen af en ny protease-cleavable mGFPHis dobbelt tag (dvs. monomerisk gær forbedret grøn fluorescerende protein yEGFP3 smeltet til en seks-histidin affinitet rensning tag), der var designet til at undgå mulig indblanding af tag med protein af interesse og til at øge den bindende effektivitet af hans tag til nikkel-affinitet harpikser. Sammensmeltningen af mGFPHis til membranproteinet ORF (åben læseramme) muliggør nem kvantificering af proteinet ved inspektion af polyacrylamidgeler og påvisning af nedbrydningsprodukter, der bevarer mGFPHis-mærket. Vi demonstrerer, hvordan denne funktion letter rengøringsscreening for membranproteinslubilisering. En protokol for effektiv, hurtig og pålidelig isolering af de små plasmamembranpræparater af de C-terminalt mærkede Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overekspresseret i S. cerevisiae ADΔΔ, præsenteres. Denne lille plasmamembranisolation protokol genererer høj kvalitet plasmamembraner inden for en enkelt arbejdsdag. Plasmamembranpræparaterne kan bruges til at bestemme enzymeaktiviteterne i Cdr1- og Cdr1 mutantvarianter.

En høj frekvens af transformation af S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanter/μg) blev opnået med pYES2 (Figur 2B). Som forventet gav no DNA (dvs. kun ddH2O) kontrol ingen transformanter, og 1 μg af den lineære CDR1-mGFPHis transformationskassette (Figur 1A) gav ~ 50 transformanter (Figur 2C) med den optimerede ADΔΔ transformationsprotokol. CDR1-mGFPHis t...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Denne artikel præsenterer en lille plasmamembran isolation protokol for karakterisering af Candida albicans ABC (ATP-bindende kassette) protein Cdr1, overekspresseret i Saccharomyces cerevisiae. En protease-cleavable C-terminal mGFPHis dobbelt tag med en 16-rest linker mellem Cdr1 og mærket var designet til at lette rensning og vaskemiddel-screening af Cdr1.

Lille plasmamembranpræparat til analyse af Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Den lille plasmamembran isolation protokol og mGFPHis dobbelt tag, giver en økonomisk, hurtig, pålidelig og nem metode til at karakterisere membran proteiner i eukaryote model organisme, Saccharomyces cerevisiae. Den største fordel ved denne teknologi er den lethed og hastighed, hvormed membranproteinudtryk niveauer, ATP's aktiviteter og vaskemiddel er bedst egnet til deres rensning kan bestemmes. Denne teknologi er meget brugervenlig.Men et vigtigt punkt at huske er at høste celler som OD 600 af 2, hvilket sikrer lav mitokondrie forurening og den højest mulige ATPase aktiviteter. Begynd med at dyrke en enkelt gærkoloni i 10 milliliter YPD-medium ved 30 grader Celsius i syv til otte timer ved 200 rotationer i minuttet. Brug 10 milliliter før kultur til at vaccinere 40 milliliter frisk YPD medium.Derefter inkuberes cellerne ved 30 grader Celsius natten over ved 200 rotationer i minuttet, indtil celletætheden når en OD 600 på en til tre. På den næste dag høste 40 optiske tæthed enheder, eller ODU, af logaritmisk ansigtsceller ved centrifugering på 4,200 gange G pr fem minutter ved fire grader Celsius. Re-suspendere og vaske celler med 40 milliliter iskold sterilt dobbelt destilleret vand.Gentag vask med en milliliter iskoldt vand med centrifugalisering mellem vasketrin. Ophæng pelleten igen i en milliliter iskoldt sterilt vand, og celleaffjedringen overføres til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, der er afkølet på is. Høst celler ved 3,300 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius.Aspirere supernatant og re-suspendere celle pellet i 500 mikroliter af homogenisering buffer frisk suppleret med en millimolar fenal methylsulfid Neal fluorid, eller PMSF. Opbevar celleaffjedringen ved minus 80 grader Celsius indtil videre brug. Optø cellerne på is i ca. en time.Derefter tilføje iskold 0,5 millimeter diameter silica perler til de 500 mikroliter af celle suspension for at nå et samlet volumen på en milliliter. For at bryde cellerne, vortex celle suspension ved maksimal ryste intensitet i et minut, i seks cyklusser, med en tre minutters afkøling periode på is efter hver cyklus. Efter vortexing, lav et tyndt hul i bunden af røret med en opvarmet skalpelblad og samle den brudte celle homogenat i en anden iskold 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør med en lav hastighed spin i 10 sekunder.Centrifugere den indsamlede celle homogenere på 5, 156 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius for at fjerne cellerester. Overfør 450 mikroliter supernatant til et iskoldt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og tilsæt en milliliter iskold homogeniseringsbuffer suppleret med en millimolar frisk PMSF. For at høste plasmamembraner centrifugere celle suspension på 17, 968 gange G i en time ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten og tilsæt 100 mikroliter homogeniseringsbuffer frisk suppleret med en millimolar PMSF. Løsn derefter plasmamembranpillen ved omrøring med 100 mikroliter pipettespidsen og ophæng pelleten igen ved at gentage pipetter op og ned. Mål proteinkoncentrationen af plasmamembranpræparatet med et proteinanalysesæt, der er kompatibelt med buffere, der indeholder reduktionsmidlet og vaskemidlet.Opbevar plasmamembranerne ved minus 80 grader Celsius, eller opbevar dem på is til øjeblikkelig brug. Hæld fire til fem milliliter adskillelse af gel i det samlede gelapparat op til to centimeter fra toppen. Lag forsigtigt en til to milliliter på 0,1% SDS på toppen og lad poly acrylamidgelen indstilles til 60 minutter ved stuetemperatur.Efter en time skal du fjerne 0,1% SDS-laget fra den polymeriserede adskillelsesgel og skyl gelen med dobbeltdestilleret vand for at fjerne spor af SDS. Hæld stabling gel mix på adskillelse gel. Placer en kam i stabling gel og fjerne eventuelle luftbobler fra omkring kammen.Lad derefter stablingsgelen indstilles til 60 minutter ved stuetemperatur. Fjern kammen og skyl derefter gelåbningerne med vand. Sæt gelen i geltanken og fyld geltanken til toppen med løbebuffer.Bland fem til 10 mikroliter plasmamembranprøver med lige store mængder af to gange proteinbelastningsfarvestof, og læg straks prøveblandingen i individuelle gelåbninger, nedsænket i løbebuffer. Læg protein molekylvægt markører i området fra 10 til 245 Kilodalton i en separat slot for at muliggøre størrelsen estimering af individuelle proteinfragmenter. Udfør gel elektroforese ved 200 volt, indtil den blå belastning farvestof når bunden af gelen.Undersøg gelen for in-gel GFP fluorescens med en gel imaging system. Efter fluorescerende billeddannelse fix proteiner i 10 til 20 milliliter protein gel fastsættelse opløsning ved blid omrøring af gelen i 15 minutter ved stuetemperatur. Skyl derefter de to gange i 10 minutter med 10 milliliter dobbeltdestilleret vand og læg gelen i 10 milliliter kolloid Kumasi pletopløsning med blid rysten i en time ved stuetemperatur for at visualisere proteinbånd.For forbedret visualisering af proteinbånd, de-plette gelen en eller to gange i 20 milliliter dobbelt destilleret vand i en time, før du optager billeder med gel imaging system. En høj frekvens af transformation af Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta blev opnået med den positive kontrol plasmid PS2. Der blev ikke opnået Eurocell Prototron-transformanter til den negative kontrol.Omkring 50 URA celle prototroph CDR1-mGFPHis transformant blev opnået efter inkubation forvandlet AD Delta Delta celler på CSM minus URA plader i tre dage. Petite transformant, der ikke kan vokse på YPG agar plader blev elimineret. CDR1-mGHPHis prøver med varierende koncentrationer blev kvantificeret med in-gel fluorescens.mGFP fluorescensintensiteterne var lineære over hele koncentrationsområdet med minimal baggrundslyscens. Varierende celletæthed indikerede, at brud på 40 ODU af celler gav den højeste kvalitet af plasmamembraner med den højeste CDR1 ATPase-aktivitet. Plasmamembranernes udbytte steg imidlertid i forhold til stigende celletætheder.Evnen af 31 rengøringsmidler med forskellige egenskaber til at opløse CDR1-mGHPHis fra rå plasma membraner af AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis celler blev testet med SDS side. Beta og alpha DDM Og Fos-cholin 13 var de bedste rengøringsmidler til at opløse CDR1-mGHPHis. Men, Fos-cholin 13 forårsage delvis hydrolyse af CDR1-mGHPHis.Rå plasmamembran protein opløses med 1% vaskemiddel blev adskilt ved hjælp af en superos seks øget 10 300 GL størrelse udelukkelse kolonne. Kromattogrammer af maltosider og LMNG udvundet proteiner viste de fleste CDR1-mGHPHis undvige som en pænt formet Gaussian peak på 15,5 millimeter CDR1-mGHPHis solubiliseret med glukose indeholdende rengøringsmidler hentydet som en aggregeret eller bred aggregeret top. De højere toppe for DDM indikerede, at en stor del af DMN G solubiliseret CDR1-mGHPHis kan denatureres.I FSCC chromatograms for zwitterionic Fos-cholines og to ikke-ioniske rengøringsmidler kun Digitonin og gav en lignende kromatogram til DDM. Fos-cholin 13 gav en symmetrisk skarp formet top, men det hentydede med en betydeligt lavere elution volumen end for DDM. Det optimerede dobbeltmærke forbedrer også rensningsudbyttet og hjalp med at bestemme lokalisering, handel og termisk stabilitet af membranproteiner.Den heterologe ekspressionsteknologi kan også bruges i lægemiddelscreening med høj gennemløb og detaljeret karakterisering af mange andre membranproteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kortlægning af molekylær diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Mindre Kerneekstrakter for Funktionelle analyser af gen-ekspression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging plasmamembranen Deformations Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Novel Production Protokol for håndværksmæssig fremstilling af probiotiske gærede fødevarer

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvefremstilling til Mass cytometrianalyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bestemmelse af Plasma membran partitionering for perifert forbundet proteiner

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Karakterisering af MLKL-medieret plasmamembran brud i Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Prøveforberedelse til masse-massespektrometri-baseret Proteomics analyser af okulær Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Genom-dækkende profilering af transkriptionsfaktor-DNA-bindende interaktioner i Candida albicans: En omfattende CUT &amp;RUN-metode og dataanalysearbejdsgang

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...