Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

De auteurs erkennen dankbaar de financiering van het Nieuw-Zeelandse Marsden Fund (Grant UOO1305) en een blokbeurs van de Faculteit geneeskunde, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Ze willen de Universiteit van Otago bedanken voor het verstrekken van een PhD Scholarship aan G. Madani. De auteurs willen ook hun dank uitspreken aan professor Stefan Raunser en zijn collega's, dr. Amir Apelbaum en dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, voor hun steun en supervisie tijdens een bezoek van 6 maanden aan G. Madani aan het Max Planck Instituut voor Moleculaire Fysiologie (MPIMP), Dortmund, Duitsland. De auteurs bedanken ook de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD) voor het verstrekken van een onderzoeksbeurs (57381332) aan G. Madani om de MPIMP te bezoeken.

1. Bereiding van verse of bevroren voorraden van voor verwerking bevoegde ADΔ- en ADΔΔ-cellen
<ol><li>Ent 25 ml 2x YPCD [d.w.z. 2x YPD; 2% (w/v) gistextract, 2% (w/v) pepton, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (volledig supplementmengsel)]35 medium met een enkele gistkolonie en incubateer een nacht (o/n) gedurende 16 uur bij 30 °C met schudden met 200 omwentelingen per minuut (rpm).</li>
	<li>Ent 225 ml 2x YPCD-medium met de 25 ml o/n-cultuur en controleer de optische celdichtheid bij 600...

Ondanks recente vooruitgang in de structurele analyse van membraaneiwitten, is er momenteel geen 3D-structuur voor Cdr1 of een andere PDR-transporter beschikbaar. Het verkrijgen van kennis van de Cdr1-structuur en de biochemische kenmerken ervan is dus belangrijk, omdat dit niet alleen inzicht zal geven in het rationele ontwerp van nieuwe geneesmiddelen om efflux-gemedieerde medicijnresistentie te overwinnen, maar ook in het mechanisme van functie van een belangrijke subfamilie van ABC-eiwitten.
<p class="jove_conten...

De extractie van integrale membraaneiwitten uit hun oorspronkelijke lipideomgeving kan hun structuur en functie dramatisch beïnvloeden1,2,3,4. De complexe lipidesamenstelling van biologische membranen5 zorgt ervoor dat kritisch belangrijke eiwit-lipide interacties kunnen optreden6. Lipiden behouden de structurele integriteit van membraaneiwitten, waardoor ze correct kunnen functioneren in hun membraancompartimentbestemming(en)7,8. Daarom is een cruciale eerste stap in de membraaneiwitzuivering de extractie van het eiwit uit zijn oorspronkelijke omgeving zonder de structuur en / of functie ervan te beïnvloeden.
Er zijn veel obstakels voor het karakteriseren van de structuur van membraaneiwitten, waarvan de meeste verband houden met hun hydrofobe aard, en de moeilijkheden bij het tot expressie brengen van goed gevouwen en functionele membraaneiwitten in de hoeveelheden die nodig zijn voor röntgenkristallografie of cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM)9,10,11,12. Er zijn drie soorten membraaneiwitexpressiesystemen: homoloog9,heterologe13,14,15en in vitro expressiesystemen16,17. De vaak lage expressieniveaus, of de onbetaalbare kosten, van veel expressiesystemen laten slechts een paar gastheren over als de voorkeursoptie om membraaneiwitten te produceren. Ze omvatten de bacteriële gastheer, Escherichia coli,de gisten S. cerevisiae en Pichia pastoris,en hogere eukaryoten zoals Sf9-insectencellen of zoogdiercellijnen18. Alle membraaneiwitexpressietechnologieën hebben voor- en nadelen; S. cerevisiae is echter misschien wel het best bestudeerde eukaryote modelorganisme dat geschikt is voor de productie van membraaneiwitten. Het is zeer veelzijdig met toepassingen in genetische manipulatie, geneesmiddelenontdekking, synthetische biologie en de expressie van eukaryote membraaneiwitten14,19,20,21.
In deze studie werd een gepatenteerde S. cerevisiae membraaneiwitexpressietechnologie21 gebruikt, met S. cerevisiae ADΔ14 en ADΔΔ22 als de voorkeursgastheren (Figuur 1A), om de belangrijkste C. albicans multidrug effluxpomp Cdr1 te overexpresseren en te bestuderen. Beide S. cerevisiae stammen zijn afgeleiden van AD1-8u- 23 die ofwel de ura3 (ADΔ) of zowel de ura3 als de his1 (ADΔΔ) genen verwijderd hebben om vals positieve uracil of histidine prototrofe transformaties te elimineren die ontstaan door de ongewenste integratie bij de URA3 of de HIS1 genomische loci. Het schrappen van de 7 belangrijkste multidrug effluxpompen23, aangegeven in figuur 1A, maakt ADΔΔ buitengewoon gevoelig voor de meeste xenobiotica. De gain-of-function mutante transcriptiefactor Pdr1-3 veroorzaakt de constitutieve overexpressie van heterologe membraaneiwitten zoals Cdr1 (rode achthoeken in figuur 1A) na integratie van de heterologe-ORF-bevattende transformatiecassette (figuur 1A) op de genomische PDR5-locus (blauwe rechthoek in figuur 1A) via twee homologe recombinatiegebeurtenissen. Een goede plasmamembraanlokalisatie van C-terminaal mGFPHis-gelabelde eiwitten kan worden bevestigd door confocale microscopie (Figuur 1A), en de His-tag kan worden gebruikt voor nikkel-affiniteitszuivering van het gelabelde eiwit. Het klonen van sommige schimmel ABC-transporters (bijv. Candida krusei ABC1) in pABC3-afgeleide plasmiden was echter niet mogelijk omdat ze niet konden worden vermeerderd in Escherichia coli vanwege celtoxiciteit. Dit leidde tot de ontwikkeling van het klonen in één stap van membraaneiwitten14,24 gelabeld op hun N- of C-eindpunt met verschillende affiniteits-, epitoop- of reportertags rechtstreeks in S. cerevisiae ADΔΔ (Figuur 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-stammen die verschillende CDR1-mutanten overexpresseren, kunnen op deze manier ook efficiënt worden gemaakt door maximaal vijf individuele PCR-fragmenten te gebruiken die elkaar 25 bp overlappen(figuur 1C). Met behulp van dit protocol kunnen veel ORF's van belang worden gekloond, uitgedrukt en gekarakteriseerd tegen lage kosten en met een hoog rendement binnen een zeer korte tijdspanne. De transformatie-efficiëntie vermindert slechts ~ 2-voudig met elk extra PCR-fragment.
Indien gewenst kunnen expressieniveaus ook gemakkelijk worden gemanipuleerd door primerontwerp om expressieniveaus voorspelbaar af te stemmen op ergens tussen 0,1% -50% van de meestal hoge, constitutieve expressieniveaus25. De geoptimaliseerde, multifunctionele, pABC314 afgeleide kloonvector, pABC3-XLmGFPHis26 (Figuur 1B) bevat een HRV-3C protease splitsingsplaats (X; LEVLFQ| GP), een protease die bij 4 °C beter presteert dan het veelgebruikte tabaksetsvirus (TEV) protease27. L is een vijf aminozuur (GSGGS) linker, mGFP is een monomere mutant (A206K)28,29 versie van de gist verbeterde groene fluorescentie eiwit variant yEGFP330, en His is een drie aminozuur linker (GGS) gevolgd door de zes-histidine (HHHHHH) nikkel-affiniteit eiwit zuivering tag.
Deze expressietechnologie is met succes gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen en de studie van membraaneiwitten. De eerste structuur voor een schimmelazol medicijn doelwit, S. cerevisiae Erg1131, werd opgelost met behulp van deze technologie. Het maakte ook de gedetailleerde karakterisering van C. albicans Cdr132,33,34 mogelijk en de creatie van een cysteïne-deficiënt Cdr1-molecuul35 geschikt voor cysteïne-crosslinking studies om toekomstige hoge resolutie structuur te verifiëren. Veel andere ABC-transporters van belangrijke menselijke schimmelpathogenen (d.w.z. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei en het Fusarium solani-soortencomplex) zijn ook in detail bestudeerd met behulp van dit expressieplatform24,36,37,38,39. Dit heeft de generatie mogelijk gemaakt van een paneel van S. cerevisiae-stammen die effluxpompen overexpressie geven en die zijn gebruikt in schermen met hoge doorvoer om het nieuwe fluorescerende effluxpompsubstraat Nile red40 en specifieke41 en breedspectrum14,33,42,43, 44 effluxpompremmers te ontdekken. Het gebruik van dit systeem maakte ook de ontdekking van clorgyline mogelijk als de eerste in zijn soort breedspectrum schimmel multidrug efflux pompremmer42.
Volledige oplosbaarheid van membraaneiwitten en de creatie van een homogeen membraaneiwit-micelpreparaat zonder endogene lipiden, vereist hoge detergentconcentraties45. Maar helaas inactiveert dit ook vaak het membraaneiwit5,8,45,46. De eigenschappen van detergentmonomeren en hun aggregatie in oplossing worden beïnvloed door de fysische eigenschappen van de hydrofobe staart, de lengte en vertakking van de alkylketen, de aanwezigheid van een aromatische kern of fluoroalkylzijketen of het aantal polyoxyethyleeneenheden. Detergentscreening is dus een belangrijke eerste stap om het meest geschikte reinigingsmiddel voor oplosbaarheid en zuivering van membraaneiwitten te bepalen.
C. albicans is een belangrijke menselijke schimmelpathogeen van immuungecompromitteerde personen die ernstige, levensbedreigende invasieve infecties kunnen veroorzaken47, en het kan resistent worden tegen azool antischimmelmiddelen48,49. Een van de belangrijkste mechanismen van C. albicans multidrugresistentie is de overexpressie van Cdr150, een type II ATP-bindende cassette (ABC) transporter51 van de ABCG-subfamilie in het plasmamembraan. Full-size schimmel ABCG-transporters (bestaande uit twee nucleotidebindingsdomeinen [NBD's] en twee transmembraandomeinen [TMD's]) zijn beter bekend als pleiotrope geneesmiddelresistentie (PDR) transporters en worden gekenmerkt door hun unieke omgekeerde domeintopologie [NBD-TMD]2. PDR-transporters komen alleen voor in planten52,53 en schimmels54. Ondanks hun belang zijn er geen structuren voor PDR-transporters, hoewel structuren voor menselijke half-size ABCG-transporters onlangs zijn opgelost, wat heeft bijgedragen aan het creëren van het eerste voorlopige model voor Cdr133. Ons recente experimentele bewijs suggereert echter dat dit model mogelijk gebrekkig is omdat schimmel PDR-transporters karakteristieke asymmetrische NBD's hebben, wat mogelijk resulteert in een uniek transportmechanisme. Een hoge-resolutie structuur van Cdr1 is daarom nodig voor zowel het rationele ontwerp van nieuwe effluxpompremmers die kunnen helpen bij het overwinnen van efflux-gemedieerde medicijnresistentie, als om inzicht te geven in het werkingsmechanisme van deze belangrijke ABC-transporterfamilie.
Het doel van deze studie was om betrouwbare protocollen te ontwikkelen voor de expressie, oplosbaarheid en zuivering van Cdr1 in de genetisch gemodificeerde S. cerevisiae expressie gastheer, met als uiteindelijk doel het verkrijgen van een hoge resolutie structuur voor Cdr1. Als onderdeel van dit proces werd een protease-knipbare mGFPHis dubbele tag (Figuur 1B) ontworpen met een 16-residu linker die de tag scheidt van de C-terminus van Cdr1, die de binding van de bijgevoegde 6x His affiniteitstag aan de nikkel-affiniteitshars verbeterde en de monitoring van Cdr1-expressieniveaus in levende cellen en tijdens het hele zuiveringsproces mogelijk maakte. Er werd ook een reproduceerbaar protocol ontwikkeld voor kleinschalige gistplasmamembraaneiwitpreparaten met ongeveer 10% C. albicans Cdr1 (zoals geschat door Coomassie-kleuring na SDS-PAGE), dat kon worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

De succesvolle biochemische en biofysische karakterisering van ABC-transporters hangt sterk af van de keuze van het heterologe expressiesysteem. In de afgelopen twee decennia hebben we een gistmembraaneiwitexpressieplatform ontwikkeld dat is gebruikt om veel belangrijke schimmelmembraaneiwitten te bestuderen. De uitdrukking host Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wordt verwijderd in zeven belangrijke endogene ABC-transporters en bevat de transcriptiefactor Pdr1-3 met een gain-of-function mutatie die de constitutieve overexpressie van heterologe membraaneiwitgenen stabiel geïntegreerd als enkele kopieën op de genomische PDR5-locus mogelijk maakt. De creatie van veelzijdige plasmidevectoren en de optimalisatie van kloonstrategieën in één stap maakt het snel en nauwkeurig klonen, mutagenese en expressie van heterologe ABC-transporters mogelijk. Hier beschrijven we de ontwikkeling en het gebruik van een nieuwe protease-splijtbare mGFPHis dubbele tag (d.w.z. het monomere gistversterkte groene fluorescerende eiwit yEGFP3 gefuseerd tot een zes-histidine affiniteit zuiveringslabel) dat is ontworpen om mogelijke interferentie van de tag met het eiwit van belang te voorkomen en om de bindingsefficiëntie van de His-tag aan nikkel-affiniteitsharsen te verhogen. De fusie van mGFPHis met het membraaneiwit ORF (open leesframe) maakt eenvoudige kwantificering van het eiwit mogelijk door inspectie van polyacrylamidegels en detectie van afbraakproducten die het mGFPHis-label behouden. We laten zien hoe deze functie de screening van reinigingsmiddelen op oplosbaarheid van membraaneiwitten vergemakkelijkt. Een protocol voor de efficiënte, snelle en betrouwbare isolatie van de kleinschalige plasmamembraanpreparaten van de C-terminaal gelabelde Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressie in S. cerevisiae ADΔΔ, wordt gepresenteerd. Dit kleinschalige plasmamembraanisolatieprotocol genereert binnen één werkdag hoogwaardige plasmamembranen. De plasmamembraanpreparaten kunnen worden gebruikt om de enzymactiviteiten van Cdr1- en Cdr1-mutante varianten te bepalen.

Een hoge frequentie van transformatie van S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanten/μg) werd bereikt met pYES2(figuur 2B). Zoals verwacht gaf de controle zonder DNA (d.w.z. alleen ddH2O) geen transformanten en 1 μg van de lineaire CDR1-mGFPHis-transformatiecassette (figuur 1A)gaf ~ 50 transformanten(figuur 2C)met het geoptimaliseerde ADΔΔ-transformatieprotocol. De CDR1</em...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Het kleinschalige plasmamembraanisolatieprotocol en mGFPHis double tag bieden een economische, snelle, betrouwbare en eenvoudige methode om membraaneiwitten te karakteriseren in het eukaryote modelorganisme Saccharomyces cerevisiae. Het grootste voordeel van deze technologie is het gemak en de snelheid waarmee de expressieniveaus van membraaneiwitten, de activiteiten van de ATP en het reinigingsmiddel dat het meest geschikt is voor hun zuivering kunnen worden bepaald. Deze technologie is zeer gebruiksvriendelijk.Een belangrijk punt om te onthouden is echter om cellen te oogsten als OD 600 van 2, wat zorgt voor een lage mitochondriale besmetting en de hoogst mogelijke ATPase-activiteiten. Begin met het voorkweken van een enkele gistkolonie in 10 milliliter YPD-medium bij 30 graden Celsius gedurende zeven tot acht uur met 200 rotaties per minuut. Gebruik 10 milliliter voorcultuur om 40 milliliter vers YPD-medium te enten.Incubeer vervolgens de cellen 's nachts bij 30 graden Celsius met 200 rotaties per minuut totdat de celdichtheid een OD 600 van één tot drie bereikt. Oogst de volgende dag 40 optische dichtheidseenheden, of ODU, van logaritmische gezichtscellen door te centrifugeren op 4, 200 keer G per vijf minuten bij vier graden Celsius. Cellen opnieuw opschorten en wassen met 40 milliliter ijskoud steriel dubbel gedestilleerd water.Herhaal het wassen met één milliliter ijskoud water met centrifugaalisatie tussen de wasstappen. Suspensie de pellet opnieuw in een milliliter ijskoud steriel water en breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter die voorgekoeld is op ijs. Oogst cellen op 3,300 keer G gedurende drie minuten bij vier graden Celsius.Aspirateer het supernatant en suspensie de celkorrel opnieuw in 500 microliter homogenisatorbuffer vers aangevuld met één millimolar fenal methylsulfaar Neal fluoride, of PMSF. Bewaar de celsuspensie bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Ontdooi de cellen op ijs gedurende ongeveer een uur.Voeg vervolgens ijskoude silicaparels met een diameter van 0,5 millimeter toe aan de 500 microliter van de celsuspensie om een totaal volume van één milliliter te bereiken. Om de cellen te breken, vortex de celsuspensie op maximale schudintensiteit gedurende één minuut, gedurende zes cycli, met een afkoelingsperiode van drie minuten op ijs na elke cyclus. Maak na het vortexen een dun gaatje aan de onderkant van de buis met een verwarmd scalpelmes en verzamel het gebroken celhomogenaat in een andere ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met een draaisnelheid op lage snelheid gedurende 10 seconden.Centrifugeer het verzamelde celhomogenaat op 5, 156 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen. Breng 450 microliter supernatant over in een ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg een milliliter ijskoude homogeniseerbuffer toe, aangevuld met één millimolaire verse PMSF. Om plasmamembranen te oogsten, centrifugeer je de celsuspensie op 17, 968 keer G gedurende een uur bij vier graden Celsius.Verwijder het supernatant en voeg 100 microliter homogenisator toe, vers aangevuld met één millimolaire PMSF. Maak vervolgens de plasmamembraankorrel los door te roeren met de pipetpunt van 100 microliter en suspensie de pellet opnieuw op en neer door het pipetteren te herhalen. Meet de eiwitconcentratie van het plasmamembraanpreparaat met een eiwittestkit die compatibel is met buffers die het reductiemiddel en het reinigingsmiddel bevatten.Bewaar de plasmamembranen bij min 80 graden Celsius, of bewaar ze op ijs voor onmiddellijk gebruik. Giet vier tot vijf milliliter scheidingsgel in het geassembleerde gelapparaat tot twee centimeter van de bovenkant. Leg er voorzichtig één tot twee milliliter 0,1% SDS op en laat de polyacryryamidegel 60 minuten op kamertemperatuur uitzetten.Verwijder na een uur de 0,1% SDS-laag van de gepolymeriseerde scheidingsgel en spoel de gel af met dubbel gedestilleerd water om sporen van SDS te verwijderen. Giet het stapelgelmengsel op de scheidingsgel. Plaats een kam in de stapelgel en verwijder eventuele luchtbellen rond de kam.Laat de stapelgel vervolgens 60 minuten op kamertemperatuur staan. Verwijder de kam en spoel vervolgens de gelsleuven af met water. Doe de gel in de geltank en vul de geltank tot de bovenkant met loopbuffer.Meng vijf tot 10 microliter plasmamembraanmonsters met gelijke volumes van twee keer de eiwitbeladende kleurstof en laad het monstermengsel onmiddellijk in afzonderlijke gelsleuven, ondergedompeld in een lopende buffer. Laad eiwitmoleculaire gewichtsmarkers in het bereik van 10 tot 245 Kilodalton in een aparte sleuf om de grootteschatting van individuele eiwitfragmenten mogelijk te maken. Voer gel-elektroforese uit bij 200 volt totdat de blauwe ladingskleurstof de bodem van de gel bereikt.Onderzoek de gel op in-gel GFP-fluorescentie met een gelbeeldvormingssysteem. Na de fluorescerende beeldvorming fixeren eiwitten in 10 tot 20 milliliter eiwitgelfixerende oplossing door de gel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zachtjes te roeren. Spoel de twee keer gedurende 10 minuten met 10 milliliter dubbel gedestilleerd water en plaats de gel in 10 milliliter colloïdale Kumasi-vlekoplossing met zacht schudden gedurende een uur bij kamertemperatuur om eiwitbanden te visualiseren.Voor een betere visualisatie van eiwitbanden, de-kleuring van de gel een of twee keer in 20 milliliter dubbel gedestilleerd water gedurende een uur voordat beelden worden opgenomen met het gelbeeldvormingssysteem. Een hoge frequentie van transformatie van Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta werd bereikt met het positieve controleplasmide PS2. Er werden geen Eurocell Prototron-transformanten verkregen voor de negatieve controle.Ongeveer 50 URA-cel prototrofe CDR1-mGFPHis-transformatiemiddel werd verkregen na het incuberen van getransformeerde AD Delta Delta-cellen op CSM minus URA-platen gedurende drie dagen. Kleine transformant die niet op YPG-agarplaten kan groeien, werd geëlimineerd. CDR1-mGHPHis monsters met verschillende concentraties werden gekwantificeerd met in-gel fluorescentie.De mGFP-fluorescentie-intensiteiten waren lineair over het gehele concentratiebereik met minimale achtergrondfluorescentie. Het variëren van de celdichtheid gaf aan dat het breken van 40 ODU van cellen de hoogste kwaliteit plasmamembranen met de hoogste CDR1 ATPase-activiteit opleverde. De opbrengst van de plasmamembranen nam echter toe in verhouding tot toenemende celdichtheden.Het vermogen van 31 detergentia met verschillende eigenschappen om CDR1-mGHPHis op te ruimen uit ruwe plasmamembranen van AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis-cellen werden getest met SDS-pagina. Beta en alpha DDM En Fos-choline 13 waren de beste wasmiddelen om CDR1-mGHPHis op te slokken. Echter, Fos-choline 13 veroorzaken gedeeltelijke hydrolyse van CDR1-mGHPHis.Ruw plasmamembraaneiwit opgelost met 1% wasmiddel werd gescheiden met behulp van een superos zes verhoogde uitsluitingskolom van 10 300 GL. Chromatogrammen van Maltosiden en LMNG geëxtraheerde eiwitten toonden de meeste CDR1-mGHPHis ontglipte als een mooi gevormde Gaussische piek op 15,5 millimeter CDR1-mGHPHis opgelost met glucose bevattende detergentia zinspeelde als een geaggregeerde of brede geaggregeerde piek. De hogere pieken voor DDM gaven aan dat een groot deel van DMN G oplosbare CDR1-mGHPHis gedenatureerd kan zijn.In de FSCC chromatogrammen voor zwitterionische Fos-cholines en twee niet-ionische detergentia alleen Digitonin en gaf een vergelijkbaar chromatogram als DDM. Fos-choline 13 gaf een symmetrische scherp gevormde piek, maar het zinspeelde op een significant lager elutievolume dan dat voor DDM. De geoptimaliseerde dubbele tag verbeterde ook de zuiveringsopbrengst en hielp bij het bepalen van de lokalisatie, handel en thermische stabiliteit van membraaneiwitten.De heterologe expressietechnologie kan ook worden gebruikt bij high throughput drug screening en de gedetailleerde karakterisering van vele andere membraaneiwitten.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Novel Production Protocol voor Kleinschalig Fabricage van probiotische gefermenteerde levensmiddelen

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Karakterisatie van MLKL-gemedieerde plasmamembraan Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Bereiding van de monsters voor Proteomics-analyse op basis van massa-spectrometrie van oogbeschadigingen en/of Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT &amp; RUN-methode en data-analyseworkflow

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...