Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
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Les auteurs reconnaissent avec gratitude le financement du New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) et une subvention globale de la Faculté de médecine de l’Université Chulalongkorn, Bangkok, Thaïlande (M. Niimi). Ils souhaitent remercier l’Université d’Otago d’avoir fourni à G. Madani une bourse de doctorat. Les auteurs souhaitent également exprimer leur gratitude au professeur Stefan Raunser et à ses collègues, le Dr Amir Apelbaum et le Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, pour leur soutien et leur supervision lors d’une visite de 6 mois de G. Madani à l’Institut Max Planck de physiologie moléculaire (MPIMP), Dortmund, Allemagne. Les auteurs remercient également le Service allemand d’échanges universitaires (DAAD) d’avoir fourni à G. Madani une subvention de recherche (57381332) pour visiter le MPIMP.

1. Préparation de stocks frais ou congelés de cellules ADΔ et ADΔΔ compétentes en transformation
<ol><li>Inoculer 25 mL de 2x YPCD [c.-à-d. 2x YPD; 2% (p/v) d’extrait de levure, 2% (p/v) de peptone, 4% (p/v) de dextrose), 0,079 % (p/v) de CSM (mélange complet de supplément)]35 milieu avec une seule colonie de levure et incuber pendant la nuit (o/n) pendant 16 h à 30 °C en agitant à 200 tours par minute (tr/min).</li>
	<li>Inoculer 225 mL de milieu 2x YPCD avec la culture 25 mL o/n ...

Malgré les progrès récents dans l’analyse structurale des protéines membranaires, aucune structure 3D pour Cdr1, ou tout autre transporteur PDR, n’est actuellement disponible. Il est donc important d’acquérir des connaissances sur la structure Cdr1 et ses caractéristiques biochimiques, car cela donnera non seulement un aperçu de la conception rationnelle de nouveaux médicaments pour surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, mais également du mécanisme de fonctionnement d’une imp...

L’extraction des protéines membranaires intégrales de leur environnement lipidique natif peut affecter considérablement leur structure et leur fonction1,2,3,4. La composition lipidique complexe des membranes biologiques5 garantit que des interactions protéine-lipide d’importance critique peuvent se produire6. Les lipides maintiennent l’intégrité structurelle des protéines membranaires, leur permettant ainsi de fonctionner correctement dans leur(s) compartiment(s) membranaire(s) destination(s)7,8. Par conséquent, une première étape critique dans la purification de la protéine membranaire est l’extraction de la protéine de son environnement natif sans affecter sa structure et / ou sa fonction.
Il existe de nombreux obstacles à la caractérisation de la structure des protéines membranaires, dont la plupart sont liés à leur nature hydrophobe, et aux difficultés d’expression de protéines membranaires correctement repliées et fonctionnelles dans les quantités requises pour la cristallographie aux rayons X ou la cryo-microscopie électronique (cryo-EM)9,10,11,12. Il existe trois types de systèmes d’expression des protéines membranaires :homologues 9, hétérologues13,14,15et systèmes d’expression in vitro 16,17. Les niveaux d’expression souvent faibles, ou les coûts prohibitifs, de nombreux systèmes d’expression ne laissent que quelques hôtes comme option préférée pour produire des protéines membranaires. Ils comprennent l’hôte bactérien, Escherichia coli, les levures S. cerevisiae et Pichia pastoris, et les eucaryotes supérieurs tels que les cellules d’insectes Sf9 ou les lignées cellulaires de mammifères18. Toutes les technologies d’expression des protéines membranaires présentent des avantages et des inconvénients; cependant, S. cerevisiae est peut-être l’organisme modèle eucaryote le mieux étudié adapté à la production de protéines membranaires. Il est très polyvalent avec des applications dans le génie génétique, la découverte de médicaments, la biologie synthétique et l’expression des protéines de la membrane eucaryote14,19,20,21.
Dans cette étude, une technologie brevetée d’expression des protéines membranaires S. cerevisiae 21 a été utilisée, avec S. cerevisiae ADΔ14 et ADΔΔ22 comme hôtes préférés(Figure 1A),pour surexprimer et étudier la principale pompe d’efflux multimédicament C. albicans Cdr1. Les deux souches de S. cerevisiae sont des dérivés de AD1-8u- 23 qui ont soit les gènes ura3 (ADΔ) ou les gènes ura3 et his1 (ADΔΔ) supprimés pour éliminer tout transformant prototrophe uracile ou histidine faussement positif résultant de l’intégration indésirable aux loci génomiques URA3 ou HIS1. La suppression des 7 principales pompes d’efflux multidrogue23, indiquée à la figure 1A, rend ADΔΔ extrêmement sensible à la plupart des xénobiotiques. Le facteur de transcription mutant de gain de fonction Pdr1-3 provoque la surexpression constitutive de protéines membranaires hétérologues telles que Cdr1 (octogones rouges dans la figure 1A)après intégration de la cassette de transformation hétérologue contenant de l’ORF(Figure 1A)au locus génomique PDR5 (rectangle bleu dans la figure 1A)via deux événements de recombinaison homologue. La localisation correcte de la membrane plasmique des protéines marquées mGFPHis C-terminale peut être confirmée par microscopie confocale(Figure 1A),et l’étiquette His peut être utilisée pour la purification par affinité nickel de la protéine marquée. Le clonage de certains transporteurs fongiques ABC (p. ex. Candida krusei ABC1)en plasmides dérivés de pABC3 n’a toutefois pas été possible car ils n’ont pas pu être propagés dans Escherichia coli en raison de la toxicité cellulaire. Cela a incité au développement du clonage en une étape des protéines membranaires14,24 marquées à leur terminus N ou C avec diverses étiquettes d’affinité, d’épitope ou de rapporteur directement dans S. cerevisiae ADΔΔ ( Figure1C). S. cerevisiae Les souches ADΔΔ surexprimant divers mutants CDR1 peuvent également être créées efficacement de cette manière en utilisant jusqu’à cinq fragments PCR individuels qui se chevauchent de 25 pb(Figure 1C). En utilisant ce protocole, de nombreux ORF d’intérêt peuvent être clonés, exprimés et caractérisés à faible coût et à haute efficacité dans un laps de temps très court. L’efficacité de la transformation ne diminue que d’environ 2 fois à chaque fragment de PCR supplémentaire.
Si vous le souhaitez, les niveaux d’expression peuvent également être facilement manipulés par la conception de l’amorce pour régler de manière prévisible les niveaux d’expression entre 0,1% et 50% des niveaux d’expression constitutifs généralement élevés25. Le vecteur de clonage dérivé optimisé et multifonctionnel pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Figure 1B)contient un site de clivage de la protéase HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), une protéase qui fonctionne mieux à 4 °C que la protéase27du virus de la gravure du tabac (TEV) fréquemment utilisée. L est un linker à cinq acides aminés (GSGGS), mGFP est un mutant monomère (A206K)28,version 29 de la variante de protéine de fluorescence verte améliorée de levure yEGFP330, et His est un linker à trois acides aminés (GGS) suivi de la balise de purification de la protéine d’affinité nickel à six histidine (HHHHHH).
Cette technologie d’expression a été utilisée avec succès dans la découverte de médicaments et l’étude des protéines membranaires. La première structure d’une cible fongique de médicament azole, S. cerevisiae Erg1131, a été résolue à l’aide de cette technologie. Il a également permis la caractérisation détaillée de C. albicans Cdr132,33,34 et la création d’une molécule Cdr1 déficiente en cystéine35 adaptée aux études de réticulation de cystéine pour vérifier toute future structure à haute résolution. De nombreux autres transporteurs ABC provenant d’agents pathogènes fongiques humains majeurs (c.-à-d. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei et le complexe d’espèces Fusarium solani) ont également été étudiés en détail à l’aide de cette plate-formed’expression24,36,37,38,39. Cela a permis la génération d’un panel de souches de S. cerevisiae surexprimant les pompes d’efflux qui a été utilisé dans les écrans à haut débit pour découvrir le nouveau substrat de pompe d’efflux fluorescent Nile red40 et les inhibiteurs spécifiques de la pomped’efflux41 et à large spectre14,33,42, 43,44. L’utilisation de ce système a également permis la découverte de la clorgyline en tant que premier inhibiteur de pompe d’efflux de médicaments multimédicaments fongiques à large spectre de son genre42.
La solubilisation complète des protéines membranaires et la création d’une préparation homogène de protéines-micelles membranaires dépourvues de lipides endogènes, nécessitent des concentrations détergentes élevées45. Mais malheureusement, cela inactive aussi souvent la protéine membranaire5,8,45,46. Les propriétés des monomères détergents et leur agrégation en solution sont affectées par les propriétés physiques de la queue hydrophobe, la longueur et la ramification de la chaîne alkyle, la présence d’un noyau aromatique ou d’une chaîne latérale fluoroalkyle, ou le nombre d’unités de polyoxyéthylène. Ainsi, le criblage des détergents est une première étape importante pour déterminer le détergent le plus approprié pour la solubilisation et la purification des protéines membranaires.
C. albicans est un pathogène fongique humain majeur des personnes immunodéprimées qui peut causer des infections invasives graves et potentiellement mortelles47, et il peut devenir résistant aux médicaments antifongiques azoles48,49. L’un des principaux mécanismes de la multirésistance aux médicaments de C. albicans est la surexpression de Cdr150, qui est un transporteur de cassette de liaison à l’ATP (ABC) de type II51 de la sous-famille ABCG situé dans la membrane plasmique. Les transporteurs ABCG fongiques pleine grandeur (constitués de deux domaines de liaison aux nucléotides [ND] et de deux domaines transmembranaires [TMD]) sont plus communément appelés transporteurs pléiotropes de résistance aux médicaments (PDR) et se caractérisent par leur topologie unique de domaine inversé [NBD-TMD]2. Les transporteurs PDR ne se trouvent que dans les plantes52,53 et les champignons54. Malgré leur importance, il n’y a pas de structures pour les transporteurs PDR, bien que les structures pour les transporteurs ABCG humains de demi-taille aient récemment été résolues, ce qui a contribué à créer le premier modèle provisoire pour Cdr133. Nos preuves expérimentales récentes suggèrent, cependant, que ce modèle est défectueux peut-être parce que les transporteurs PDR fongiques ont des NBD asymétriques caractéristiques résultant très probablement en un mécanisme de transport unique. Une structure à haute résolution de Cdr1 est donc nécessaire à la fois pour la conception rationnelle de nouveaux inhibiteurs de pompe d’efflux qui peuvent aider à surmonter la résistance aux médicaments médiée par l’efflux, et pour fournir des informations sur le mécanisme d’action de cette importante famille de transporteurs ABC.
L’objectif de cette étude était de développer des protocoles fiables pour l’expression, la solubilisation et la purification de Cdr1 dans l’hôte d’expression de S. cerevisiae génétiquement modifié, dans le but ultime d’obtenir une structure à haute résolution pour Cdr1. Dans le cadre de ce processus, une double étiquette mGFPHis clivée par la protéase(Figure 1B)a été conçue avec un liant à 16 résidus séparant l’étiquette de la terminaison C de Cdr1, ce qui a amélioré la liaison de la balise d’affinité 6x His attachée à la résine d’affinité nickel et a permis de surveiller les niveaux d’expression de Cdr1 dans les cellules vivantes et pendant tout le processus de purification. Un protocole reproductible pour les préparations de protéines de membrane plasmique de levure à petite échelle contenant environ 10% de C. albicans Cdr1 (tel qu’estimé par la coloration de Coomassie après SDS-PAGE) a également été développé, qui pourrait être utilisé pour la caractérisation biochimique de Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

Le succès de la caractérisation biochimique et biophysique des transporteurs ABC dépend fortement du choix du système d’expression hétérologue. Au cours des deux dernières décennies, nous avons développé une plateforme d’expression des protéines membranaires de levure qui a été utilisée pour étudier de nombreuses protéines membranaires fongiques importantes. L’expression hôte Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ est supprimée dans sept principaux transporteurs ABC endogènes et contient le facteur de transcription Pdr1-3 avec une mutation de gain de fonction qui permet la surexpression constitutive de gènes protéiques membranaires hétérologues intégrés de manière stable sous forme de copies uniques au locus génomique PDR5. La création de vecteurs plasmidiques polyvalents et l’optimisation de stratégies de clonage en une seule étape permettent le clonage, la mutagénèse et l’expression rapides et précis de transporteurs ABC hétérologues. Ici, nous décrivons le développement et l’utilisation d’une nouvelle double étiquette mGFPHis clivée par la protéase (c’est-à-dire la protéine fluorescente verte améliorée par levure monomère yEGFP3 fusionnée à une étiquette de purification d’affinité à six histidines) qui a été conçue pour éviter toute interférence possible de la balise avec la protéine d’intérêt et pour augmenter l’efficacité de liaison de la balise His aux résines d’affinité nickel. La fusion de mGFPHis à la protéine membranaire ORF (cadre de lecture ouvert) permet une quantification facile de la protéine par inspection de gels de polyacrylamide et détection de produits de dégradation conservant la balise mGFPHis. Nous démontrons comment cette caractéristique facilite le criblage des détergents pour la solubilisation des protéines membranaires. Un protocole pour l’isolation efficace, rapide et fiable des préparations de membrane plasmique à petite échelle du transporteur d’efflux multimédicament Candida albicans Cdr1 surexprimant dans S. cerevisiae ADΔΔ, marqué en C-terminal, est présenté. Ce protocole d’isolation des membranes plasmiques à petite échelle génère des membranes plasmiques de haute qualité en une seule journée de travail. Les préparations de membrane plasmique peuvent être utilisées pour déterminer les activités enzymatiques des variantes mutantes Cdr1 et Cdr1.

Une fréquence élevée de transformation de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformants/μg) a été obtenue avec pYES2(Figure 2B). Comme prévu, le contrôle sans ADN (c’est-à-dire ddH2O uniquement) n’a donné aucun transformant, et 1 μg de la cassette de transformation linéaire CDR1-mGFPHis (Figure 1A) a donné ~ 50 transformants (Figure 2C) avec le protocole de transformat...

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Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.

Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Le protocole d’isolation de la membrane plasmique à petite échelle et la double étiquette mGFPHis fournissent une méthode économique, rapide, fiable et facile pour caractériser les protéines membranaires dans l’organisme modèle eucaryote, Saccharomyces cerevisiae. Le plus grand avantage de cette technologie est la facilité et la rapidité avec lesquelles les niveaux d’expression des protéines membranaires, les activités de l’ATP et le détergent sont les mieux adaptés à leur purification peuvent être déterminés. Cette technologie est très conviviale.Cependant, un point important à retenir est de récolter les cellules en tant que OD 600 de 2, ce qui garantit une faible contamination mitochondriale et les activités ATPase les plus élevées possibles. Commencez par pré-cultiver une seule colonie de levure dans 10 millilitres de milieu YPD à 30 degrés Celsius pendant sept à huit heures à 200 rotations par minute. Utilisez 10 millilitres de pré-culture pour inoculer 40 millilitres de milieu YPD frais.Ensuite, incubez les cellules à 30 degrés Celsius pendant la nuit à 200 rotations par minute jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne un OD 600 de un à trois. Le lendemain, récoltez 40 unités de densité optique, ou ODU, de cellules logarithmiques du visage par centrifugation à 4 200 fois G par cinq minutes à quatre degrés Celsius. Re-suspendre et laver les cellules avec 40 millilitres d’eau double distillée stérile glacée.Répétez le lavage en utilisant un millilitre d’eau glacée avec centrifugation entre les étapes de lavage. Resséquez la pastille dans un millilitre d’eau stérile glacée et transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pré-refroidi sur glace. Récoltez des cellules à 3 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.Aspirer le surnageant et re-suspendre la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon homogénéisant fraîchement complété par un millimolaire de fluorure de méthylsulfate de méthyle Neal, ou PMSF. Conservez la suspension cellulaire à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Décongeler les cellules sur la glace pendant environ une heure.Ajoutez ensuite des billes de silice glacées de 0,5 millimètre de diamètre aux 500 microlitres de la suspension cellulaire pour atteindre un volume total d’un millilitre. Pour briser les cellules, vortex la suspension cellulaire à l’intensité maximale d’agitation pendant une minute, pendant six cycles, avec une période de refroidissement de trois minutes sur la glace après chaque cycle. Après le vortex, faites un trou mince au fond du tube avec une lame de scalpel chauffée et collectez l’homogénat de cellule cassé dans un autre tube de microcentrifugation glacé de 1,5 millilitre avec un spin à basse vitesse pendant 10 secondes.Centrifuger l’homogénat cellulaire collecté à 5 156 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Transférer 450 microlitres de surnageant dans un tube de microcentrifugation glacé de 1,5 millilitre et ajouter un millilitre de tampon d’homogénéisation glacé complété par un PMSF frais millimolaire. Pour récolter les membranes plasmiques, centrifugez la suspension cellulaire à 17 968 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius.Retirez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de tampon homogénéisant fraîchement complété par un PMSF millimolaire. Ensuite, desserrer la pastille de membrane plasmique en remuant avec l’embout de la pipette de 100 microlitres et re-suspendre la pastille en répétant le pipetage de haut en bas. Mesurez la concentration en protéines de la préparation de la membrane plasmique à l’l’éventreur à l’éventreur à l’avec un kit d’analyse des protéines compatible avec les tampons contenant l’agent réducteur et le détergent.Conservez les membranes plasmiques à moins 80 degrés Celsius ou conservez-les sur la glace pour une utilisation immédiate. Versez quatre à cinq millilitres de gel séparateur dans l’appareil à gel assemblé jusqu’à deux centimètres du haut. Superposez soigneusement un à deux millilitres de FDS à 0,1% sur le dessus et laissez le gel de polyacrylamide se fixer pendant 60 minutes à température ambiante.Après une heure, retirez la couche de FDS à 0,1% du gel séparateur polymérisé et rincez le gel avec de l’eau distillée double pour éliminer les traces de FDS. Versez le mélange de gel empilable sur le gel séparateur. Placez un peigne dans le gel empilable et retirez toutes les bulles d’air autour du peigne.Laissez ensuite le gel empilable se fixer pendant 60 minutes à température ambiante. Retirez le peigne, puis rincez les fentes de gel avec de l’eau. Mettez le gel dans le réservoir de gel et remplissez le réservoir de gel jusqu’au sommet avec un tampon de fonctionnement.Mélanger cinq à 10 microlitres d’échantillons de membrane plasmique avec des volumes égaux de deux fois le colorant à charge protéique et charger immédiatement le mélange d’échantillons dans des fentes de gel individuelles, immergées dans un tampon de fonctionnement. Chargez les marqueurs de poids moléculaire des protéines dans la gamme de 10 à 245 kilodaltons dans un emplacement séparé pour permettre l’estimation de la taille des fragments de protéines individuels. Effectuez l’électrophorèse sur gel à 200 volts jusqu’à ce que le colorant à chargement bleu atteigne le fond du gel.Examinez le gel pour la fluorescence GFP dans le gel avec un système d’imagerie de gel. Suite à l’imagerie fluorescente fixer les protéines dans 10 à 20 millilitres de solution fixatrice de gel protéique par agitation douce du gel pendant 15 minutes à température ambiante. Rincez ensuite deux fois pendant 10 minutes avec 10 millilitres d’eau double distillée et placez le gel dans 10 millilitres de solution de coloration colloïdale de Kumasi en agitant doucement pendant une heure à température ambiante pour visualiser les bandes protéiques.Pour une meilleure visualisation des bandes protéiques, détachant le gel une ou deux fois sur 20 millilitres d’eau distillée double pendant une heure avant d’enregistrer des images avec le système d’imagerie en gel. Une fréquence élevée de transformation de Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta a été obtenue avec le plasmide témoin positif PS2. Aucun transformant Eurocell Prototron n’a été obtenu pour le contrôle négatif.Environ 50 prototrophes de cellules URA CDR1-mGFPHis transformant ont été obtenus après l’incubation de cellules AD Delta Delta transformées sur des plaques CSM moins URA pendant trois jours. Les petits transformants qui ne peuvent pas pousser sur les plaques de gélose YPG ont été éliminés. Les échantillons CDR1-mGHPHis avec des concentrations variables ont été quantifiés avec une fluorescence dans le gel.Les intensités de fluorescence mGFP étaient linéaires sur toute la plage de concentration avec une fluorescence de fond minimale. La variation de la densité cellulaire indiquait que la rupture de 40 ODU de cellules produisait la plus haute qualité de membranes plasmiques avec l’activité LA PLUS ÉLEVÉE DE L’ATPase CDR1. Cependant, le rendement des membranes plasmiques a augmenté proportionnellement à l’augmentation des densités cellulaires.La capacité de 31 détergents aux propriétés diverses à solubiliser les CDR1-mGHPHis à partir des membranes plasmiques brutes des cellules AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis a été testée avec la page SDS. Beta et alpha DDM et Fos-choline 13 étaient les meilleurs détergents pour solubiliser CDR1-mGHPHis. Cependant, Fos-choline 13 provoque une hydrolyse partielle de CDR1-mGHPHis.La protéine brute de la membrane plasmique solubilisée avec un détergent à 1 % a été séparée à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille superos six augmentée de 10 300 GL. Les chromatogrammes des maltosides et des protéines extraites du GNLM ont montré que la plupart des CDR1-mGHPHis échappaient à un pic gaussien de forme agréable à 15,5 millimètres CDR1-mGHPHis solubilisé avec des détergents contenant du glucose, évoqué comme un pic agrégé ou agrégé large. Les pics plus élevés pour le DDM ont indiqué qu’une grande partie du CDR1-mGHPHi solubilisé DMN G peut être dénaturée.Dans les chromatogrammes FSCC pour fos-cholines zwitterionique et deux détergents non ioniques seulement Digitonin et a donné un chromatogramme similaire à DDM. Fos-choline 13 a donné un pic symétrique de forme nette, mais il a fait allusion avec un volume d’élution significativement inférieur à celui du DDM. La double étiquette optimisée améliore également le rendement de purification et aide à déterminer la localisation, le trafic et la stabilité thermique des protéines membranaires.La technologie d’expression hétérologue peut également être utilisée dans le dépistage de médicaments à haut débit et la caractérisation détaillée de nombreuses autres protéines membranaires.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

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