Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
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Die Autoren danken der Finanzierung durch den New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) und einem Blockzuschuss der Medizinischen Fakultät der Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Sie danken der University of Otago für die Bereitstellung eines Promotionsstipendiums für G. Madani. Die Autoren danken auch Professor Stefan Raunser und seinen Kollegen Dr. Amir Apelbaum und Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam für ihre Unterstützung und Betreuung während eines 6-monatigen Besuchs von G. Madani am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie (MPIMP), Dortmund, Deutschland. Die Autoren danken auch dem Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) für die Bereitstellung eines Forschungsstipendiums (57381332) für den Besuch des MPIMP durch G. Madani.

1. Herstellung von frischen oder gefrorenen Umwandlungsbeständen kompetenter ADΔ- und ADΔΔ-Zellen
<ol><li>25 ml 2x YPCD [d.h. 2x YPD; 2% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 4% (w/v) Dextrose, 0,079% (w/v) CSM (komplette Ergänzungsmischung)]35 Medium mit einer einzigen Hefekolonie bei impfen und über Nacht (o/n) für 16 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute (U/min) inkubieren.</li>
	<li>Impfen Sie 225 ml 2x YPCD-Medium mit der 25 mL o/n-Kultur und überprüfen Sie die o...

Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Strukturanalyse von Membranproteinen ist derzeit keine 3D-Struktur für Cdr1 oder einen anderen PDR-Transporter verfügbar. Daher ist es wichtig, Kenntnisse über die Cdr1-Struktur und ihre biochemischen Eigenschaften zu gewinnen, da dies nicht nur Einblicke in das rationale Design neuartiger Medikamente zur Überwindung von effluxvermittelter Arzneimittelresistenz geben wird, sondern auch in den Funktionsmechanismus einer wichtigen Unterfamilie von ABC-Proteinen.
<p class="jo...

Die Extraktion integraler Membranproteine aus ihrer nativen Lipidumgebung kann ihre Struktur und Funktion dramatisch beeinflussen1,2,3,4. Die komplexe Lipidzusammensetzung biologischer Membranen5 sorgt dafür, dass kritisch wichtige Protein-Lipid-Interaktionen auftreten können6. Lipide erhalten die strukturelle Integrität von Membranproteinen und ermöglichen es ihnen so, in ihrem Membrankompartiment-Ziel(e) korrekt zu funktionieren7,8. Daher ist ein kritischer erster Schritt bei der Reinigung des Membranproteins die Extraktion des Proteins aus seiner nativen Umgebung, ohne seine Struktur und / oder Funktion zu beeinträchtigen.
Es gibt viele Hindernisse für die Charakterisierung der Struktur von Membranproteinen, von denen die meisten mit ihrer hydrophoben Natur zusammenhängen, und die Schwierigkeiten, richtig gefaltete und funktionelle Membranproteine in den Mengen zu exprimieren, die für die Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) erforderlich sind9,10,11,12. Es gibt drei Arten von Membranproteinexpressionssystemen: homologe9, heterologe13,14,15und in vitro Expressionssysteme 16,17. Die oft niedrigen Expressionsniveaus oder die unerschwinglichen Kosten vieler Expressionssysteme lassen nur wenige Wirte als bevorzugte Option zur Herstellung von Membranproteinen. Dazu gehören der bakterielle Wirt Escherichia coli,die Hefen S. cerevisiae und Pichia pastorissowie höhere Eukaryoten wie Sf9-Insektenzellen oder Säugetierzelllinien18. Alle Membranproteinexpressionstechnologien haben Vor- und Nachteile; S. cerevisiae ist jedoch vielleicht der am besten untersuchte eukaryotische Modellorganismus, der für die Membranproteinproduktion geeignet ist. Es ist sehr vielseitig mit Anwendungen in der Gentechnik, Wirkstoffforschung, synthetischen Biologie und der Expression von eukaryotischen Membranproteinen14,19,20,21.
In dieser Studie wurde eine patentierte S. cerevisiae Membranproteinexpressionstechnologie21 verwendet, mit S. cerevisiae ADΔ14 und ADΔΔ22 als bevorzugte Wirte (Abbildung 1A), um die Haupt-C. albicans Multidrug-Effluxpumpe Cdr1 zu überexprimieren und zu untersuchen. Beide S. cerevisiae-Stämme sind Derivate von AD1-8u-23, bei denen entweder das ura3 (ADΔ) oder sowohl das ura3- als auch das his1-Gen (ADΔΔ) gelöscht wurden, um falsch positive Uracil- oder Histidin-Prototroph-Transformanten zu eliminieren, die durch die unerwünschte Integration an den genomischen Loci URA3 oder HIS1 entstehen. Die In Abbildung 1Adargestellte Löschung der 7 wichtigsten Multidrug-Effluxpumpen23macht ADΔΔ exquisit empfindlich gegenüber den meisten Xenobiotika. Der Gain-of-Function-Mutanten-Transkriptionsfaktor Pdr1-3 bewirkt die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteine wie Cdr1 (rote Achtecke in Abbildung 1A)nach Integration der heterolog-ORF-haltigen Transformationskassette (Abbildung 1A) am genomischen PDR5-Locus (blaues Rechteck in Abbildung 1A)über zwei homologe Rekombinationsereignisse. Die korrekte Plasmamembranlokalisierung von C-terminal mGFPHis markierten Proteinen kann durch konfokale Mikroskopie bestätigt werden (Abbildung 1A), und das His-Tag kann zur Nickelaffinitätsreinigung des markierten Proteins verwendet werden. Das Klonen einiger Pilz-ABC-Transporter (z.B. Candida krusei ABC1)in pABC3-abgeleitete Plasmide war jedoch nicht möglich, da sie aufgrund der Zelltoxizität nicht in Escherichia coli vermehrt werden konnten. Dies führte zur Entwicklung des einstufigen Klonens von Membranproteinen14,24, die entweder an ihrem N- oder C-Terminus mit verschiedenen Affinitäts-, Epitop- oder Reporter-Tags direkt in S. cerevisiae ADΔΔ markiert sind (Abbildung 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-Stämme, die verschiedene CDR1-Mutanten überexprimieren, können auf diese Weise auch effizient erzeugt werden, indem bis zu fünf einzelne PCR-Fragmente verwendet werden, die sich um 25 bp überlappen (Abbildung 1C). Mit diesem Protokoll können viele ORFs von Interesse zu niedrigen Kosten und mit hoher Effizienz innerhalb kürzester Zeit geklont, ausgedrückt und charakterisiert werden. Die Transformationseffizienz reduziert sich mit jedem zusätzlichen PCR-Fragment nur ~2-fach. 
Falls gewünscht, können Ausdrucksebenen auch leicht durch Primer-Design manipuliert werden, um die Ausdruckspegel vorhersehbar auf 0,1% bis 50% der normalerweise hohen, konstitutiven Ausdrucksstufen25zu optimieren. Der optimierte, multifunktionale, pABC314 derivative Klonierungsvektor, pABC3-XLmGFPHis26 (Abbildung 1B) enthält eine HRV-3C-Protease-Spaltungsstelle (X; LEVLFQ| GP), eine Protease, die bei 4 °C besser abschneidet als die häufig verwendete Tabakätzvirus (TEV) Protease27. L ist ein Linker mit fünf Aminosäuren (GSGGS), mGFP ist eine monomere Mutante (A206K)28,29 Version der hefeverstärkten Grünfluoreszenzproteinvariante yEGFP330, und His ist ein Drei-Aminosäure-Linker (GGS), gefolgt von der Sechs-Histidin (HHHHHH) Nickelaffinität Proteinreinigungsmarkierung.
Diese Expressionstechnologie wurde erfolgreich in der Wirkstoffforschung und der Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt. Die erste Struktur für ein Pilzazol-Wirkstoffziel, S. cerevisiae Erg1131, wurde mit dieser Technologie gelöst. Es ermöglichte auch die detaillierte Charakterisierung von C. albicans Cdr132,33,34 und die Schaffung eines Cystein-defizienten Cdr1-Moleküls35, das für Cystein-Vernetzungsstudien geeignet ist, um jede zukünftige hochauflösende Struktur zu verifizieren. Viele andere ABC-Transporter von wichtigen menschlichen Pilzerregern (z. B. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei und der Fusarium solani-Artenkomplex) wurden ebenfalls ausführlich mit dieser Expressionsplattform24,36,37,38,39untersucht. Dies hat die Erzeugung eines Panels von S. cerevisiae-Stämmen ermöglicht, die Überflusspumpen überexprimieren, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen verwendetwurden,um das neuartige fluoreszierende Effluxpumpensubstrat Nilrot40 und spezifische41 und Breitbandpumpeninhibitoren14,33,42, 43,44 zu entdecken. Die Verwendung dieses Systems ermöglichte auch die Entdeckung von Clorgylin als erstem seiner Art Breitband-Pilz-Multidrug-Effluxpumpen-Inhibitor42.
Die vollständige Solubilisierung von Membranproteinen und die Schaffung einer homogenen Membranprotein-Mizellen-Zubereitung ohne endogene Lipide erfordert hohe Waschmittelkonzentrationen45. Leider inaktiviert dadurch aber auch oft das Membranprotein5,8,45,46. Die Eigenschaften von Waschmittelmonomeren und ihre Aggregation in Lösung werden durch die physikalischen Eigenschaften des hydrophoben Schwanzes, die Länge und Verzweigung der Alkylkette, das Vorhandensein eines aromatischen Kerns oder einer Fluoralkylseitenkette oder die Anzahl der Polyoxyethyleneinheiten beeinflusst. Daher ist das Waschmittel-Screening ein wichtiger erster Schritt, um das am besten geeignete Reinigungsmittel für die Membranprotein-Solubilisierung und -reinigung zu bestimmen.
C. albicans ist ein wichtiger menschlicher Pilzerreger immungeschwächter Personen, der schwere, lebensbedrohliche invasive Infektionen verursachen kann47, und es kann resistent gegen Azol-Antimykotika werden48,49. Einer der Hauptmechanismen der Multidrug-Resistenz von C. albicans ist die Überexpression von Cdr150, einem Typ II ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC)51 der ABCG-Unterfamilie, der sich in der Plasmamembran befindet. ABCG-Pilztransporter in voller Größe (bestehend aus zwei Nukleotidbindungsdomänen [NBDs] und zwei Transmembrandomänen [TMDs]) sind häufiger als pleiotrope Arzneimittelresistenztransporter (PDR) bekannt und zeichnen sich durch ihre einzigartige invertierte Domänentopologie [NBD-TMD]2 aus. PDR-Transporter kommen nur in Pflanzen52,53 und Pilzen54 vor. Trotz ihrer Bedeutung gibt es keine Strukturen für PDR-Transporter, obwohl Strukturen für menschliche ABCG-Transporter mittlerer Größe kürzlich gelöst wurden, was dazu beigetragen hat, das erste vorläufige Modell für Cdr133zu erstellen. Unsere jüngsten experimentellen Beweise deuten jedoch darauf hin, dass dieses Modell fehlerhaft ist, möglicherweise weil Pilz-PDR-Transporter charakteristische asymmetrische NBDs haben, was möglicherweise zu einem einzigartigen Transportmechanismus führt. Eine hochauflösende Struktur von Cdr1 ist daher sowohl für das rationale Design neuartiger Effluxpumpeninhibitoren erforderlich, die helfen können, effluxvermittelte Arzneimittelresistenzen zu überwinden, als auch um Einblicke in den Wirkmechanismus dieser wichtigen ABC-Transporterfamilie zu geben.
Ziel dieser Studie war es, zuverlässige Protokolle für die Expression, Solubilisierung und Reinigung von Cdr1 im genetisch veränderten Expressionswirt S. cerevisiae zu entwickeln, mit dem ultimativen Ziel, eine hochauflösende Struktur für Cdr1 zu erhalten. Im Rahmen dieses Prozesses wurde ein proteasespalter mGFPHis-Doppel-Tag (Abbildung 1B) mit einem 16-Rückstands-Linker entwickelt, der den Tag vom C-Terminus von Cdr1 trennt, was die Bindung des angehängten 6x His-Affinitäts-Tags an das Nickelaffinitätsharz verbesserte und die Überwachung der Cdr1-Expressionsniveaus in lebenden Zellen und während des gesamten Reinigungsprozesses ermöglichte. Es wurde auch ein reproduzierbares Protokoll für kleine Hefeplasmamembranproteinpräparate mit etwa 10% C. albicans Cdr1 (wie von Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE geschätzt) entwickelt, das für die biochemische Charakterisierung von Cdr1 verwendet werden könnte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

Die erfolgreiche biochemische und biophysikalische Charakterisierung von ABC-Transportern hängt stark von der Wahl des heterologen Expressionssystems ab. In den letzten zwei Jahrzehnten haben wir eine Plattform zur Expression von Hefemembranproteinen entwickelt, mit der viele wichtige Pilzmembranproteine untersucht wurden. Der Expressionswirt Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wird in sieben großen endogenen ABC-Transportern gelöscht und enthält den Transkriptionsfaktor Pdr1-3 mit einer Gain-of-Function-Mutation, die die konstitutive Überexpression heterologer Membranproteingene ermöglicht, die stabil als Einzelkopien am genomischen PDR5-Locus integriert sind. Die Erstellung vielseitiger Plasmidvektoren und die Optimierung einstufiger Klonierungsstrategien ermöglicht das schnelle und genaue Klonen, die Mutagenese und die Expression heterologer ABC-Transporter. Hier beschreiben wir die Entwicklung und Verwendung eines neuartigen proteasespaltenden mGFPHis-Doppel-Tags (d.h. des monomeren hefeverstärkten grün fluoreszierenden Proteins yEGFP3, das mit einem Sechs-Histidin-Affinitätsreinigungs-Tag verschmolzen ist), das entwickelt wurde, um eine mögliche Interferenz des Tags mit dem interessierenden Protein zu vermeiden und die Bindungseffizienz des His-Tags an Nickelaffinitätsharze zu erhöhen. Die Fusion von mGFPHis mit dem Membranprotein ORF (Open Reading Frame) ermöglicht eine einfache Quantifizierung des Proteins durch Inspektion von Polyacrylamidgelen und Nachweis von Abbauprodukten unter Beibehaltung des mGFPHis-Tags. Wir zeigen, wie diese Funktion das Waschmittel-Screening auf Membranprotein-Solubilisierung erleichtert. Ein Protokoll zur effizienten, schnellen und zuverlässigen Isolierung der kleinräumigen Plasmamembranpräparate des C-terminal markierten Candida albicans Multidrug-Efflux-Transporters Cdr1, überexprimiert in S. cerevisiae ADΔΔ, wird vorgestellt. Dieses kleine Plasmamembran-Isolationsprotokoll erzeugt innerhalb eines einzigen Arbeitstages hochwertige Plasmamembranen. Die Plasmamembranpräparate können verwendet werden, um die Enzymaktivitäten von Cdr1- und Cdr1-Mutantenvarianten zu bestimmen.

Eine hohe Transformationsfrequenz von S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 Transformanten/μg) wurde mit pYES2 erreicht (Abbildung 2B). Wie erwartet, ergab die No-DNA-Kontrolle (d.h. nur ddH2O) keine Transformanten, und 1 μg der linearen CDR1-mGFPHis Transformationskassette (Abbildung 1A) ergab ~ 50 Transformanten (Abbildung 2C) mit dem optimierten ADΔΔ-Transformationsprotokoll. Die ...

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Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.

Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Das kleine Plasmamembranisolationsprotokoll und mGFPHis Double Tag bieten eine wirtschaftliche, schnelle, zuverlässige und einfache Methode zur Charakterisierung von Membranproteinen im eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Der größte Vorteil dieser Technologie ist die Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der die Expressionsniveaus des Membranproteins, die Aktivitäten des ATP und das für ihre Reinigung am besten geeignete Reinigungsmittel bestimmt werden können. Diese Technologie ist sehr benutzerfreundlich.Ein wichtiger Punkt, an den man sich jedoch erinnern sollte, ist die Ernte von Zellen als OD 600 von 2, was eine geringe mitochondriale Kontamination und die höchstmögliche ATPase-Aktivität gewährleistet. Beginnen Sie mit der Vorkultivierung einer einzelnen Hefekolonie in 10 Millilitern YPD-Medium bei 30 Grad Celsius für sieben bis acht Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie 10 Milliliter Vorkultur, um 40 Milliliter frisches YPD-Medium zu impfen.Dann inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius über Nacht mit 200 Umdrehungen pro Minute, bis die Zelldichte einen OD 600 von eins bis drei erreicht. Am nächsten Tag ernten Sie 40 optische Dichteeinheiten (ODU) logarithmischer Gesichtszellen durch Zentrifugieren bei 4.200 mal G pro fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Aufhängen und Waschen von Zellen mit 40 Millilitern eiskaltem sterilem doppelt destilliertem Wasser.Wiederholen Sie das Waschen mit einem Milliliter eiskaltem Wasser mit Zentrifugalisierung zwischen den Waschschritten. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskaltem sterilem Wasser und geben Sie die Zellsuspension in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, das auf Eis vorgekühlt ist. Ernten Sie Zellen bei 3.300 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern Homogenisierungspuffer, frisch ergänzt mit einem millimolaren Fenalmethylsulfa Nealfluorid oder PMSF. Lagern Sie die Zellsuspension bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Tauen Sie die Zellen auf Eis für etwa eine Stunde auf.Dann fügen Sie eiskalte Kieselsäureperlen mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern zu den 500 Mikrolitern der Zellsuspension hinzu, um ein Gesamtvolumen von einem Milliliter zu erreichen. Um die Zellen zu brechen, wirbeln Sie die Zellsuspension bei maximaler Schüttelintensität für eine Minute, für sechs Zyklen, mit einer dreiminütigen Abkühlperiode auf Eis nach jedem Zyklus. Nach dem Wirbeln mit einer beheizten Skalpellklinge ein dünnes Loch am Boden des Rohres machen und das gebrochene Zellhomogenat in einem anderen eiskalten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Spin mit niedriger Geschwindigkeit für 10 Sekunden sammeln.Zentrifugieren Sie das gesammelte Zellhomogenat bei 5.156 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellreste zu entfernen. 450 Mikroliter Überstand in ein eiskaltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und einen Milliliter eiskalten Homogenisierungspuffer hinzufügen, der mit einem Millimolaren frischen PMSF ergänzt wird. Um Plasmamembranen zu ernten, zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 17, 968 mal G für eine Stunde bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu, der frisch mit einem millimolaren PMSF ergänzt wird. Lösen Sie dann das Plasmamembranpellet durch Rühren mit der 100-Mikroliter-Pipettenspitze und suspendieren Sie das Pellet durch wiederholtes Pipettieren nach oben und unten. Messen Sie die Proteinkonzentration der Plasmamembranzubereitung mit einem Protein-Assay-Kit, das mit Puffern kompatibel ist, die das Reduktionsmittel und das Reinigungsmittel enthalten.Lagern Sie die Plasmamembranen bei minus 80 Grad Celsius oder halten Sie sie zur sofortigen Verwendung auf Eis. Gießen Sie vier bis fünf Milliliter Trenngel bis zu zwei Zentimeter von oben in die zusammengesetzte Gelvorrichtung. Legen Sie vorsichtig ein bis zwei Milliliter 0,1% SDS darauf und lassen Sie das Polyacrylamidgel 60 Minuten bei Raumtemperatur einwirken.Nach einer Stunde die 0,1% SDS-Schicht aus dem polymerisierten Trenngel entfernen und das Gel mit doppelt destilliertem Wasser abspülen, um Spuren von SDS zu entfernen. Gießen Sie die Stapelgelmischung auf das Trenngel. Legen Sie einen Kamm in das Stapelgel und entfernen Sie alle Luftblasen um den Kamm herum.Dann lassen Sie das Stapelgel für 60 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Entfernen Sie den Kamm und spülen Sie dann die Gelschlitze mit Wasser ab. Legen Sie das Gel in den Geltank und füllen Sie den Geltank nach oben mit Laufpuffer.Mischen Sie fünf bis 10 Mikroliter Plasmamembranproben mit gleichen Volumina von zweifachem Proteinbeladungsfarbstoff und laden Sie die Probenmischung sofort in einzelne Gelschlitze, die in laufbereiten Puffer getaunken sind. Laden Sie Proteinmolekulargewichtsmarker im Bereich von 10 bis 245 Kilodalton in einen separaten Slot, um die Größenschätzung einzelner Proteinfragmente zu ermöglichen. Führen Sie eine Gelelektrophorese bei 200 Volt durch, bis der blaue Ladefarbstoff den Boden des Gels erreicht.Untersuchen Sie das Gel auf In-Gel-GFP-Fluoreszenz mit einem Gel-Bildgebungssystem. Nach der fluoreszierenden Bildgebung fixieren Proteine in 10 bis 20 Milliliter Proteingel fixierende Lösung durch sanftes Rühren des Gels für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann spülen Sie das Gel zweimal für 10 Minuten für 10 Minuten mit 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser und legen Sie das Gel in 10 Milliliter kolloidale Kumasi-Fleckenlösung mit sanftem Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur, um Proteinbänder zu visualisieren.Zur besseren Visualisierung von Proteinbändern entfärben Sie das Gel ein- bis zweimal in 20 Millilitern doppelt destilliertem Wasser für eine Stunde, bevor Sie Bilder mit dem Gel-Bildgebungssystem aufnehmen. Mit dem Positivkontrollplasmid PS2 wurde eine hohe Transformationsfrequenz von Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta erreicht. Für die Negativkontrolle wurden keine Eurocell Prototron-Transformanten erhalten.Etwa 50 URA-Zell-Prototroph CDR1-mGFPHis-Transformanten wurden nach inkubation transformierter AD Delta Delta-Zellen auf CSM minus URA-Platten für drei Tage erhalten. Petite Transformant, das nicht auf YPG-Agarplatten wachsen kann, wurde eliminiert. CDR1-mGHPHis Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden mit In-Gel-Fluoreszenz quantifiziert.Die mGFP-Fluoreszenzdicken waren linear über den gesamten Konzentrationsbereich mit minimaler Hintergrundfluoreszenz. Die Variation der Zelldichte zeigte, dass das Brechen von 40 ODU von Zellen die höchste Qualität von Plasmamembranen mit der höchsten CDR1-ATPase-Aktivität ergab. Die Ausbeute der Plasmamembranen nahm jedoch proportional zur zunehmenden Zelldichte zu.Die Fähigkeit von 31 Waschmitteln mit verschiedenen Eigenschaften, CDR1-mGHPHis aus rohen Plasmamembranen von AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis Zellen zu solubilisieren, wurde mit SDS-Seite getestet. Beta und Alpha DDM und Fos-Cholin 13 waren die besten Reinigungsmittel, um CDR1-mGHPHis zu solubilisieren. Fos-Cholin 13 verursacht jedoch eine partielle Hydrolyse von CDR1-mGHPHis.Rohes Plasmamembranprotein, das mit 1% Reinigungsmittel solubilisiert wurde, wurde mit einer Superos six erhöhten 10 300 GL Größenausschlusssäule getrennt. Chromatogramme von Maltosiden und LMNG-extrahierten Proteinen zeigten, dass die meisten CDR1-mGHPHis als schön geformter Gauß-Peak bei 15,5 Millimetern CDR1-mGHPHis mit glukosehaltigen Reinigungsmitteln gelöst wurden, die als aggregierter oder breiter aggregierter Peak angespielt wurden. Die höheren Peaks für DDM deuteten darauf hin, dass ein großer Teil der dmN G-gelösten CDR1-mGHPHis denaturiert sein kann.In den FSCC-Chromatogrammen für zwitterionische Fos-Choline und zwei nichtionische Reinigungsmittel nur Digitonin und gab ein ähnliches Chromatogramm wie DDM. Fos-Cholin 13 ergab einen symmetrischen, scharf geformten Peak, spielte aber auf ein deutlich geringeres Elutionsvolumen an als das für DDM. Der optimierte Doppel-Tag verbessert auch die Reinigungsausbeute und half bei der Bestimmung der Lokalisation, des Transports und der thermischen Stabilität von Membranproteinen.Die heterologe Expressionstechnologie kann auch im Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und bei der detaillierten Charakterisierung vieler anderer Membranproteine eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Forschung

Biologie

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

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Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

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Neuartige Herstellungsprotokoll für die Klein Herstellung von Probiotische fermentierte Lebensmittel

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Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

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Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

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Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis

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Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans: Eine umfassende CUT&amp;RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...