Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

המחברים מודים במימון מקרן מרסדן בניו זילנד (Grant UOO1305), ומענק בלוק מהפקולטה לרפואה, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן, בנגקוק, תאילנד (M. Niimi). הם מבקשים להודות לאוניברסיטת אוטגו על שהעניקה לג' מדאני מלגת דוקטורט. המחברים מבקשים גם להביע את תודתם לפרופסור סטפן ראונסר ועמיתיו, ד"ר אמיר אפלבאום, וד"ר דיבאנאיאגבארתי ויניאגאם, על תמיכתם ופיקוחם במהלך ביקור בן 6 חודשים של ג' מדאני במכון מקס פלנק לפיזיולוגיה מולקולרית (MPIMP), דורטמונד, גרמניה. המחברים מודים גם לשירות חילופי האקדמיה הגרמנית (DAAD) על כך שהעניק לג'י מדאני מענק מחקר (57381332) לביקור ב- MPIMP.

1. הכנת מלאי טרי או קפוא של תאי ADΔ ו- ADΔΔ
<ol><li>לחסן 25 מ"ל של 2x YPCD [כלומר, 2x YPD; 2% (w/v) תמצית שמרים, 2% (w/v) פפטון, 4% (w/v) דקסטרוז), 0.079 % (w/v) CSM (תערובת תוספת מלאה)]35 בינוני עם מושבת שמרים אחת ודגרה לילה (o/n) עבור 16 שעות ב 30 °C עם רועד ב 200 מהפכות לדקה (סל"ד).</li>
	<li>לחסן 225 מ"ל של 2x YPCD בינוני עם 25 מ"ל o / n ת...

למרות ההתקדמות האחרונה בניתוח המבני של חלבוני ממברנה, אין מבנה תלת-ממדי עבור Cdr1, או כל טרנספורטר PDR אחר, זמין כעת. לכן, רכישת ידע על מבנה Cdr1 ואת התכונות הביוכימיות שלה חשוב, כמו זה לא רק לספק תובנה על עיצוב רציונלי של תרופות חדשניות כדי להתגבר על עמידות לתרופות בתיווך שפכים, אלא גם לתוך מנגנון...

מיצוי חלבונים ממברנה אינטגרליים מסביבת השומנים הטבעית שלהם יכול להשפיע באופן דרמטי על המבנה שלהםותפקוד 1,2,3,4. הרכב השומנים המורכב של ממברנות ביולוגיות5 מבטיח כי אינטראקציות חלבון-שומנים חשובות באופן קריטי יכול להתרחש6. שומנים שומרים על השלמות המבנית של חלבוני הממברנה, ובכך מאפשרים להם לתפקד כראוי ביעד תא הממברנהשלהם(ים) 7,8. לכן, צעד ראשון קריטי בטיהור חלבון הממברנה הוא הפקת החלבון מסביבתו הטבעית מבלי להשפיע על המבנה ו/או תפקודו.
ישנם מכשולים רבים לאפיון המבנה של חלבוני הממברנה, שרובם קשורים לאופי ההידרופובי שלהם, ואת הקשיים של ביטוי חלבוני ממברנה מקופלים כראוי פונקציונלי בכמויות הנדרשות קריסטלוגרפיה רנטגן או מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM)9,10,11,12. ישנם שלושה סוגים של מערכות ביטוי חלבון ממברנה: הומולוג9, הטרולוגי13,14,15,ומערכות ביטוי במבחנה 16,17. רמות הביטוי הנמוכות לעתים קרובות, או העלויות האסורות, של מערכות ביטוי רבות משאירות רק פונדקאים מעטים כאפשרות המועדפת לייצר חלבוני ממברנה. הם כוללים את המארח החיידקי, Escherichia coli, שמרים S. cerevisiae ו Pichia פסטוריס, ו eukaryotes גבוה יותר כגון תאי חרק Sf9 או קווי תאים יונקים18. לכל טכנולוגיות ביטוי חלבון הממברנה יש יתרונות וחסרונות; עם זאת, S. cerevisiae הוא אולי האורגניזם המודל האוקריוטי הנחקר הטוב ביותר המתאים לייצור חלבון ממברנה. זה מאוד תכליתי עם יישומים בהנדסה גנטית, גילוי סמים, ביולוגיה סינתטית, ואת הביטוי של חלבונים ממברנה eukaryotic14,19,20,21.
במחקר זה, פטנט S. cerevisiae קרום ביטוי טכנולוגיית ביטוי21 שימש, עם S. cerevisiae ADΔ14 ו ADΔΔ22 כמו המארחים המועדפים (איור 1A), כדי להדגיש יתר על המידה וללמוד את משאבת efflux רב-תכליתי C. albicans הגדולה Cdr1. שני זני S. cerevisiae הם נגזרות של AD1-8u- 23 שיש להם גם את ura3 (ADΔ) או שניהם ura3 ו שלו1 (ADΔΔ) גנים שנמחקו כדי לחסל כל uracil חיובי שווא או פרוטוטרופים פרוטוטרופים הנובעים דרך שילוב לא רצוי ב URA3 או LOCI הגנומי HIS1. מחיקת 7 משאבות השפכים הרב-תכליתיות העיקריות23, המצוינות באיור 1A, הופכת את ADΔΔ לרגיש להפליא לרוב הקסנוביוטיים. גורם התמלול המוטנטי של הרווח-של-פונקציה Pdr1-3 גורם לביטוי יתר מהווה של חלבוני קרום הטרולוגיים כגון Cdr1 (מתומנים אדומים באיור 1A)לאחר שילוב של קלטת הטרנספורמציה ההטרולוגית-ORF המכילה (איור 1A) בלוקוס PDR5 הגנומי (מלבן כחול באיור 1A)באמצעות שני אירועי רקומבינציה הומולוגית. לוקליזציה נכונה של קרום פלזמה של חלבונים מתויגים C-סופניHis ניתן לאשר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1A), ואת התג שלו יכול לשמש לטיהור ניקל-זיקה של החלבון המתויג. שיבוט כמה מובילי ABC פטרייתיים (למשל, קנדידה krusei ABC1)לתוך pABC3 נגזר plasmids היה, עם זאת, לא אפשרי כי הם לא יכלו להיות מופצים Escherichia קולי בשל רעילות התא. זה הניע את הפיתוח של שיבוט שלב אחד של חלבוני ממברנה14,24 מתויגים ב- N שלהם או C-terminus עם זיקה שונים, אפיטופה, או תגי כתב ישירות לתוך S. cerevisiae ADΔΔ (איור 1C). ס. סרביסיה זני ADΔ מגזים בביטוי יתר של מוטציות CDR1 שונות יכולים גם להיווצר ביעילות בדרך זו באמצעות עד חמישה שברי PCR בודדים החופפים ב- 25 bp (איור 1C). באמצעות פרוטוקול זה, ORFs רבים של עניין ניתן לשכפל, להביע, ומאופיין בעלות נמוכה וביעילות גבוהה בתוך פרק זמן קצר מאוד. יעילות הטרנספורמציה מפחיתה פי 2 בלבד עם כל שבר PCR נוסף.
אם תרצה, ניתן גם לטפל ברמות הביטוי בקלות על-ידי עיצוב פריימר כדי לכוונן את רמות הביטוי כצפוי עד לכל מקום בין 0.1%-50% מרמות הביטוי הגבוהות בדרך כלל25. וקטור השיבוט הנגזר pABC314 הממוטב, pABC3-XLmGFPHis26 (איור 1B) מכיל אתר מחשוף פרוטאז HRV-3C (X; לוולפק| GP), פרוטאז שמבצע טוב יותר ב 4 °C (55 °F) מאשר וירוס תחריט טבק בשימוש תכוף (TEV) פרוטאז27. L הוא מקשר חמש חומצות אמינו (GSGGS), mGFP הוא מוטציה מונומרית (A206K)28,29 גרסה של שמרים משופר ירוק פלואורסצנטי חלבון yEGFP330, שלו הוא שלוש חומצות אמינו מקשר (GGS) ואחריו שישה היסטידין (HHHHHH) ניקל-זיקה חלבון תג.
טכנולוגיית ביטוי זו שימשה בהצלחה בגילוי תרופות ובחקר חלבוני ממברנה. המבנה הראשון עבור יעד תרופה אזול פטרייתי, S. cerevisiae Erg1131, נפתר באמצעות טכנולוגיה זו. זה גם איפשר את האפיון המפורט של C. albicans Cdr132,33,34 ויצירת מולקולת Cdr1 חסר ציסטאין35 מתאים מחקרים ציסטאין crosslinking כדי לאמת כל מבנה ברזולוציה גבוהה בעתיד. מובילים רבים אחרים של ABC מפתוגנים פטרייתיים אנושיים גדולים (כלומר, C. albicans, קנדידה גלברטה, קנדידה אאוריס, קנדידה קרוסיי, קנדידה אוטיליס, קריפטוקוקוס ניאופורמנים, אספרגילוס פומיגאטוס, פניציליום מרנפי ומתחם המינים פוסאריום סולני) נחקרו גם הם בפירוט באמצעות פלטפורמת ביטוי זו24,36,37,38,39. זה איפשר את הדור של פאנל של זני S. cerevisiae overexpressing משאבות שפכים ששימשו במסכי תפוקה גבוהה כדי לגלות את מצע משאבת השפכים הפלואורסצנטית החדשה40 ו41 ספציפית ורחבת טווח14,33,42,43,44 מעכבי משאבת שפכים. השימוש במערכת זו איפשר גם את גילוי קלורגילין כראשון מסוגו מעכב משאבת שפכים רב-תכליתית רב-תכליתית42.
סולוביליזציה מלאה של חלבונים ממברנה ויצירת קרום הומוגני חלבון-micelle הכנה נטולת שומנים אנדוגניים, דורש ריכוזי דטרגנט גבוהים45. אבל למרבה הצער, זה גם לעתים קרובות מנטרל את חלבון הממברנה5,8,45,46. המאפיינים של מונומרים דטרגנט וצבירה שלהם בפתרון מושפעים המאפיינים הפיזיים של הזנב ההידרופובי, האורך והסתעפות של שרשרת אלקיל, נוכחות של גרעין ארומטי או שרשרת צד פלואורואלקיל, או מספר יחידות פוליאוקסיאתילן. לכן, הקרנת דטרגנט היא צעד ראשון חשוב כדי לקבוע את חומר הניקוי המתאים ביותר עבור solubilization חלבון ממברנה וטיהור.
C. albicans הוא פתוגן פטרייתי אנושי גדול של אנשים אימונוקום כי יכול לגרום לזיהומים חמורים, סכנת חיים פולשניות47, וזה יכול להיות עמיד בפני תרופות נגד פטריות אזול48,49. אחד המנגנונים העיקריים של התנגדות multidrug C. albicans הוא ביטוי יתר של Cdr150, שהוא סוג II ATP מחייב טרנספורטר (ABC) טרנספורטר51 של ABCG subfamily הממוקם בקרום הפלזמה. מובילי ABCG פטרייתיים בגודל מלא (המורכבים משני תחומים מחייבים נוקלאוטידים [NBDs] ושני תחומים טרנס-מברניים [TMDs]) ידועים יותר בשם מובילי התנגדות לתרופות פליוטרופיות (PDR) ומאופיינים בטופולוגיית הדומיין ההפוכה הייחודית שלהם [NBD-TMD]2. מובילי PDR נמצאים רק בצמחים52,53 ופטריות54. למרות חשיבותם, אין מבנים עבור מובילי PDR, אם כי מבנים עבור מובילי ABCG בגודל חצי אדם נפתרו לאחרונה אשר סייע ליצור את המודל ההססני הראשון עבור Cdr133. הראיות הניסיוניות האחרונות שלנו מצביעות, עם זאת, כי מודל זה פגום אולי בגלל מובילי PDR פטרייתי יש NBDs אסימטרי אופייני וכתוצאה מכך ייתכן מאוד במנגנון תחבורה ייחודי. מבנה ברזולוציה גבוהה של Cdr1 נדרש, אם כן, הן עבור העיצוב הרציונלי של מעכבי משאבת שפכים חדשניים שעשויים לסייע להתגבר על עמידות לתרופות בתיווך שפכים, והן כדי לספק תובנות על מנגנון הפעולה של משפחת טרנספורטר חשובה זו של ABC.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח פרוטוקולים אמינים לביטוי, סולוביליזציה וטיהור של Cdr1 במארח הביטוי S. cerevisiae מהונדס גנטית, במטרה הסופית להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה עבור Cdr1. כחלק מתהליך זה, תג כפול mGFPHis באורך פרוטאז (איור 1B) תוכנן עם מקשר של 16 שאריות המפריד בין התג לבין מסוף C של Cdr1, אשר שיפר את הכריכה של תג הזיקה שלו 6x המצורף לשרף זיקת ניקל ואיפשר ניטור של רמות הביטוי Cdr1 בתאים חיים ובמהלך כל תהליך הטיהור. פרוטוקול לשחזור עבור תכשירי חלבון פלזמה שמרים בקנה מידה קטן המכיל כ 10% C. albicans Cdr1 (כפי שהוערך על ידי כתמי Coomassie לאחר SDS-PAGE) פותח גם, אשר יכול לשמש לאפיון הביוכימי של Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

האפיון הביוכימי והביופיסי המוצלח של מובילי ABC תלוי במידה רבה בבחירת מערכת הביטוי ההטרולוגית. במהלך שני העשורים האחרונים, פיתחנו פלטפורמת ביטוי חלבון קרום שמרים ששימשה לחקר חלבונים רבים חשובים ממברנה פטרייתית. מארח הביטוי Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ נמחק בשבעה מובילי ABC אנדוגניים עיקריים והוא מכיל את גורם התמלול Pdr1-3 עם מוטציה רווח-של-פונקציה המאפשרת ביטוי יתר המרכיב של גנים חלבון ממברנה הטרולוגית משולבים ביציבות כעותקים בודדים על locus PDR5 הגנומי. יצירת וקטורים פלסמידים רב-תכליתיים ואופטימיזציה של אסטרטגיות שיבוט של שלב אחד מאפשרים שיבוט מהיר ומדויק, מוטגנזה וביטוי של מובילי ABC הטרולוגיים. כאן, אנו מתארים את הפיתוח והשימוש בתג כפול mGFPHis חדשני הניתן למחשוף פרוטאז (כלומר, שמרים מונומריים משופרים חלבון פלואורסצנטי ירוק yEGFP3 התמזגו לתג טיהור זיקה של שישה היסטידין) שנועד למנוע הפרעה אפשרית של התג עם חלבון העניין ולהגדיל את היעילות המחייבת של התג שלו לשרף זיקה ניקל. ההיתוך של mGFPHis לחלבון הממברנה ORF (מסגרת קריאה פתוחה) מאפשר כימות קל של החלבון על ידי בדיקה של ג'לים polyacrylamide וזיהוי של מוצרי השפלה שמירה על תג mGFPHis. אנו מדגימים כיצד תכונה זו מאפשרת הקרנת דטרגנט עבור solubilization חלבון ממברנה. פרוטוקול לבידוד יעיל, מהיר ואמין של תכשירי קרום הפלזמה בקנה מידה קטן של C-סופני קנדידה albicans רב-דראג שיגור efflux Cdr1 overexpressed ב S. cerevisiae ADΔΔ, מוצג. פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן זה מייצר ממברנות פלזמה באיכות גבוהה בתוך יום עבודה אחד. תכשירי קרום הפלזמה יכולים לשמש כדי לקבוע את פעילות האנזים של Cdr1 ו- Cdr1 וריאנטים מוטנטיים.

תדירות גבוהה של טרנספורמציה של S. cerevisiae ADΔΔ (~ 4 x 104 טרנספורמטורים / מיקרוגרם) הושגה עם pYES2 (איור 2B). כצפוי, בקרת השינוי ללא DNA (כלומר, ddH2O בלבד) לא נתנה טרנספורמטורים, ו- 1 מיקרוגרם של קלטת הטרנספורמציה הליניארית של CDR1-mGFPHis (איור 1A) העניקה ~ ...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן mGFPHis תג כפול, לספק שיטה חסכונית, מהירה, אמינה, וקל לאפיין חלבונים ממברנה באורגניזם מודל אאוקריוטי, Saccharomyces cerevisiae. היתרון הגדול ביותר של טכנולוגיה זו הוא הקלות והמהירות שבהן ניתן לקבוע את רמות ביטוי החלבון הממברנה, את פעילות ה- ATP ואת חומר הניקוי המתאים ביותר לטיהור שלהם. טכנולוגיה זו ידידותית מאוד למשתמש.עם זאת, נקודה חשובה אחת לזכור היא לקצור תאים כמו OD 600 של 2, אשר מבטיח זיהום מיטוכונדריאלי נמוך ואת הפעילויות ATPase הגבוה ביותר האפשרי. התחל על ידי טרום פולחן מושבת שמרים אחת ב 10 מיליליטר של YPD בינוני ב 30 מעלות צלזיוס במשך שבע עד שמונה שעות ב 200 סיבובים לדקה. השתמש 10 מיליליטר של תרבות מראש כדי לחסן 40 מיליליטר של מדיום YPD טרי.ואז לדגור על התאים ב 30 מעלות צלזיוס לילה ב 200 סיבובים לדקה עד צפיפות התא מגיע OD 600 של אחד עד שלושה. ביום שלמחרת קציר 40 יחידות צפיפות אופטית, או ODU, של תאי פנים לוגריתמיים על ידי צנטריפוגה ב 4, 200 פעמים G לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשעות ולשטוף תאים עם 40 מיליליטר של מים סטריליים קרים כקרח מזוקקים כפולים.חזור על הכביסה באמצעות מיליליטר אחד של מים קרים כקרח עם צנטריפוגליזציה בין שלבי הכביסה. להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מים סטריליים קרים כקרח ולהעביר את השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר מקורר מראש על קרח. תאי קציר ב 3, 300 פעמים G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס.שאפו את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה התא ב 500 microliters של חוצץ הומוגניזציה טרי בתוספת אחד מילימולר פנאל מתיל סולפה ניל פלואוריד, או PMSF. יש לאחסן את מתלה התא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. להפשיר את התאים על קרח במשך כשעה אחת.לאחר מכן להוסיף קר כקרח 0.5 מילימטר קוטר חרוזים סיליקה 500 microliters של השעיית התא כדי להגיע לנפח כולל של מיליליטר אחד. כדי לשבור את התאים, מערבולת את השעיית התא בעוצמה רועדת מקסימלית במשך דקה אחת, במשך שישה מחזורים, עם תקופת קירור של שלוש דקות על קרח לאחר כל מחזור. לאחר מערבולת, לעשות חור דק בתחתית הצינור עם להב אזמל מחומם ולאסוף את התא השבור הומוגנט לתוך עוד צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר מיקרו עם ספין במהירות נמוכה במשך 10 שניות.צנטריפוגה התא שנאסף הומוגנט ב 5, 156 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים. העבר 450 מיקרוליטרים של supernatant לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר קר כקרח ולהוסיף מיליליטר אחד של חוצץ הומוגניזציה קר כקרח בתוספת PMSF טרי מילימולר אחד. כדי לקצור קרום פלזמה צנטריפוגה השעיית התא ב 17, 968 פעמים G במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ולהוסיף 100 microliters של חוצץ הומוגניזציה טרי בתוספת PMSF מילימולרי אחד. ואז לשחרר את גלולה קרום פלזמה על ידי ערבוב עם קצה פיפטה 100 microliter ולהשעות מחדש את הכדור על ידי צינור חוזר למעלה ולמטה. מדוד את ריכוז החלבון של הכנת קרום הפלזמה עם ערכת בדיקת חלבון התואמת למאגרים המכילים את חומר ההפחתה וחומר הניקוי.לאחסן את ממברנות הפלזמה במינוס 80 מעלות צלזיוס, או לשמור אותם על קרח לשימוש מיידי. יוצקים ארבעה עד חמישה מיליליטר של ג'ל הפרדה לתוך מנגנון הג'ל המורכב עד שני סנטימטרים מלמעלה. שכבה בזהירות אחת עד שתי מיליליטר של 0.1%SDS על גבי ולאפשר ג'ל אקרילאמיד פולי להגדיר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר שעה להסיר את שכבת 0.1%SDS מן ג'ל הפרדה פולימרית ולשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים כפולים כדי להסיר עקבות של SDS. יוצקים את תערובת ג'ל הערימה על ג'ל ההפרדה. מניחים מסרק לתוך ג'ל הערימה ולהסיר את כל בועות האוויר מסביב מסרק.לאחר מכן אפשר ג'ל לערום להגדיר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המסרק ולאחר מכן לשטוף את חריצי ג'ל עם מים. שים את הג'ל לתוך מיכל הג'ל ולמלא את מיכל הג'ל למעלה עם חוצץ פועל.מערבבים בין 5 ל-10 מיקרוליטרים של דגימות קרום פלזמה בנפחים שווים של פי שניים צבע טעינת חלבונים ומיד מעמיסים את תערובת הדגימה לחריצי ג'ל בודדים, שקועים במאגר ריצה. טען סמני משקל מולקולריים של חלבון בטווח שבין 10 ל-245 קילודלטון לחריץ נפרד כדי לאפשר הערכת גודל של שברי חלבון בודדים. בצע אלקטרופורזה ג'ל ב 200 וולט עד צבע הטעינה הכחול מגיע לתחתית הג'ל.בדוק את הג'ל עבור פלואורסצנטיות GFP in-gel עם מערכת הדמיה ג'ל. בעקבות הדמיה פלואורסצנטית לתקן חלבונים ב 10 עד 20 מיליליטר של פתרון תיקון ג'ל חלבון על ידי עצבנות עדינה של הג'ל במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את פעמיים במשך 10 דקות עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ומניחים את הג'ל ב 10 מיליליטר של פתרון כתם קומסי קולואידי עם רועד עדין במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לדמיין רצועות חלבון.להדמיה משופרת של רצועות חלבון, יש להכתים את הג'ל פעם או פעמיים ב-20 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים למשך שעה אחת לפני הקלטת תמונות עם מערכת הדמיית הג'ל. תדירות גבוהה של טרנספורמציה של Saccharomyces cerevisiae דלתא דלתא D הושגה עם שליטה חיובית plasmid PS2. לא הושגו טרנספורמטים של יורוסל פרוטרונים עבור השליטה השלילית.כ-50 תאי URA פרוטוטרופים CDR1-mGFPHis transformant הושגו לאחר הדגירה של תאי דלתא של דלתא של AD שעברו טרנספורמציה ב-CSM פחות לוחות URA במשך שלושה ימים. טרנספורמטנט קטן שלא יכול לגדול על לוחות אגר YPG בוטלו. דגימות CDR1-mGHPHis בריכוזים שונים היו כימותו עם פלואורסצנטיות בג'ל.עוצמות הפלואורסצנטיות של mGFP היו ליניאריות לאורך כל טווח הריכוז עם פלואורסצנטיות רקע מינימלית. שינוי צפיפות התאים הצביע על כך שבירת 40 ODU של תאים הניבה את האיכות הגבוהה ביותר של קרום פלזמה עם פעילות ATPase CDR1 הגבוהה ביותר. עם זאת, התשואה של קרום הפלזמה גדלה ביחס להגדלת צפיפות התאים.היכולת של 31 חומרי ניקוי עם תכונות שונות כדי solubilize CDR1-mGHPHis ממברנות פלזמה גולמית של דלתא AD דלתא, CDR1-mGHPHis תאים נבדקו עם דף SDS. בטא ואלפא DDM ופוס-כולין 13 היו חומרי הניקוי הטובים ביותר כדי solubilize CDR1-mGHPHis. עם זאת, פוס-כולין 13 לגרום הידרוליזה חלקית של CDR1-mGHPHis.חלבון קרום פלזמה גולמי solubilized עם 1%דטרגנט הופרד באמצעות superos שש גדל 10 300 GL גודל אי הכללה עמודה. כרומטוגרמה של מלטוזידים וחלבונים המופקים על ידי LMNG הראו שרוב CDR1-mGHPHis חמקו כשיא גאוסי בצורת יפה ב 15.5 מילימטר CDR1-mGHPHis solubilized עם גלוקוז המכיל חומרי ניקוי נרמז כמו פסגה מצטברת או רחבה. הפסגות הגבוהות יותר עבור DDM הצביעו על כך שחלק גדול של DMN G solubilized CDR1-mGHPHis עשוי להיות denatured.בכרומטוגרמה FSCC עבור zwitterionic Fos-כולינים ושני חומרי ניקוי לא יוניים רק Digitonin ונתן כרומטוגרמה דומה ל- DDM. Fos-choline 13 נתן שיא בצורת חד סימטרית, אבל זה רמז עם נפח חמקמקה נמוך משמעותית מזה עבור DDM. התג הכפול הממוטב גם משפר את תפוקת הטיהור ועזר לקבוע את הלוקליזציה, הסחר והיציבות התרמית של חלבוני הממברנה.טכנולוגיית הביטוי ההטרולוגית יכולה לשמש גם בהקרנת סמים בתפוקה גבוהה, ובאפיון מפורט של חלבונים רבים אחרים.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

פרוטוקול הפקה חדשנית לייצור בקנה מידה קטן של מזונות מותססים פרוביוטיים

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

הכנת הדוגמא מסה ספקטרומטר מבוססת על ניתוח פרוטאומיקס של עינית Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

פרופיל כלל-גנומי של אינטראקציות קשירה בין גורמי שעתוק לדנ"א בקנדידה אלביקנס: שיטת CUT&amp;RUN מקיפה וזרימת עבודה של ניתוח נתונים

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...