Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento del New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305) e una sovvenzione di blocco dalla Facoltà di Medicina, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailandia (M. Niimi). Desiderano ringraziare l'Università di Otago per aver fornito a G. Madani una borsa di studio di dottorato. Gli autori desiderano anche esprimere la loro gratitudine al professor Stefan Raunser e ai suoi colleghi, il dottor Amir Apelbaum e il dottor Deivanayagabarathy Vinayagam, per il loro supporto e supervisione durante una visita di 6 mesi di G. Madani presso il Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Germania. Gli autori ringraziano anche il German Academic Exchange Service (DAAD) per aver fornito a G. Madani una borsa di ricerca (57381332) per visitare l'MPIMP.

1. Preparazione di scorte fresche o congelate di celle ADΔ e ADΔΔ competenti per la trasformazione
<ol><li>Inoculare 25 mL di 2x YPCD [cioè 2x YPD; 2% (p/v) estratto di lievito, 2% (p/v) peptone, 4% (p/v) destrosio), 0,079% (p/v) CSM (miscela completa di integratori)]35 medium con una singola colonia di lievito e incubare durante la notte (o/n) per 16 ore a 30 °C con agitazione a 200 giri al minuto (rpm).</li>
	<li>Inoculare 225 mL di 2x mezzo YPCD con la coltura o/n da 25 mL e controllare ...

Nonostante i recenti progressi nell'analisi strutturale delle proteine di membrana, non è attualmente disponibile alcuna struttura 3D per Cdr1 o qualsiasi altro trasportatore PDR. Quindi, acquisire conoscenza della struttura Cdr1 e delle sue caratteristiche biochimiche è importante, in quanto ciò non solo fornirà informazioni sulla progettazione razionale di nuovi farmaci per superare la resistenza ai farmaci mediata dall'efflusso, ma anche sul meccanismo di funzione di un'importante sottofamiglia di proteine ABC.</p...

L'estrazione di proteine di membrana integrali dal loro ambiente lipidico nativo può influenzare notevolmente la loro struttura e funzione1,2,3,4. La complessa composizione lipidica delle membrane biologiche5 assicura che possano verificarsi interazioni proteina-lipidi di importanza critica6. I lipidi mantengono l'integrità strutturale delle proteine di membrana, consentendo loro di funzionare correttamente nelle loro destinazioni del compartimento di membrana7,8. Pertanto, un primo passo fondamentale nella purificazione delle proteine di membrana è l'estrazione della proteina dal suo ambiente nativo senza influenzarne la struttura e / o la funzione.
Ci sono molti ostacoli alla caratterizzazione della struttura delle proteine di membrana, la maggior parte delle quali sono legate alla loro natura idrofoba, e alle difficoltà di esprimere proteine di membrana correttamente piegate e funzionali nelle quantità richieste per la cristallografia a raggi X o la crio-microscopia elettronica (crio-EM)9,10,11,12. Esistono tre tipi di sistemi di espressione proteica di membrana:omologhi 9,eterologhi13,14,15e sistemi di espressione in vitro 16,17. I livelli di espressione spesso bassi, o i costi proibitivi, di molti sistemi di espressione lasciano solo pochi ospiti come opzione preferita per produrre proteine di membrana. Includono l'ospite batterico, Escherichia coli, i lieviti S. cerevisiae e Pichia pastorise eucarioti superiori come le cellule di insetti Sf9 o le linee cellulari di mammiferi18. Tutte le tecnologie di espressione proteica di membrana presentano vantaggi e svantaggi; tuttavia, S. cerevisiae è forse l'organismo modello eucariotico meglio studiato adatto alla produzione di proteine di membrana. È altamente versatile con applicazioni in ingegneria genetica, scoperta di farmaci, biologia sintetica ed espressione delle proteine di membrana eucariotiche14,19,20,21.
In questo studio, è stata utilizzata una tecnologia brevettata di espressione proteica di membrana S. cerevisiae 21, con S. cerevisiae ADΔ14 e ADΔΔ22 come ospiti preferiti (Figura 1A), per sovraesprimere e studiare la principale pompa di efflusso multifarmaco Cdr1 di C. albicans. Entrambi i ceppi di S. cerevisiae sono derivati di AD1-8u- 23 che hanno i geni ura3 (ADΔ) o entrambi i geni ura3 e his1 (ADΔΔ) cancellati per eliminare eventuali falsi positivi uracile o prototrofio istidina trasformanti derivanti dall'integrazione indesiderata nei loci genomici URA3 o HIS1. La delezione delle 7 principali pompe di efflusso multifarmaco23, indicate nella Figura 1A, rende ADΔΔ squisitamente sensibile alla maggior parte degli xenobiotici. Il fattore di trascrizione mutante gain-of-function Pdr1-3 provoca la sovraespressione costitutiva di proteine di membrana eterologhe come Cdr1 (ottagoni rossi in Figura 1A)dopo l'integrazione della cassetta di trasformazione eterologa-contenente ORF (Figura 1A) nel locus genomico PDR5 (rettangolo blu in Figura 1A) tramite due eventi di ricombinazione omologhi. La corretta localizzazione della membrana plasmatica delle proteine marcate con mGFPHis C-terminale può essere confermata mediante microscopia confocale (Figura 1A) e il tag His può essere utilizzato per la purificazione dell'affinità al nichel della proteina marcata. La clonazione di alcuni trasportatori abc fungini (ad esempio, Candida krusei ABC1) in plasmidi derivati da pABC3 non era, tuttavia, possibile perché non potevano essere propagati in Escherichia coli a causa della tossicità cellulare. Ciò ha spinto lo sviluppo della clonazione in un'unica fase delle proteine di membrana14,24 etichettate al loro N- o C-terminus con vari tag di affinità, epitopo o reporter direttamente in S. cerevisiae ADΔΔ (Figura 1C). S. cerevisiae I ceppi ADΔΔ che sovraesprimono vari mutanti CDR1 possono anche essere creati in modo efficiente in questo modo utilizzando fino a cinque singoli frammenti di PCR che si sovrappongono di 25 bp (Figura 1C). Utilizzando questo protocollo, molti ORF di interesse possono essere clonati, espressi e caratterizzati a basso costo e ad alta efficienza in un arco di tempo molto breve. L'efficienza di trasformazione riduce solo di circa 2 volte ogni frammento pcr aggiuntivo.
Se lo si desidera, i livelli di espressione possono anche essere facilmente manipolati dal design del primer per ottimizzare prevedibilmente i livelli di espressione fino a un punto compreso tra lo 0,1% e il 50% dei livelli di espressione costitutiva solitamente elevati25. Il vettore di clonazione derivato pABC314 ottimizzato e multifunzionale, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contiene un sito di scissione della proteasi HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), una proteasi che si comporta meglio a 4 °C rispetto alla proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEV) frequentemente utilizzata27. L è un linker a cinque aminoacidi (GSGGS), mGFP è un mutante monomerico (A206K)28,29 versione della variante proteica a fluorescenza verde potenziata dal lievito yEGFP330e His è un linker di tre aminoacidi (GGS) seguito dal tag di purificazione della proteina a sei istidine (HHHHHH).
Questa tecnologia di espressione è stata utilizzata con successo nella scoperta di farmaci e nello studio delle proteine di membrana. La prima struttura per un bersaglio farmacologico azolico fungino, S. cerevisiae Erg1131, è stata risolta utilizzando questa tecnologia. Ha inoltre permesso la caratterizzazione dettagliata di C. albicans Cdr132,33,34 e la creazione di una molecola Cdr135 carente di cisteina adatta per studi di reticolazione della cisteina per verificare qualsiasi futura struttura ad alta risoluzione. Molti altri trasportatori ABC dai principali patogeni fungini umani (ad es. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei e il complesso di specie Fusarium solani) sono stati studiati in dettaglio utilizzando questa piattaforma di espressione24,36,37,38,39. Ciò ha permesso la generazione di un pannello di filtri S. cerevisiae che sovraesprimono pompe di efflusso che è stato utilizzato in schermi ad alto rendimento per scoprire il nuovo substrato della pompa di efflusso fluorescente rosso Nilo40 e specifico41 e ad ampio spettro14,33,42,43,44 inibitori della pompa di efflusso. L'uso di questo sistema ha anche permesso la scoperta della clorgilina come il primo inibitore della pompa di efflusso multifarmaco fungino ad ampio spettro ad ampio spettro42.
La completa solubilizzazione delle proteine di membrana e la creazione di una preparazione omogenea di membrana proteina-micelle priva di lipidi endogeni, richiede elevate concentrazioni di detergente45. Ma sfortunatamente, questo spesso inattiva anche la proteina di membrana5,8,45,46. Le proprietà dei monomeri detergenti e la loro aggregazione in soluzione sono influenzate dalle proprietà fisiche della coda idrofoba, dalla lunghezza e dalla ramificazione della catena alchilica, dalla presenza di un nucleo aromatico o di una catena laterale fluoroalchilica o dal numero di unità di poliossietilene. Pertanto, lo screening del detergente è un primo passo importante per determinare il detergente più adatto per la solubilizzazione e la purificazione delle proteine di membrana.
C. albicans è un importante patogeno fungino umano di individui immunocompromessi che può causare infezioni invasive gravi e potenzialmente letali47e può diventare resistente ai farmaci antifungini azolici48,49. Uno dei principali meccanismi di resistenza multifarmaco di C. albicans è la sovraespressione di Cdr150, che è un trasportatore di cassette (ABC) di tipo II APdella sottofamiglia ABCG situato nella membrana plasmatica. I trasportatori ABCG fungini a grandezza naturale (costituiti da due domini di legame nucleotidico [NBD] e due domini transmembrana [TMD]) sono più comunemente noti come trasportatori di resistenza ai farmaci pleiotropici (PDR) e sono caratterizzati dalla loro unica topologia di dominio invertito [NBD-TMD]2. I trasportatori PDR si trovano solo nelle piante52,53 e nei funghi54. Nonostante la loro importanza, non ci sono strutture per i trasportatori PDR, anche se le strutture per i trasportatori ABCG a mezza dimensione umana sono state recentemente risolte che hanno contribuito a creare il primo modello provvisorio per Cdr133. Le nostre recenti prove sperimentali suggeriscono, tuttavia, che questo modello è difettoso probabilmente perché i trasportatori PDR fungini hanno caratteristiche NBD asimmetriche che risultano molto probabilmente in un meccanismo di trasporto unico. Una struttura ad alta risoluzione di Cdr1 è, quindi, necessaria sia per la progettazione razionale di nuovi inibitori della pompa di efflusso che possono aiutare a superare la resistenza ai farmaci mediata dall'efflusso, sia per fornire informazioni sul meccanismo d'azione di questa importante famiglia di trasportatori ABC.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare protocolli affidabili per l'espressione, la solubilizzazione e la purificazione di Cdr1 nell'ospite di espressione geneticamente modificato di S. cerevisiae, con l'obiettivo finale di ottenere una struttura ad alta risoluzione per Cdr1. Come parte di questo processo, è stato progettato un doppio tag mGFPHis scisso dalla proteasi (Figura 1B) con un linker a 16 residui che separa il tag dal C-terminus di Cdr1, che ha migliorato il legame del tag 6x His affinity allegato alla resina di affinità al nichel e ha permesso il monitoraggio dei livelli di espressione di Cdr1 nelle cellule viventi e durante l'intero processo di purificazione. È stato inoltre sviluppato un protocollo riproducibile per preparati proteici a membrana plasmatica di lievito su piccola scala contenenti circa il 10% di C. albicans Cdr1 (come stimato dalla colorazione di Coomassie dopo SDS-PAGE), che potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

Il successo della caratterizzazione biochimica e biofisica dei trasportatori ABC dipende fortemente dalla scelta del sistema di espressione eterologa. Negli ultimi due decenni, abbiamo sviluppato una piattaforma di espressione proteica della membrana del lievito che è stata utilizzata per studiare molte importanti proteine di membrana fungina. L'espressione ospite Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ viene cancellata in sette principali trasportatori ABC endogeni e contiene il fattore di trascrizione Pdr1-3 con una mutazione gain-of-function che consente la sovraespressione costitutiva di geni proteici di membrana eterologhi stabilmente integrati come copie singole nel locus genomico PDR5. La creazione di vettori plasmidici versatili e l'ottimizzazione di strategie di clonazione in un'unica fase consente la clonazione, la mutagenesi e l'espressione rapide e accurate dei trasportatori ABC eterologhi. Qui, descriviamo lo sviluppo e l'uso di un nuovo tag mGFPHis a cleavable per la proteasi (cioè, la proteina fluorescente verde potenziata dal lievito monomerico yEGFP3 fusa a un tag di purificazione dell'affinità a sei istidine) che è stato progettato per evitare possibili interferenze del tag con la proteina di interesse e per aumentare l'efficienza di legame del tag His alle resine di affinità al nichel. La fusione di mGFPHis alla proteina di membrana ORF (open reading frame) consente una facile quantificazione della proteina mediante l'ispezione dei gel di poliacrilammide e il rilevamento dei prodotti di degradazione che conservano il tag mGFPHis. Dimostriamo come questa caratteristica faciliti lo screening dei detergenti per la solubilizzazione delle proteine di membrana. Viene presentato un protocollo per l'isolamento efficiente, veloce e affidabile dei preparati di membrana plasmatica su piccola scala del trasportatore multiplo di efflusso Cdr1 marcato C-terminalmente etichettato come Candida albicans Cdr1 sovraespresso in S. cerevisiae ADΔΔ. Questo protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala genera membrane plasmatiche di alta qualità in un solo giorno lavorativo. I preparati di membrana plasmatica possono essere utilizzati per determinare le attività enzimatiche delle varianti mutanti Cdr1 e Cdr1.

Un'alta frequenza di trasformazione di S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 trasformanti/μg) è stata ottenuta con pYES2 (Figura 2B). Come previsto, il controllo senza DNA(cioèsolo ddH 2 O) non ha dato trasformatori, e 1 μg della cassetta di trasformazione lineare CDR1-mGFPHis (Figura 1A) ha dato ~ 50 trasformanti (Figura 2C) con il protocollo di trasformazione ADΔΔ ottimizzato. I tras...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Questo articolo presenta un protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala per la caratterizzazione della proteina Cdr1 della Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), sovraespressa in Saccharomyces cerevisiae. Un doppio tag mGFPHis C-terminale scisso con un linker a 16 residui tra Cdr1 e il tag è stato progettato per facilitare la purificazione e lo screening detergente di Cdr1.

Preparazione della membrana plasmatica su piccola scala per l'analisi di Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Il protocollo di isolamento della membrana plasmatica su piccola scala e il doppio tag mGFPHis forniscono un metodo economico, veloce, affidabile e facile per caratterizzare le proteine di membrana nell'organismo modello eucariotico, Saccharomyces cerevisiae. Il più grande vantaggio di questa tecnologia è la facilità e la velocità con cui è possibile determinare i livelli di espressione proteica della membrana, le attività dell'ATP e il detergente più adatto per la loro purificazione. Questa tecnologia è molto facile da usare.Tuttavia, un punto importante da ricordare è quello di raccogliere le cellule come OD 600 di 2, che garantisce una bassa contaminazione mitocondriale e le più alte attività ATPasi possibili. Inizia pre-coltivando una singola colonia di lievito in 10 millilitri di mezzo YPD a 30 gradi Celsius per sette-otto ore a 200 rotazioni al minuto. Utilizzare 10 millilitri di precoltura per inoculare 40 millilitri di terreno YPD fresco.Quindi incubare le cellule a 30 gradi Celsius durante la notte a 200 rotazioni al minuto fino a quando la densità cellulare raggiunge un OD 600 da uno a tre. Il giorno successivo raccogliere 40 unità di densità ottica, o ODU, di cellule facciali logaritmiche centrifugando a 4.200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risespentare e lavare le celle con 40 millilitri di acqua sterile ghiacciata a doppia distillazione.Ripetere il lavaggio utilizzando un millilitro di acqua ghiacciata con centrifugalizzazione tra le fasi di lavaggio. Sospendere di due anni il pellet in un millilitro di acqua sterile ghiacciata e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrificante da 1,5 millilitro pre-raffreddato su ghiaccio. Raccogli le cellule a 3.300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone omogeneizzante appena integrato con un millimolare fenal metil sulfa Neal fluoruro, o PMSF. Conservare la sospensione cellulare a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Scongelare le cellule sul ghiaccio per circa un'ora.Quindi aggiungere perli di silice ghiacciate da 0,5 millimetri di diametro ai 500 microlitri della sospensione cellulare per raggiungere un volume totale di un millilitro. Per rompere le cellule, vortice la sospensione cellulare alla massima intensità di scuotimento per un minuto, per sei cicli, con un periodo di raffreddamento di tre minuti sul ghiaccio dopo ogni ciclo. Dopo il vortice, fare un foro sottile sul fondo del tubo con una lama di bisturi riscaldata e raccogliere l'omogeneo cellulare rotto in un altro tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri ghiacciato con una rotazione a bassa velocità per 10 secondi.Centrifugare l'omogeneo cellulare raccolto a 5, 156 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire 450 microlitri di surnatante in un tubo microcentrante ghiacciato da 1,5 millilitri e aggiungere un millilitro di tampone omogeneizzante ghiacciato integrato con un PMSF fresco millimolare. Per raccogliere le membrane plasmatiche centrifugare la sospensione cellulare a 17.968 volte G per un'ora a quattro gradi Celsius.Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 microlitri di tampone omogeneizzante appena integrato con un PMSF millimolare. Quindi allentare il pellet della membrana plasmatica mescolando con la punta della pipetta da 100 microlitter e sospendere di seguito il pellet ripetendo il pipettaggio su e giù. Misurare la concentrazione proteica del preparato della membrana plasmatica con un kit di analisi delle proteine compatibile con tamponi contenenti l'agente riducente e il detergente.Conservare le membrane plasmatiche a meno 80 gradi Celsius o tenerle sul ghiaccio per un uso immediato. Versare da quattro a cinque millilitri di gel separatore nell'apparato gel assemblato fino a due centimetri dall'alto. Sovrapporre con cura da uno a due millilitri di 0,1% SDS sulla parte superiore e lasciare che il gel di poliacrilammide si imposti per 60 minuti a temperatura ambiente.Dopo un'ora rimuovere lo strato di SDS allo 0,1% dal gel separatore polimerizzato e risciacquare il gel con acqua doppia distillata per rimuovere tracce di SDS. Versare la miscela di gel impilante sul gel separatore. Metti un pettine nel gel impilante e rimuovi eventuali bolle d'aria intorno al pettine.Quindi lasciare che il gel impilante si imposti per 60 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il pettine e quindi risciacquare le fessure del gel con acqua. Mettere il gel nel serbatoio del gel e riempire il serbatoio del gel fino in cima con il tampone di corsa.Mescolare da cinque a 10 microlitri di campioni di membrana plasmatica con volumi uguali di due volte colorante a carico proteico e caricare immediatamente la miscela di campioni in singoli slot di gel, immersi nel buffer in esecuzione. Caricare i marcatori di peso molecolare delle proteine nell'intervallo da 10 a 245 Kilodalton in uno slot separato per consentire la stima delle dimensioni dei singoli frammenti proteici. Eseguire l'elettroforesi su gel a 200 volt fino a quando il colorante di carico blu raggiunge il fondo del gel.Esaminare il gel per la fluorescenza GFP in-gel con un sistema di imaging su gel. Seguendo l'imaging fluorescente fissare le proteine in 10-20 millilitri di soluzione fissante di gel proteico mediante delicata agitazione del gel per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi risciacquare due volte per 10 minuti con 10 millilitri di acqua doppia distillata e posizionare il gel in 10 millilitri di soluzione colloidale di Kumasi con un leggero scuotimento per un'ora a temperatura ambiente per visualizzare le bande proteiche.Per una migliore visualizzazione delle bande proteiche, demacchiare il gel una o due volte in 20 millilitri di acqua doppia distillata per un'ora prima di registrare le immagini con il sistema di imaging del gel. Un'alta frequenza di trasformazione di Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta è stata ottenuta con il plasmide di controllo positivo PS2. Non sono stati ottenuti trasformatori Eurocell Prototron per il controllo negativo.Circa 50 prototrofi CDR1-mGFPHis trasformanti sono stati ottenuti dopo l'incubazione di cellule AD Delta Delta trasformate su piastre CSM meno URA per tre giorni. Il piccolo trasformante che non può crescere sulle piastre di agar YPG è stato eliminato. I campioni di CDR1-mGHPhi con concentrazioni variabili sono stati quantificati con fluorescenza in-gel.Le intensità di fluorescenza mGFP erano lineari sull'intero intervallo di concentrazione con fluorescenza di fondo minima. La variazione della densità cellulare ha indicato che la rottura di 40 ODU di cellule ha prodotto la più alta qualità delle membrane plasmatiche con la più alta attività di ATPasi CDR1. Tuttavia, la resa delle membrane plasmatiche è aumentata in proporzione all'aumento delle densità cellulari.La capacità di 31 detergenti con varie proprietà di solubilizzare CDR1-mGHPHis da membrane plasmatiche grezze di AD Delta Delta, cellule CDR1-mGHPHis sono stati testati con la pagina SDS. Beta e alfa DDM e Fos-colina 13 sono stati i migliori detergenti per solubilizzare CDR1-mGHPHis. Tuttavia, Fos-colina 13 causano idrolisi parziale di CDR1-mGHPHis.La proteina grezza della membrana plasmatica solubilizzata con detergente all'1% è stata separata utilizzando una colonna di esclusione di dimensioni superos six aumentate di 10 300 GL. I cromatogrammi dei maltosidi e delle proteine estratte da LMNG hanno mostrato che la maggior parte dei CDR1-mGHP Eludono come un picco gaussiano di buona forma a 15,5 millimetri CDR1-mGHPHis solubilizzato con detergenti contenenti glucosio allusi come picco aggregato o aggregato ampio. I picchi più alti per DDM hanno indicato che una grande porzione di DMN G solubilizzato CDR1-mGHPHis può essere denaturato.Nei cromatogrammi FSCC per fos-coline zwitterioniche e due detergenti non ionici solo Digitonina e ha dato un cromatogramma simile al DDM. Fos-colina 13 ha dato un picco simmetrico di forma acuta, ma alludeva con un volume di eluizione significativamente inferiore a quello per DDM. Il doppio tag ottimizzato migliora anche la resa di purificazione e ha contribuito a determinare la localizzazione, il traffico e la stabilità termica delle proteine di membrana.La tecnologia di espressione eterologa può anche essere utilizzata nello screening farmacologico ad alto rendimento e nella caratterizzazione dettagliata di molte altre proteine di membrana.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Ricerca

Biologia

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Novel Produzione Protocollo per piccola scala Produzione di probiotici fermentati

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Preparazione del campione per l&#39;analisi di massa Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Preparazione del campione per l'analisi di proteomica massa-spettrometria-basato di microvasi oculari

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Profilazione a livello di genoma delle interazioni di legame tra fattore di trascrizione e DNA in Candida albicans: un metodo CUT&amp;RUN completo e un flusso di lavoro di analisi dei dati

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...