Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
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著者らは、ニュージーランド・マースデン基金(グラントUOO1305)からの資金援助と、タイのバンコクにあるチュラロンコン大学医学部からのブロック補助金(M.Niimi)を感謝しています。彼らは、G.マダニに博士課程の奨学金を提供してくれたオタゴ大学に感謝したいと考えています。著者らはまた、ステファン・ラウンサー教授と同僚のアミール・アペルバウム博士とデイヴァナヤガバラシー・ヴィナヤガム博士が、ドイツのマックス・プランク分子生理学研究所(MPIMP)で6ヶ月間のG.マダニ訪問の支援と監督に感謝したいと考えている。著者らはまた、MpIMPを訪問するための研究助成金(57381332)をG.マダニに提供してくれたドイツ学術交流サービス(DAAD)に感謝しています。

1. 変換能力ADΔおよびADΔΔセルの新鮮または凍結されたストックの調製
<ol><li>2x YPCDの25 mLを接種する[すなわち、 2x YPD;2%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、4%(w/v)デキストロース、0.079%(w/v)CSM(完全なサプリメント混合物)を含む35 培地(o/n)を1回の酵母コロニーで16時間インキュベートし、1分間に200回転で16時間(rpm)で16時間インキュベートする。</li>
	<li>25 mL o/n培養で2x YPCD培地の225...

膜タンパク質の構造解析の最近の進歩にもかかわらず、Cdr1または他のPDRトランスポーターの3D構造は現在利用できません。したがって、Cdr1構造とその生化学的特徴に関する知識を得ることは重要であり、流出媒介性を克服するための新薬の合理的な設計に関する洞察を提供するだけでなく、ABCタンパク質の重要なサブファミリーの機能のメカニズムにも洞察を提供する。
<p class="jove_content...

その本来の脂質環境からのインテグラル膜タンパク質の抽出は、その構造と機能1、2、3、4に劇的に影響を与える可能性があります。生物学的膜5の複雑な脂質組成は、極めて重要なタンパク質と脂質相互作用が6に起こり得る。脂質は膜タンパク質の構造的完全性を維持し、膜コンパートメントの宛先7,8で正しく機能することを可能にする。したがって、膜タンパク質精製における重要な第一歩は、その構造および/または機能に影響を与えることなく、その天然環境からのタンパク質の抽出である。
膜タンパク質の構造を特徴付けるには多くの障害があり、そのほとんどが疎水性に関連しており、X線結晶学やクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)9、10、11、12に必要な量で適切に折り畳まれた機能性膜タンパク質を発現しにくい。膜タンパク質発現系には、相同9、異種13、14、15、およびインビトロ発現系16,17の3種類があります。多くの発現系の発現レベル、または非常に低いコストは、膜タンパク質を産生するための好ましい選択肢として少数の宿主しか残さない。それらは、細菌宿主、大腸菌、酵母S.セレビシエおよびピキアパストリス、およびSf9昆虫細胞または哺乳動物細胞株18のような高等の真核生物を含む。すべての膜タンパク質発現技術には長所と短所があります。しかし、S.セレビシエは、おそらく膜タンパク質産生に適した最も研究された真核生物である。遺伝子工学、創薬、合成生物学、真核細胞膜タンパク質14、19、20、21の発現の用途で非常に汎用性が高い。
本研究では、特許取得済みのS.セレビシエ膜タンパク発現技術21を使用し、S.セレビシエADΔ14およびADΔ2を好ましい宿主として(図1A)、主要なC.アルビカンス多剤流出ポンプCdr1を過剰発現および研究した。S.セレビシエ株はいずれも、ウラ3(ADΔ)またはura3およびhis1(ADΔ)遺伝子の両方を有するAD1-8u-23の誘導体であり、URA3またはHIS1ゲノム座遺伝子で望ましくない統合を通じて生じる偽陽性ウラシルまたはヒスチジン原発性形質転換体を排除するために削除される。 図1Aに示されている7つの主要な多剤流出ポンプ23の欠失は、ADΔΔを最も異種生物に絶妙に敏感にする。機能の得る変異型転写因子Pdr1-3は、2つの相同性の変異体を介して、異種-ORF含有変換カセット(図1A)の異種-ORF含有変換カセット(図1A)を統合した後、Cdr1(図1Aの赤い八角形)のような異種膜タンパク質の構成過剰発現を引き起こす。C末端mGFPの適切な原形質膜局在化タグ付きタンパク質は共焦点顕微鏡(図1A)によって確認することができ、Hisタグはタグ付きタンパク質のニッケル親和性精製に使用することができる。いくつかの真菌性ABCトランスポーター(例えば、カンジダ・クルセイABC1)をpABC3由来プラスミドにクローニングすることは、細胞毒性のために大腸菌に伝播することができなかったため不可能であった。これにより、膜タンパク質14、24のワンステップクローニングの開発を促し、様々な親和性、エピトープ、またはレポータータグをS.cerevisiae ADΔに直接タグ付けしたN末端またはC末端のいずれかでタグ付けされた(図1C)。S.セレビシエ種々のCDR1変異体を過剰発現するADΔ株も、25bpで重複する最大5個の個別PCR断片を用いることで効率的に作成することができる(図1C)。このプロトコルを採用することで、対象となる多くのORFを、非常に短い期間内で低コストで高効率でクローン化、表現、および特徴付けることができます。変換効率は、PCRフラグメントを追加するたびに〜2倍にしか減少しません。 
必要であれば、発現レベルは、通常高い構成式レベル25の0.1%~50%の間の任意の場所まで予測可能に発現レベルを調整するために、プライマー設計によって容易に操作することもできる。最適化された多機能pABC314誘導クローニングベクター、pABC3-XLmGFPHis26(図1B)にはHRV-3Cプロテアーゼ切断部位(X;レフフ|GP)、頻繁に使用されるタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ27よりも4°Cで優れたパフォーマンスを発揮するプロテアーゼである。Lは5アミノ酸(GSGGS)リンカーであり、mGFPは、単量体変異体(A206K)28、29バージョンの酵母強化された緑色蛍光タンパク質変異体yEGFP330であり、Hisは3つのアミノ酸リンカー(GGS)であり、続いて6-ヒスチジン(HHHHHH)ニッケル親和性タンパク質精製タグである。
この発現技術は、創薬や膜タンパク質の研究に成功しています。真菌アゾール薬標的の最初の構造であるS.セレビシエErg1131は、この技術を用いて解決された。また、C.アルビカンスCdr132、33、34の詳細な特徴付けと、システイン架橋研究に適したシステイン欠損Cdr1分子35の作成を可能にし、将来の高解像度構造を検証した。主要なヒト真菌病原体からの他の多くのABC輸送者(すなわち、 C.アルビカンス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・オーリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ユティリス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガトゥス、ペニシリウム・マルネッフェイ、フザリウム・ソラニ族群)もこの発現プラットフォーム24、36、37、38を用いて詳細に研究されている。これにより、ハイスループットスクリーンで使用されている流出ポンプを過剰発現するS.cerevisiae株のパネルを生成し、新しい蛍光流出ポンプ基板ナイルレッド40と特定の41と広域スペクトル14、33、42、43、44の流出ポンプ阻害剤を発見することができました。 このシステムの使用はまた、その種の広域スペクトル真菌多剤流出ポンプ阻害剤42の最初としてclorgylineの発見を可能にした。
膜タンパク質の完全な可溶化と、内因性脂質を欠いた均質な膜タンパク質ミセル調製物の作成には、高い洗剤濃度45が必要である。しかし、残念ながら、これはまた、多くの場合、膜タンパク質5、8、45、46を不活性化します。溶液中の洗浄剤モノマーの特性およびそれらの凝集は、疎水性尾部の物理的性質、アルキル鎖の長さおよび分岐、芳香核またはフルオロアルキル側鎖の存在、またはポリオキシエチレン単位の数によって影響される。したがって、洗浄剤スクリーニングは、膜タンパク質の可溶化および精製に最も適した洗剤を決定するための重要な第一歩である。
C. アルビカンスは、深刻な、生命を脅かす侵襲性感染症47を引き起こす可能性がある免疫不全個体の主要なヒト真菌病原体であり、そして、それは、アゾール抗真菌薬48、49に耐性を持つことができる。C.アルビカンス多剤耐性の主なメカニズムの1つは、Cdr150の過剰発現であり、これは、原形質膜に位置するABCGサブファミリーのII型ATP結合カセット(ABC)トランスポーター51である。フルサイズの真菌性ABCGトランスポーター(2つのヌクレオチド結合ドメイン[NBD]および2つの膜貫通ドメイン[TMD]からなる)は、より一般的に多発性薬物耐性(PDR)トランスポーターとして知られており、そのユニークな逆ドメイントポロジ[NBD-TMD]2によって特徴付けられる。PDRトランスポーターは、植物52、53および真菌54にのみ見られる。その重要性にもかかわらず、PDRトランスポーターのための構造はありませんが、人間のハーフサイズのABCGトランスポーターの構造は最近解決され、Cdr133の最初の仮モデルを作成するのに役立ちました。しかし、我々の最近の実験的証拠は、真菌PDRトランスポーターが特徴的な非対称NBDを有し、おそらくユニークな輸送メカニズムをもたらすため、このモデルに欠陥があることを示唆している。したがって、Cdr1の高解像度構造は、流出媒介性を克服するのに役立つ可能性のある新規排出ポンプ阻害剤の合理的設計と、この重要なABCトランスポーターファミリーの作用機序に関する洞察を提供するために必要とされる。
本研究の目的は、Cdr1の高解像度構造を得ることを究極の目的とし、遺伝子組み換え S.セレビシエ 発現宿主におけるCdr1の発現、可溶化、精製のための信頼できるプロトコルを開発することであった。このプロセスの一環として、プロテアーゼ切開可能なmGFPHisダブルタグ(図1B)は、Cdr1のC末端からタグを分離する16残基リンカーで設計され、ニッケル親和性樹脂への6x Hisアフィニティタグの結合を改善し、生細胞および精製プロセス全体におけるCdr1発現レベルのモニタリングを可能にした。約 10%C.アルビカン Cdr1(SDS-PAGE後のクマシー染色によって推定される)を含む小規模酵母血漿膜タンパク質調製物の再現性プロトコルも開発され、Cdr1の生化学的特性解析に使用できる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

ABCトランスポーターの生化学的および生物物理学的特徴付けの成功は、異種発現系の選択に大きく依存する。過去20年間、私たちは多くの重要な真菌膜タンパク質を研究するために使用されてきた酵母膜タンパク質発現プラットフォームを開発しました。発現宿主 サッカロミセス・セレビシエ ADΔΔは、7つの主要な内因性ABC輸送体で削除され、ゲノム PDR5 遺伝子座の単一コピーとして安定的に統合された異種膜タンパク質遺伝子の構成過剰発現を可能にする機能獲得変異を有する転写因子Pdr1-3を含む。多目的なプラスミドベクターの作成とワンステップクローニング戦略の最適化により、迅速かつ正確なクローニング、突然変異誘発、および異種ABCトランスポーターの発現が可能になります。ここでは、新規プロテアーゼクレアブルmGFPHis二重タグ(すなわち、単量体酵母強化された緑色蛍光タンパク質yEGFP3を6ヒスチジンアフィニティー精製タグに融合)の開発と使用について説明し、目的のタンパク質とのタグの干渉を避け、ニッケル樹脂親和性への彼のタグの結合効率を高めるために設計された。mGFPHisを膜タンパク質ORF(オープンリーディングフレーム)に融合させることにより、ポリアクリルアミドゲルの検査や、mGFPHisタグを保持する分解物の検出により、タンパク質の定量が容易になります。この機能が膜タンパク質可溶化のための洗剤スクリーニングを促進する方法を示す。C末端にタグ付けされた カンジダ・アルビカンス 多剤流出トランスポーターCdr1の効率よく、迅速かつ信頼性の高い分離のためのプロトコルが 、S.cerevisiae ADΔで過剰発現して提示される。この小規模なプラズマ膜絶縁プロトコルは、1営業日以内に高品質の形質のプラズマ膜を生成します。血漿膜製剤は、Cdr1およびCdr1変異体変異体の酵素活性を決定するために使用することができる。

PYES2(図2B)でS.セレヴィシエADΔΔ(〜4 x104形質転換体/μg)の高周波変換が達成された。予想通り、無DNA(すなわち、ddH2 Oのみ)制御は形質転換体を与えず、かつ1μgの線形CDR1-mGFPHis変換カセット(図1A)は、最適化されたADΔΔ変換プロトコルで〜50個の変換剤(図2C)を与えた。CDR1-mGFPHis形質...

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Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

本稿では、サッカロマイセス・セレビシエで過剰発現したカンジダ・アルビカンスABC(ATP結合カセット)タンパク質Cdr1の特性評価のための小規模な血漿膜分離プロトコルを提示する。プロテアーゼ切開性C末端mGFPCdr1とタグの間に16残基リンカーを備えた二重タグは、Cdr1の精製および洗剤スクリーニングを容易にするように設計された。

カンジダ・アルビカンスCdr1-mGFPHisの分析のための小スケールプラズマ膜調製

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

小型の原形質膜分離プロトコルとmGFPHisダブルタグは、真核生物の膜タンパク質を特徴付けるための経済的、迅速で信頼性の高い、簡単な方法、サッカロミセスセレビシエを提供します。この技術の最大の利点は、膜タンパク質発現レベル、ATPの活性および洗剤が精製に最も適している容易さと速度が決定できることです。この技術は非常にユーザーフレンドリーです。しかし、覚えておくべきことの1つは、細胞を2のOD 600として収穫し、ミトコンドリアの汚染が少なく、可能な限り最高のATPase活動を保証することです。1分間に200回転で7〜8時間摂氏30度で10ミリリットルのYPD培地で単一の酵母コロニーを前培養することから始めます。新鮮なYPD培地の40ミリリットルを接種するためにプレ培養の10ミリリットルを使用してください。その後、細胞密度が1〜3のOD 600に達するまで、毎分200回転で一晩摂氏30度で細胞をインキュベートします。翌日には、4度で遠心分離機で対数顔細胞の40の光学密度単位(ODU)を収穫し、摂氏4度で5分あたり200倍G。40ミリリットルの氷冷滅菌二重蒸留水で細胞を再中断して洗浄します。洗浄工程の間に遠心水で1ミリリットルの氷冷水を使用して洗浄を繰り返します。氷冷滅水の1ミリリットルにペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を氷上で予冷した1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。セルを摂氏4度で3分間300倍Gで収穫する。上清を吸引し、500マイクロリットルの均質化バッファーで細胞ペレットを再懸濁し、1ミリモルフェナルメチルスルファニールフッ化物、またはPMSFを補充した。さらに使用するまで、セル懸濁液をマイナス80°Cで保管してください。氷上の細胞を約1時間解凍します。その後、氷冷0.5ミリメートル直径シリカビーズを細胞懸濁液の500マイクロリットルに加え、1ミリリットルの総体積に達する。細胞を破壊するために、細胞懸濁液を最大揺れ強度で1分間、6サイクル、各サイクルに続く氷上で3分間の冷却期間を有する。ボルテックス後、加熱されたメスブレードでチューブの底に薄い穴を作り、壊れた細胞ホモジュネートを別の氷冷1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに集め、低速スピンを10秒間行います。採取した細胞を5、156倍のGで遠心分離し、4°Cで5分間Gをホモジュし、細胞の破片を取り除く。450マイクロリットルの上清を氷冷1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、1ミリモル新鮮PMSFを補った氷冷均質化バッファーを1ミリリットル加えます。細胞懸濁液を17、968倍Gで摂氏4度で1時間、遠心分離した形質膜を収穫する。上清を取り除き、1ミリモルPMSFで補充したての均質化バッファーの100マイクロリットルを追加します。その後、100マイクロリットルピペットチップで攪拌して形質膜ペレットを緩め、ピペットを上下に繰り返してペレットを再懸濁します。還元剤と洗剤を含むバッファーと互換性のあるタンパク質アッセイキットを用いて、血漿膜調製物のタンパク質濃度を測定します。血漿膜をマイナス80度で保存するか、氷の上に保管してすぐに使用してください。組み立てられたゲル装置に4~5ミリリットルの分離ゲルを上から2センチメートルまで注ぎます。慎重に上に0.1%SDSの1〜2ミリリットルを重ね、ポリアクリルアミドゲルを室温で60分間セットします。1時間後、重合分離ゲルから0.1%SDS層を除去し、二重蒸留水でゲルをすすいでSDSの痕跡を取り除きます。積み重ねゲルミックスを分離ゲルに注ぎます。積み重ねゲルに櫛を入れ、櫛の周りから気泡を取り除きます。その後、積み重ねゲルを室温で60分間セットします。くしを取り出し、水でゲルスロットをすすきます。ゲルタンクにゲルを入れ、ランニングバッファーで上部にゲルタンクを充填します。5~10マイクロリットルの血漿膜サンプルを2倍のタンパク質負荷染料の等量で混合し、すぐにサンプル混合物を個々のゲルスロットにロードし、ランニングバッファに沈めます。タンパク質分子量マーカーを10~245キロダルトンの範囲で別のスロットにロードし、個々のタンパク質フラグメントのサイズ推定を可能にします。青い負荷染料がゲルの底に達するまで200ボルトでゲル電気泳動を行います。ゲルイメージングシステムを用いて、インゲルGFP蛍光のゲルを調べます。蛍光イメージングに続いて、室温で15分間ゲルを緩やかに攪拌することにより、タンパク質固定溶液の10〜20ミリリットルのタンパク質固定液でタンパク質を固定した。その後、10ミリリットルの二重蒸留水で10分間2回洗い流し、室温で1時間穏やかに揺れるコロイドクマシ染色液10ミリリットルにゲルを入れてタンパク質バンドを視覚化します。タンパク質バンドの視覚化を改善するために、ゲルイメージングシステムで画像を記録する前に、20ミリリットルの二重蒸留水中にゲルを1〜2回脱染色した。サッカロミセス・セレビシエA Dデルタの高周波変換は、プラスミドPS2の正の対照によって達成された。負のコントロールに対してユーロセル原トロン形質は得られない。約50個のURA細胞原始眼CDR1-mGFPHis形質転換体は、CSMマイナスURAプレート上で変換されたADデルタデルタ細胞を3日間インキュベートした後に得られた。YPG寒天板上で成長できない小柄な変容剤を排除した。CDR1-mGHP様々な濃度のサンプルを、インゲル蛍光で定量した。mGFP蛍光強度は、最小限のバックグラウンド蛍光で全濃度範囲にわたって線形であった。細胞密度を変化させることで、細胞の40 ODUを破壊すると、CDR1 ATPase活性が最も高い形質の膜が得られたことが示されました。しかし、細胞膜の収率は細胞密度の増加に比例して増加した。ADデルタデルタの粗形質膜からCDR1-mGHPHisを可溶化する様々な特性を有する31の洗浄剤の能力を、CDR1-mGHPHis細胞はSDSページで試験した。ベータおよびアルファ DDM と Fos コリン 13 CDR1-mGHPHis を可溶化するのに最適な洗剤でした。.しかし, Fos コリン 13 CDR1-mGHPHis の部分加水分解を引き起こす.粗血形質膜タンパク質を1%の洗剤で可溶化し、スーパーオス6を使用して分離し、10 300GLサイズの排除カラムを6個増加させた。マルトシドおよびLMNG抽出タンパク質のクロマトグラムは、CDR1-mGHPHisが凝集または広範な凝集ピークとしてほのめかした洗浄剤を含むグルコースで可溶化した15.5ミリメートルで、優れた形状のガウスピークとして排除するCDR1-mGHPHisを示した。DDMの高いピークは、DMN Gの大部分がCDR1-mGHPHisを変性する可能性があることを示した。FSCCでは、ジウテリオニック・フォスコリンと2つの非イオン性洗剤のクロマトグラムは、ジギトニンのみを与え、DDMに同様のクロマトグラムを与えた。Fos-コリン 13 対称的なシャープな形状のピークを与えました, しかし、それはDDMのためのそれよりもかなり低い溶出量でほのめかした.また、最適化された二重タグは精製収率を向上させ、膜タンパク質の局在化、人身売買、熱安定性を決定するのに役立ちました。異種発現技術は、高スループットの薬物スクリーニング、および他の多くの膜タンパク質の詳細な特性評価にも使用できます。

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

遺伝子発現用機械の機能的アッセイのための小規模の核抽出物

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

プロバイオティクス発酵食品の小規模製造のための新規生産プロトコル

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

質量サイトメトリー分析のための試料調製

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

眼微小循環の質量分析法を用いたプロテオミクス解析の前処理

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

カンジダ・アルビカンスにおける転写因子-DNA結合相互作用のゲノムワイドプロファイリング:包括的なCUT&amp;RUN法とデータ解析ワークフロー

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...