Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

저자는 뉴질랜드 마스덴 기금 (그랜트 UOO1305)의 자금 조달을 감사하게 인정하고, 의학 학부에서 블록 보조금을 인정, 출라롱콘 대학, 방콕, 태국 (M. Niimi). 그들은 박사 학위 장학금G. Madani를 제공 오타고 대학에 감사드립니다. 저자는 또한 스테판 라운서 교수와 그의 동료, 아미르 아펠바움 박사, 그리고 데이바야야바라시 비나야감 박사에게 감사를 표하고 싶다. 저자는 또한 G. Madani에게 MPIMP를 방문하는 연구 보조금 (57381332)을 제공 한 독일 학술 교환 서비스 (DAAD)에 감사드립니다.

1. 변환 유능한 ADΔ 및 ADΔΔ 세포의 신선하거나 냉동 된 주식의 준비
<ol><li>2x YPCD의 25mL 접종[즉, 2x YPD; 2% (w/v) 효모 추출물, 2% (w/v) 펩톤, 4% (w/v) 덱스트로스), 0.079% (w/v) CSM (완전한 보충 혼합물)]35 중간 하나 효모 식민지와 함께 하룻밤 (o/n) 30 시간 당 30 °C에서 30 °C에 16 시간 (o/n).</li>
	<li>25mL o/n 배양시 2x YPCD 배지의 225mL을 접종하고 600nm(OD600)에서세포 광학 밀도를 검사합니?...

멤브레인 단백질의 구조 적 분석이 최근 진행에도 불구하고 Cdr1 또는 다른 PDR 수송기를 위한 3D 구조는 현재 사용할 수 없습니다. 따라서 Cdr1 구조와 생화학 적 특징에 대한 지식을 얻는 것이 중요합니다.
멤브레인 단백질의 구조적 특성화를 위한 주요 요구 사항 중 하나는 X선 결정학 또는 극저온-EM에 필요한 수량으로 올바르게 접힌 및 그대로 막 단백질의 발현입니다. 발현 시...

그들의 네이티브 지질 환경에서 일체형 막 단백질의 추출은 극적으로 그들의 구조 및 기능1,2,3,4에영향을 미칠 수 있습니다. 생물학적 막5의 복잡한 지질 조성물은 매우 중요한 단백질 지질 상호 작용이6을발생할 수 있도록 보장한다. 지질은 멤브레인 단백질의 구조적 무결성을 유지하므로 멤브레인 구획 대상에서 올바르게 작동할 수 있게 합니다7,8. 따라서 막 단백질 정제의 중요한 첫 번째 단계는 구조 및/또는 기능에 영향을 주지 않고 자국 의 환경으로부터 단백질을 추출하는 것이다.
막 단백질의 구조를 특성화하는 데는 많은 장애물이 있으며, 대부분은 소수성 특성과 관련이 있으며 X선 결정촬영 또는 극저온 전자 현미경(cryo-EM)9,10,11,12에필요한 수량으로 제대로 접히고 기능성 멤브레인 단백질을 표현하는 데 어려움이있다. 멤브레인 단백질 발현 시스템의 세 가지 유형이 있다: 동종9,이종학 13,14,15,및 체외 발현시스템(16,17). 많은 발현 시스템의 발현 수준이 낮거나 막 단백질을 생산하는 데 바람직한 옵션으로 소수의 호스트만 남게 됩니다. 그(것)들은 세균성 숙주, Escherichia 대장균,효모 S. cerevisiae 및 피치아 목회,및 Sf9 곤충 세포 또는 포유류 세포주18와같은 더 높은 진핵생물을 포함합니다. 모든 멤브레인 단백질 발현 기술은 장점과 단점이 있습니다. 그러나, S. cerevisiae는 아마도 가장 잘 연구된 진핵 모델 유기체막 단백질 생산에 적합합니다. 유전공학, 신약개발, 합성생물학, 진핵막 단백질14,19,20,21의발현에 대한적용으로매우 다재다능하다.
이 연구에서는, 특허받은 S. 세레비시아멤브레인 단백질 발현기술(21)이 사용되었고, S. 세레비시아에 ADΔ14 및 ADΔΔ22를 선호하는 호스트(그림1A)로,주요 C. 알비칸스 다중약물 efflux 펌프 Cdr1을 과발형및 연구하였다. S. cerevisiae 균주는 모두 AD1-8u-23의 유도체로 ura3(ADΔ) 또는 ura3 및 his1(ADΔΔ) 유전자가 삭제되어 URA3 또는 HIS1 게놈 소암에서 원치 않는 통합을 통해 발생하는 거짓 양성 우라실 또는 히스티딘 프로토트로프 변혁제를 제거합니다. 도 1A에표시된 7개의 주요 다중 약물 efflux펌프(23)의삭제는 대부분의 제노바이오틱에 ADΔΔ를 절묘하게 민감하게 만듭니다. 기능의 게인 돌연변이 전사 인자 Pdr1-3은 이성엽-ORF 함유 변형 카세트(도 1A)를 통합한 후 Cdr1(도 1A의붉은 팔각형)과 같은 이성막 단백질의 구성적인 과발현을 유발한다(도1A)게놈 PDR5 로큐(blue-recangleus) 2개의 피모를통해. C-말단 mGFP의 적절한 플라즈마 멤브레인 국소화는 공초점 현미경 검사법(도1A)에의해 확인할 수 있으며, 그의 태그는 태그된 단백질의 니켈 친화성 정화에 사용될 수 있다. 일부 곰팡이 ABC 수송기 (예를 들어, 칸디다 크루시 ABC1)를pABC3 유래 플라스미드로 복제하는 것은 세포 독성으로 인해 에샤리치아 대장균에서 전파 될 수 없기 때문에 불가능했습니다. 이로 인해 막단백질(14,24)의 1단계 복제가 다양한 친화성, 에피토프 또는 리포터 태그를 S. cerevisiae ADΔΔ(도1C)로직접 태그한 N-또는 C-종래에 태그되어 있는 것을 촉발시켰다. S. 세레비시아 다양한 CDR1 돌연변이를 과도하게 발현하는 ADΔΔ 균주는 25bp(도1C)로겹치는 최대 5개의 개별 PCR 조각을 사용하여 효율적으로 만들 수 있습니다. 이 프로토콜을 채택하면 많은 ORF가 복제, 표현 및 매우 짧은 시간 내에 저렴한 비용과 고효율로 특성화 될 수 있습니다. 변환 효율성은 추가 PCR 조각마다 ~2배만 줄입니다. 
원하는 경우 발현 수준은 프라이머 설계에 의해 쉽게 조작되어 일반적으로 높고 구성적인 식수준(25)의0.1%-50% 사이로 식 수준을 예측 가능한 조정할 수 있다. 최적화된 다기능, pABC314 유도체 복제 벡터, pABC3-XLmGFPHis26 (도 1B)에는HRV-3C 프로테아제 분열 부위(X; 레벨프| GP), 자주 사용되는 담배 에칭 바이러스(TEV)프로테아제(27)보다4°C에서 더 잘 수행되는 프로테아제. L은 5개의 아미노산(GSGGS) 링커이며, mGFP는 단황 돌연변이(A206K)28,29버전의 효모 향상 그린 형광 단백질 변이체 yEGFP330,그리고 그의 3가지 아미노산 링커(GGS)이며, 그 다음으로 6-히스티딘(HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH) 니켈-핀 단백질 태그가 그 뒤를 이다.
이 발현 기술은 약물 발견과 막 단백질 연구에 성공적으로 사용되었습니다. 곰팡이 아졸 약물 표적인 S. 세레비시아에 에르그1131의첫 번째 구조는 이 기술을 사용하여 해결되었다. 또한 C. albicans Cdr132,33,34의 상세한 특성화와 시스테인-십자형 Cdr1 분자35의 생성을 가능하게 하여 미래의 고해상도 구조를 검증하였다. 주요 인간 곰팡이 병원균의 다른 많은 ABC 수송자(즉, C. 알비칸스, 칸디다 글라브라타, 칸디다 오리스, 칸디다 크루세이, 칸디다 활용도, 크립토코커스 네오포만스, 아스퍼질러스 후미가투스, 페니실륨 마르네페이, 푸사리움 솔라니 종 복합체 등도 이 표현 플랫폼24,36, 38, 38, 38,37, 38,37을사용하여 상세히 연구하고 있다. 이를 통해 S. cerevisiae 균주 과잉 발현 efflux 펌프의 생성을 가능하게하여 새로운 형광 효율화 펌프 기질 나일 레드40 및 특정41 및 넓은 스펙트럼14,33,42,43, 44 efflux 펌프 억제제를 발견했습니다. 이 시스템의 사용은 또한 그것의 종류의 광범위 한 스펙트럼 곰 팡이 멀티 드 드 efflux 펌프 억제제의 첫 번째로 clorgyline의 발견을 가능하게(42)
막 단백질의 완전한 용해화와 내인성 지질이 없는 균일한 막 단백질-미켈 제제의 생성은 높은 세제농도(45)가필요하다. 그러나 불행히도, 이것은 또한 종종 막 단백질5,8,45,46을비활성화합니다. 세제 단량제및 용액의 응집특성은 소수성 꼬리의 물리적 특성, 알킬 사슬의 길이 및 분기, 방향족 핵 또는 플루오알킬 측 사슬의 존재 또는 폴리옥세틸렌 단위의 수에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 세제 스크리닝은 막 단백질 용용화 및 정제에 가장 적합한 세제를 결정하는 중요한 첫 번째 단계이다.
C. 알비칸스는 중증, 생명을 위협하는 침습적 감염을 유발할 수 있는 면역손상된 개인의 주요 인간 곰팡이 병원체로서47,아졸 항진균제(48,49)에내성이 생길 수 있다. C. albicans 다약물 내성의 주요 메커니즘 중 하나는 Cdr150의과발현이며, 이는 혈장 멤브레인에 위치한 ABCG 서브패밀리의 II ATP 결합 카세트(ABC)수송기(51)이다. 풀 사이즈 곰팡이 ABCG 수송기 (두 개의 뉴클레오티드 결합 도메인 [NBDs]와 두 개의 막개 도메인 [TMd]로 구성) 더 일반적으로 흉골 약물 저항 (PDR) 수송로 알려져 있으며 독특한 반전 도메인 토폴로지 [NBD-TMD]2. PDR 수송기는 식물52,53 및 곰팡이54에서만발견됩니다. 그 중요성에도 불구하고, PDR 수송기를위한 구조는 없다, 인간의 반 크기 ABCG 수송에 대한 구조는 최근 Cdr133에대한 첫 번째 잠정 모델을 만드는 데 도움이 해결되었지만. 우리의 최근 실험적인 증거는, 그러나, 곰팡이 PDR 수송기는 독특한 전송 기계장치에 아주 가능하게 결과로 특징적인 비대칭 NBD가 있기 때문에 이 모형이 아마 결함이 있다는 것을 건의합니다. 따라서 Cdr1의 고해상도 구조는 efflux 매개 약물 내성을 극복하고이 중요한 ABC 수송 가문의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수있는 새로운 efflux 펌프 억제제의 합리적인 설계모두에 필요합니다.
이 연구의 목적은 Cdr1에 대한 고해상도 구조를 얻는 궁극적 인 목적으로 유전자 변형 S. cerevisiae 발현 호스트에서 Cdr1의 발현, 용해성 및 정제를위한 신뢰할 수있는 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 이 과정의 일환으로, 프로테아제-클레이블 mGFPHis 더블태그(도 1B)는Cdr1의 C-terminus로부터 태그를 분리하는 16잔류 링커로 설계되었으며, 이는 부착된 6x의 결합을 향상시키고 니켈-친화성 수지에 대한 그의 친화성 태그를 개선하고 전체 세포에서 Cdr1 발현 수준을 모니터링할 수 있게 하였다. 약 10% C. albicans Cdr1을 포함하는 소규모 효모 혈장 막 단백질 제제를 위한 재현 가능한 프로토콜(SDS-PAGE 후 쿠마시 염색에 의해 추정된 바와 같이)도 개발되었으며, 이는 Cdr1의 생화학적 특성화에 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

ABC 수송기의 성공적인 생화학적 및 생물리적 특성화는 이종발형 발현 시스템의 선택에 크게 좌우됩니다. 지난 2년 동안, 우리는 많은 중요한 곰팡이 막 단백질을 연구하는 데 사용되어 온 효모 막 단백질 발현 플랫폼을 개발했습니다. 발현 숙주 사카로미세스 cerevisiae ADΔΔ는 7개의 주요 내인성 ABC 수송기에서 삭제되고 게놈 PDR5 locus에서 단일 사본으로 안정적으로 통합된 이종막 단백질 유전자의 구성 과잉 발현을 가능하게 하는 게인기능 돌연변이를 가진 전사 인자 Pdr1-3을 함유하고 있다. 다재다능한 플라스미드 벡터를 생성하고 1단계 복제 전략의 최적화를 통해 이종성 ABC 수송기의 신속하고 정확한 복제, 돌연변이 발생 및 표현을 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 새로운 프로테아제-클레이블 mGFPHis 이중 태그(즉, 단황 효모강화 녹색 형광 단백질 yEGFP3가 6-히스티딘 친화도 정화 태그에 융합)의 개발 및 사용을 설명하며, 이는 관심있는 단백질로 태그의 간섭가능성을 피하고 그의 태그의 결합 효율을 높이기 위해 고안되었다. mGFP의 융합막 단백질 ORF(오픈 리딩 프레임)는 폴리아크릴아미드 젤의 검사와 mGFPHis 태그를 유지하던 분해 제품의 검출을 통해 단백질의 용정화를 가능하게 한다. 우리는 이 기능이 막 단백질 용해화를 위한 세제 스크리닝을 용이하게 하는 방법을 보여줍니다. C-말단 태그칸디다 알비칸스 다중 약물 efflux 수송기 Cdr1S. cerevisiae ADΔΔ에서 과발현의 소규모 플라즈마 멤브레인 제제의 효율적이고 빠르고 신뢰할 수 있는 절연을 위한 프로토콜이 제시된다. 이 소규모 플라즈마 멤브레인 격리 프로토콜은 단일 작업 일 내에 고품질 플라즈마 멤브레인을 생성합니다. 플라즈마 멤브레인 제제는 Cdr1 및 Cdr1 돌연변이 변이체의 효소 활동을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

S. 세레비시아에 ADΔΔ(~4 x 104 변압제/μg)의 고주파는 pYES2(도2B)로달성되었다. 예상대로, 노 DNA(즉, ddH2O만) 제어는 최적화된 ADΔΔ 변환 프로토콜을 통해 ~50트랜스펜션(도2C)을준 선형 CDR1-mGFPHis변형 카세트(도1A)의변압제를 제공하지 않았고, 1μg을 주지 않았다. CDR1-mGFPHis 변압제는 또?...

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Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

작은 규모의 플라즈마 멤브레인 격리 프로토콜 및 mGFPHis 이중 태그는 진핵 모델 유기체인 Saccharomyces cerevisiae에서 막 단백질을 특성화하는 경제적이고 빠르며 신뢰할 수 있으며 쉬운 방법을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 멤브레인 단백질 발현 수준, ATP의 활동 및 세제가 정화에 가장 적합한 용이성과 속도입니다. 이 기술은 매우 사용자 친화적입니다.그러나 기억해야 할 한 가지 중요한 점은 낮은 미토콘드리아 오염과 가능한 가장 높은 ATPase 활동을 보장하는 2의 OD 600으로 세포를 수확하는 것입니다. 분당 200회전에서 7~8시간 동안 YPD 배지 의 10 밀리리터에서 단일 효모 식민지를 미리 배양하여 시작합니다. 신선한 YPD 매체의 40 밀리리터를 접종하기 위해 사전 배양 10 밀리리터를 사용합니다.그런 다음 세포 밀도가 1~3의 OD 600에 도달할 때까지 분당 200 회전에서 하룻밤 사이에 섭씨 30도에서 세포를 배양합니다. 다음날 수확 40 광학 밀도 단위, 또는 ODU, 4섭씨에서 5 분 당 4, 200 배 G에서 원심분리에 의해 로그와스믹 얼굴 세포의. 40밀리리터의 얼음 냉간 멸균 이중 증류수로 세포를 다시 일시 중단하고 세척합니다.세척 단계 사이에 원심화와 얼음 차가운 물의 1 밀리리터를 사용하여 세척을 반복합니다. 얼음 차가운 멸균 물의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 미리 냉각된 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 셀 서스펜션을 옮춥니다. 섭씨 4도에서 3분간 3, 300회 G에서 셀을 수확합니다.수퍼네티드를 흡습하고 1밀리머 펜알 메틸 설파 닐 불소 또는 PMSF로 새롭게 보충된 균질화 완충제의 500 마이크로리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 추가 사용까지 셀 서스펜션을 영하 80도에 보관하십시오. 약 1 시간 동안 얼음에 세포를 해동.그런 다음 얼음 차가운 0.5 밀리미터 직경 실리카 구슬을 셀 서스펜션의 500 마이크로리터에 추가하여 총 1 밀리리터에 도달합니다. 세포를 분해하기 위해 세포 현탁액을 최대 흔들림 강도로 1 분 동안 6 사이클동안 각 주기다음 얼음에 3 분 냉각 기간을 제공합니다. 소용돌이 후, 가열 된 메스 블레이드와 튜브의 바닥에 얇은 구멍을 만들고 10 초 동안 저속 스핀과 다른 얼음 차가운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 깨진 셀 호모게네이트를 수집합니다.수집된 세포 균주5, 섭씨 4도에서 5분간 156회 G로 수집된 세포 균질을 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 450 마이크로리터의 상류제를 얼음 차가운 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 1밀리머 신선한 PMSF로 보충된 얼음 냉균질화 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 혈장 멤브레인원심을 원심분리하기 위해 세포 현탁액은 섭씨 4도에서 1시간 동안 968배 G로 세포 현탁액을 원심분리합니다.상체를 제거하고 1 밀리머 PMSF로 새롭게 보충된 균질화 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로리터 파이펫 끝으로 교반하여 플라즈마 멤브레인 펠릿을 풀고 위아래로 피펫을 반복하여 펠릿을 다시 중단합니다. 감소제 및 세제를 함유한 완충제와 호환되는 단백질 분석 키트를 통해 플라즈마 멤브레인 제제의 단백질 농도를 측정합니다.플라즈마 멤브레인을 영하 80도에 보관하거나 즉시 사용할 수 있도록 얼음위에 보관하십시오. 젤을 분리하는 4~5밀리리터를 위에서 최대 2cm의 조립된 젤 장치에 붓습니다. 조심스럽게 위에 0.1 %의 SDS의 1 ~ 2 밀리리터를 층과 실온에서 60 분 동안 설정 폴리 아크릴아미드 젤을 허용합니다.한 시간 후에 중합 분리 젤로부터 0.1% SDS 층을 제거하고 이중 증류수로 젤을 헹구어 SDS의 흔적을 제거한다. 스태킹 젤 믹스를 분리 젤에 붓습니다. 빗을 스태킹 젤에 넣고 빗 주위에서 기포를 제거합니다.그런 다음 스태킹 젤을 실온에서 60 분 동안 설정할 수 있습니다. 빗을 제거한 다음 젤 슬롯을 물로 헹구습니다. 젤 탱크에 젤을 넣고 젤 탱크를 상단으로 채우는 버퍼를 작성합니다.플라즈마 멤브레인 샘플의 5~10마이크로리터를 단백질 로딩 염료의 동일한 볼륨으로 혼합하고 샘플 혼합물을 개별 젤 슬롯에 즉시 적재하여 실행 버퍼에 담가 두는 다. 개별 단백질 단편의 크기 추정을 가능하게 하기 위하여 10에서 245 킬로달톤의 범위에 있는 단백질 분자량 마커를 개별적인 슬롯으로 로드합니다. 파란색 로딩 염료가 젤 의 바닥에 도달 할 때까지 200 볼트에서 젤 전기 전도를 수행합니다.젤 이미징 시스템으로 인겔 GFP 형광젤을 검사합니다. 형광 이미징에 따라 실온에서 15 분 동안 젤을 부드럽게 교반하여 단백질 젤 고정 용액의 10 ~20 밀리리터에서 단백질을 수정합니다. 그런 다음 이중 증류수 10밀리리터로 10분간 두 번 헹구고, 실온에서 1시간 동안 부드러운 흔들림으로 10밀리리터의 콜로이드 쿠마티 얼룩용 젤을 넣어 단백질 밴드를 시각화합니다.단백질 밴드의 향상된 시각화를 위해 젤 이미징 시스템으로 이미지를 녹화하기 전에 1시간 동안 이중 증류수 20밀리리터에 젤을 한 두 번 염색합니다. 사카로미세스 cerevisiae A D 델타 델타의 고주파는 긍정적 인 제어 플라스미드 PS2로 달성되었다. 부정적인 제어를 위해 유로셀 프로토트론 변압제는 얻어진 것이 없습니다.약 50개의 URA 세포 프로토트로프 CDR1-mGFPHis 변압제는 3일 동안 CSM에서 변형된 AD 델타 델타 세포를 3일 동안 배양한 후 얻어졌다. YPG 한천 판에서 성장할 수 없는 몸집이 작은 변압제는 제거되었다. CDR1-mGHPHis 샘플은 다양한 농도를 가진 시료를 인겔 형광으로 정량화하였다.mGFP 형광 강도는 최소한의 배경 형광으로 전체 농도 범위에 선형이었다. 세포 밀도를 변화시키는 것은 세포의 40 ODU를 깨는 것이 가장 높은 CDR1 ATPase 활동으로 플라즈마 막의 최고 질을 산출했다는 것을 표시했습니다. 그러나, 혈장 막의 수율은 세포 밀도 증가에 비례하여 증가하였다.AD 델타 델타의 조혈막으로부터 CDR1-mGHPHis를 용해시키는 다양한 특성을 가진 31개의 세제의 능력은 SDS 페이지로 테스트되었습니다. 베타 및 알파 DDM 및 포스 콜린 13 CDR1-mGHPHis용용해 하는 최고의 세제 했다. 그러나, 포스 콜린(13)은 CDR1-mGHPHis의 부분 적인 가수분해를 일으킨다.1%세제로 용용화된 조혈장 멤브레인 단백질은 슈퍼오스 6개 증가 10 300 GL 크기 배제 컬럼을 사용하여 분리하였다. 말토사이드와 LMNG 추출 단백질의 크로마토그램은 대부분의 CDR1-mGHPHis가 15.5밀리미터 CDR1-mGHPHe에서 잘 생긴 가우시안 피크로 방출되는 것을 보여주었으며, 골재 또는 광범위한 골재로 언급된 세제를 함유한 포도당으로 용용화되었다. DDM에 대한 높은 피크는 DMN G 용해성 CDR1-mGHPHis의 큰 부분이 변성 될 수 있음을 나타냈다.Zwitterionic Fos-cholines및 2개의 비이온 세제를 위한 FSCC 크로마토그램에서는 디지토닌에만 이노닌을 주었고 DDM에 유사한 크로마토그램을 주었습니다. Fos-choline 13은 대칭날카로운 모양의 피크를 주었지만 DDM보다 용출 량이 현저히 낮습니다. 최적화된 이중 태그는 또한 정화 수율을 개선하고 멤브레인 단백질의 국소화, 인신 매매 및 열 안정성을 결정하는 데 도움이 되었습니다.이종 발현 기술은 또한 높은 처리량 약물 스크리닝및 다른 많은 멤브레인 단백질의 상세한 특성에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

연구

생물학

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

생균제 발효 식품의 소규모 제조를위한 신규 생산 프로토콜

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 특성

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

눈 Microvessels의 질량 분석 기반 Proteomics 분석을 위한 시료 준비

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

칸디다 알비칸스에서의 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링: 포괄적인 CUT&amp;RUN 방법 및 데이터 분석 워크플로우

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...