Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner takknemlig finansiering fra New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305), og et blokkstipend fra Det medisinske fakultet, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). De ønsker å takke Universitetet i Otago for å ha gitt G. Madani et ph.d.-stipend. Forfatterne ønsker også å uttrykke sin takknemlighet til professor Stefan Raunser og hans kolleger, Dr. Amir Apelbaum, og Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, for deres støtte og tilsyn under et 6-måneders besøk av G. Madani ved Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Tyskland. Forfatterne takker også den tyske akademiske utvekslingstjenesten (DAAD) for å ha gitt G. Madani et forskningsstipend (57381332) for å besøke MPIMP.

1. Tilberedning av friske eller frosne lagre av transformasjons kompetente ADΔ- og ADΔΔ-celler
<ol><li>Inokuler 25 ml 2x YPCD [dvs. 2x YPD; 2% (w / v) gjærekstrakt, 2% (w / v) peptone, 4% (w / v) dextrose), 0,079 % (w / v) CSM (komplett tilskuddsblanding)]35 medium med en enkelt gjærkoloni og inkuberer over natten (o / n) i 16 timer ved 30 °C med risting ved 200 omdreininger per minutt (rpm).</li>
	<li>Inokkuler 225 ml 2x YPCD medium med 25 ml o/n-kulturen og kontroller celleoptisk tetthet...

Til tross for nylig fremgang i strukturanalysen av membranproteiner, er ingen 3D-struktur for Cdr1, eller noen annen PDR-transportør, for tiden tilgjengelig. Så å få kunnskap om Cdr1-strukturen og dens biokjemiske egenskaper er viktig, da dette ikke bare vil gi innsikt i rasjonell design av nye stoffer for å overvinne efluxmediert legemiddelresistens, men også inn i mekanismen for funksjon av en viktig underfamilie av ABC-proteiner.
Et av hovedkravene til strukturell karakterisering av m...

Utvinningen av integrerte membranproteiner fra deres opprinnelige lipidmiljø kan dramatisk påvirke deres struktur og funksjon1,2,3,4. Den komplekse lipidsammensetningen av biologiske membraner5 sikrer at kritisk viktige protein-lipidinteraksjoner kan forekomme6. Lipider opprettholder den strukturelle integriteten til membranproteiner, slik at de kan fungere riktig i membranrommets destinasjon (er)7,8. Derfor er et kritisk første skritt i membranproteinrensingen utvinningen av proteinet fra sitt opprinnelige miljø uten å påvirke strukturen og / eller funksjonen.
Det er mange hindringer for å karakterisere strukturen av membranproteiner, hvorav de fleste er relatert til deres hydrofobe natur, og vanskelighetene med å uttrykke riktig brettede og funksjonelle membranproteiner i mengdene som kreves for røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM)9,10,11,12. Det finnes tre typer membranproteinuttrykkssystemer: homolog9, heterolog13,14,15og in vitro expression-systemer16,17. De ofte lave uttrykksnivåene, eller de uoverkommelige kostnadene, for mange uttrykkssystemer etterlater bare noen få verter som det foretrukne alternativet for å produsere membranproteiner. De inkluderer bakteriell vert, Escherichia coli, gjærene S. cerevisiae og Pichia pastoris, og høyere eukaryoter som Sf9 insektceller eller pattedyrcellelinjer18. Alle membranproteinuttrykksteknologier har fordeler og ulemper; S. cerevisiae er imidlertid kanskje den best studerte eukaryote modellorganismen som er egnet for membranproteinproduksjon. Det er svært allsidig med anvendelser innen genteknologi, legemiddeloppdagelse, syntetisk biologi og uttrykk for eukaryote membranproteiner14,19,20,21.
I denne studien ble en patentert S. cerevisiae membranproteinuttrykksteknologi21 brukt, med S. cerevisiae ADΔ14 og ADΔΔ22 som foretrukne verter (Figur 1A), for å overekspressere og studere den store C. albicans multidrug efflux pumpe Cdr1. Både S. cerevisiae-stammene er derivater av AD1-8u- 23 som enten har ura3 (ADΔ) eller både ura3- og his1 (ADΔΔ)-genene slettet for å eliminere falske positive uracil- eller histidinprototrotransformanter som oppstår gjennom uønsket integrasjon ved URA3 eller HIS1 genomisk loci. Slettingen av de 7 store multidrug efflux-pumpene23, angitt i figur 1A, gjør ADΔΔ utsøkt følsom for de fleste xenobiotika. Mutanttranskripsjonsfaktoren Pdr1-3 medfører konstituerende overekspressering av heteroologe membranproteiner som Cdr1 (røde oktagoner i figur 1A) etter integrering av den heterologe-ORF-inneholdende transformasjonskassett (figur 1A) ved genomisk PDR5-locus (blått rektangel i figur 1A) via to homologe rekombinasjonshendelser. Riktig plasmamembran lokalisering av C-terminalt mGFPHis taggede proteiner kan bekreftes ved konfektmikroskopi (figur 1A), og Hans-koden kan brukes til nikkel-affinitetsrensing av det taggede proteinet. Kloning av noen sopp ABC transportører (f.eks. Candida krusei ABC1) i pABC3-avledede plasmider var imidlertid ikke mulig fordi de ikke kunne forplantes i Escherichia coli på grunn av celletoksisitet. Dette førte til utviklingen av ett-trinns kloning av membranproteiner14,24 merket på enten deres N- eller C-terminus med ulike affinitets-, epitop- eller reporterkoder direkte inn i S. cerevisiae ADΔΔ (Figur 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-stammer som overtrykker ulike CDR1-mutanter, kan også opprettes effektivt på denne måten ved å bruke opptil fem individuelle PCR-fragmenter som overlapper med 25 bp (Figur 1C). Ved å bruke denne protokollen kan mange ORF-er av interesse klones, uttrykkes og karakteriseres til lave kostnader og ved høy effektivitet innen svært kort tid. Transformasjonseffektiviteten reduserer bare ~ 2 ganger med hvert ekstra PCR-fragment.
Hvis ønskelig, kan uttrykksnivåer også enkelt manipuleres av primer-design for å justere uttrykksnivåene forutsigbart ned til hvor som helst mellom 0,1% -50% av de vanligvis høye, konstitutive uttrykksnivåene25. Den optimaliserte, multifunksjonelle, pABC314 derivat kloning vektor, pABC3-XLmGFPHis26 (Figur 1B) inneholder en HRV-3C protease spalting området (X; LEVLFQ| gp), en protease som yter bedre ved 4 °C enn det ofte brukte tobakksetsypet (TEV) protease27. L er en fem aminosyre (GSGGS) linker, mGFP er en monomerisk mutant (A206K)28,29 versjon av gjær forbedret grønn-fluorescens protein variant yEGFP330, og Hans er en tre aminosyre linker (GGS) etterfulgt av seks-histidin (HHHHHH) nikkel-affinitet protein rensing tag.
Denne uttrykksteknologien har blitt brukt med hell i legemiddeloppdagelse og studiet av membranproteiner. Den første strukturen for et soppazol narkotika mål, S. cerevisiae Erg1131, ble løst ved hjelp av denne teknologien. Det aktiverte også detaljert karakterisering av C. albicans Cdr132,33,34 og opprettelsen av et cystein-mangelfull Cdr1-molekyl35 egnet for cystein-crosslinking-studier for å verifisere enhver fremtidig høyoppløselig struktur. Mange andre ABC-transportører fra store menneskelige sopppatogener (dvs. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei og Fusarium solani arts complex) har også blitt studert i detalj ved hjelp av denne uttrykksplattformen24,36,37,38,39. Dette har gjort det mulig for genereringen av et panel av S. cerevisiae stammer overekspresserende effluxpumper som har blitt brukt i skjermer med høy gjennomstrømning for å oppdage det nye fluorescerende effluxpumpeunderlaget Nilen rød40 og spesifikke41 og bredspektret14,33,42,43,44 efflux pumpehemmere. Bruken av dette systemet gjorde det også mulig å oppdage clorgyline som den første av sitt slag bredspektret sopp multidrug efflux pumpehemmer42.
Fullstendig solubilisering av membranproteiner og opprettelsen av en homogen membranprotein-micellepreparat blottet for endogene lipider, krever høye vaskemiddelkonsentrasjoner45. Men dessverre inaktiverer dette også ofte membranproteinet5,8,45,46. Egenskapene til vaskemiddelmonomerer og deres aggregering i løsning påvirkes av de fysiske egenskapene til den hydrofobe halen, lengden og forgreningen av alkylkjeden, tilstedeværelsen av en aromatisk kjerne eller fluoroalkyl sidekjede, eller antall polyoksyetylenenheter. Dermed er rengjøringsmiddelscreening et viktig første skritt for å bestemme det mest passende vaskemiddelet for membranprotein-solubilisering og rensing.
C. albicans er et stort menneskelig sopppatogen av immunkompromitterte individer som kan forårsake alvorlige, livstruende invasive infeksjoner47, og det kan bli motstandsdyktig mot azole antifungale legemidler48,49. En av hovedmekanismene for C. albicans multidrug motstand er overekspression av Cdr150, som er en type II ATP-bindende kassett (ABC) transportør51 av ABCG-underfamilien som ligger i plasmamembranen. Abcg-transportører i full størrelse (bestående av to nukleotidbindingsdomener [NBDs] og to transmembrane domener [TMDs]) er mer kjent som pleiotrope legemiddelresistens (PDR) transportører og er preget av deres unike inverterte domenetopologi [NBD-TMD]2. PDR transportører finnes bare i planter52,53 og sopp54. Til tross for deres betydning er det ingen strukturer for PDR-transportører, selv om strukturer for menneskelige halvstørrelse ABCG-transportører nylig har blitt løst som bidro til å skape den første tentative modellen for Cdr133. Våre nylige eksperimentelle bevis tyder imidlertid på at denne modellen er feil muligens fordi sopp PDR-transportører har karakteristiske asymmetriske NBD-er, noe som resulterer ganske muligens i en unik transportmekanisme. En høyoppløselig struktur av Cdr1 er derfor nødvendig for både den rasjonelle utformingen av nye effluxpumpehemmere som kan bidra til å overvinne efluxmediert legemiddelresistens, og for å gi innsikt i virkningsmekanismen til denne viktige ABC-transportørfamilien.
Målet med denne studien var å utvikle pålitelige protokoller for uttrykket, solubilisering og rensing av Cdr1 i den genetisk modifiserte S. cerevisiae uttrykksverten, med det endelige målet å oppnå en høyoppløselig struktur for Cdr1. Som en del av denne prosessen ble en protease-cleavable mGFPHis dobbel tag (Figur 1B) designet med en 16-resters linker som skiller taggen fra C-terminus av Cdr1, som forbedret bindingen av den vedlagte 6x Hans affinitetsmerke til nikkel-affinitetharpiksen og aktivert overvåking av Cdr1-uttrykksnivåer i levende celler og under hele renseprosessen. En reproduserbar protokoll for småskala gjærplasma proteinpreparater som inneholder ca 10% C. albicans Cdr1 (som estimert av Coomassie farging etter SDS-PAGE) ble også utviklet, som kunne brukes til biokjemisk karakterisering av Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

Den vellykkede biokjemiske og biofysiske karakteriseringen av ABC-transportører avhenger sterkt av valget av det heterografiske uttrykkssystemet. I løpet av de siste to tiårene har vi utviklet en gjærmembranproteinuttrykksplattform som har blitt brukt til å studere mange viktige soppmembranproteiner. Uttrykksverten Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ slettes i syv store endogene ABC-transportører, og den inneholder transkripsjonsfaktoren Pdr1-3 med en gain-of-function mutasjon som muliggjør konstituerende overekspresjon av heterografiske membranproteingener stabilt integrert som enkeltkopier ved det genomiske PDR5-locus. Opprettelsen av allsidige plasmidvektorer og optimalisering av ett-trinns kloningsstrategier muliggjør rask og nøyaktig kloning, mutagenese og uttrykk for heterografiske ABC-transportører. Her beskriver vi utviklingen og bruken av et nytt protease-cleavable mGFPHis dobbel tag (dvs. den monomeriske gjæren forbedret grønt fluorescerende protein yEGFP3 smeltet sammen til en seks-histidin affinitet renselse tag) som ble designet for å unngå mulig interferens av taggen med proteinet av interesse og for å øke bindingseffektiviteten til Hans tag til nikkel-affinitets harpikser. Sammensmeltingen av mGFPHis til membranproteinet ORF (åpen leseramme) muliggjør enkel kvantifisering av proteinet ved inspeksjon av polyakrylamidgeler og påvisning av nedbrytningsprodukter som beholder mGFPHis-taggen. Vi demonstrerer hvordan denne funksjonen letter vaskemiddelscreening for membranprotein-solubilisering. En protokoll for effektiv, rask og pålitelig isolasjon av småskala plasmamembranpreparater av C-terminalt merket Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overekspressert i S. cerevisiae ADΔΔ, presenteres. Denne småskala plasmamembranisolasjonsprotokollen genererer plasmamembraner av høy kvalitet i løpet av en enkelt arbeidsdag. Plasmamembranpreparatene kan brukes til å bestemme enzymaktivitetene til Cdr1- og Cdr1 mutantvarianter.

En høy frekvens av transformasjon av S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanter/μg) ble oppnådd med pYES2 (Figur 2B). Som forventet ga ikke DNA-kontrollen (dvs. bare ddH2O) noen transformanter, og 1 μg av den lineære CDR1-mGFPHis-transformasjonskassetten (figur 1A) ga ~ 50 transformanter (figur 2C) med den optimaliserte ADΔΔ-transformasjonsprotokollen. CDR1-mGFP...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Denne artikkelen presenterer en liten plasmamembranisolasjonsprotokoll for karakterisering av Candida albicans ABC (ATP-bindende kassett) protein Cdr1, overekspressert i Saccharomyces cerevisiae. En protease-cleavable C-terminal mGFPHis dobbel tag med en 16-resters linker mellom Cdr1 og taggen ble designet for å lette rensing og vaskemiddel-screening av Cdr1.

Småskala plasmamembranpreparat for analyse av Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Den lille skalaen plasmamembranisolasjonsprotokoll og mGFPHis dobbel tag, gir en økonomisk, rask, pålitelig og enkel metode for å karakterisere membranproteiner i den eukaryote modellorganismen, Saccharomyces cerevisiae. Den største fordelen med denne teknologien er enkelheten og hastigheten som membranproteinuttrykksnivåer, ATPs aktiviteter og vaskemiddelet er best egnet for rensing kan bestemmes. Denne teknologien er veldig brukervennlig.Et viktig poeng å huske er imidlertid å høste celler som OD 600 av 2, noe som sikrer lav mitokondrieforurensning og høyest mulig ATPase-aktiviteter. Begynn med å pre-culturing en enkelt gjærkoloni i 10 milliliter av YPD medium ved 30 grader Celsius i syv til åtte timer ved 200 rotasjoner per minutt. Bruk 10 milliliter prekultur for å inokulere 40 milliliter ferskt YPD-medium.Inkuber deretter cellene ved 30 grader Celsius over natten ved 200 rotasjoner per minutt til celletettheten når en OD 600 av en til tre. Neste dag høster 40 optiske tetthetsenheter, eller ODU, av logaritmiske ansiktsceller ved sentrifugering ved 4200 ganger G per fem minutter ved fire grader Celsius. Re-suspendere og vaske celler med 40 milliliter iskaldt sterilt dobbelt destillert vann.Gjenta vaskingen ved hjelp av en milliliter iskaldt vann med sentrifugalisering mellom vasketrinnene. Re-suspendere pellet i en milliliter iskaldt sterilt vann og overføre celle suspensjon til en 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør forhåndskjølt på is. Høst celler ved 3300 ganger G i tre minutter ved fire grader Celsius.Aspirer supernatanten og re-suspendere cellepellet i 500 mikroliter homogeniserende buffer fersk supplert med en millimolar fenal metylsulffa Neal fluorid, eller PMSF. Oppbevar cellesuspensjonen ved minus 80 grader Celsius inntil videre bruk. Tine cellene på is i omtrent en time.Tilsett deretter iskalde silikaperler med 0,5 millimeter diameter til de 500 mikroliterene i cellefjæringen for å nå et totalt volum på en milliliter. For å bryte cellene, virvel cellefjæringen med maksimal risteintensitet i ett minutt, i seks sykluser, med en tre minutters kjøleperiode på is etter hver syklus. Etter virveling, lag et tynt hull på bunnen av røret med et oppvarmet skalpellblad og samle den ødelagte cellen homogenat i et annet iskaldt 1,5 milliliter mikrosentrifugerrør med lavt hastighetsspinn i 10 sekunder.Sentrifuger den oppsamlede cellen homogenat ved 5, 156 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius for å fjerne celleavfall. Overfør 450 mikroliter supernatant til et iskaldt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør og tilsett en milliliter iskald homogeniseringsbuffer supplert med en millimolar frisk PMSF. For å høste plasmamembraner sentrifugerer cellefjæringen ved 17,968 ganger G i en time ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten og tilsett 100 mikroliter homogeniseringsbuffer ferskt supplert med en millimolar PMSF. Løsne deretter plasmamembranpellet ved å røre med pipettespissen på 100 mikroliter og re-suspendere pelletsen ved å gjenta pipettering opp og ned. Mål proteinkonsentrasjonen av plasmamembranpreparatet med et proteinanalysesett som er kompatibelt med buffere som inneholder reduksjonsmiddelet og vaskemiddelet.Oppbevar plasmamembranene ved minus 80 grader Celsius, eller hold dem på is for umiddelbar bruk. Hell fire til fem milliliter separering av gel i det monterte gelapparatet opptil to centimeter fra toppen. Lag forsiktig en til to milliliter på 0,1% SDS på toppen og la polyakrylamidgelen stilles inn i 60 minutter ved romtemperatur.Etter en time fjern 0,1% SDS-laget fra den polymeriserte separasjonsgelen og skyll gelen med dobbelt destillert vann for å fjerne spor av SDS. Hell stablingsgelblandingen på separasjonsgelen. Legg en kam i stablingsgelen og fjern eventuelle luftbobler fra rundt kammen.La deretter stablingsgelen stilles inn i 60 minutter ved romtemperatur. Fjern kammen og skyll deretter gelsporene med vann. Sett gelen inn i geltanken og fyll geltanken til toppen med løpebuffer.Bland fem til ti mikroliter plasmamembranprøver med like store mengder to ganger proteinlastefargestoff og last umiddelbart prøveblandingen inn i individuelle gelspor, nedsenket i løpebuffer. Last proteinmolekylære vektmarkører i området fra 10 til 245 Kilodalton i et eget spor for å muliggjøre størrelsesestimering av individuelle proteinfragmenter. Utfør gelelektroforese ved 200 volt til det blå lastefargen når bunnen av gelen.Undersøk gelen for in-gel GFP fluorescens med et gelavbildningssystem. Etter fluorescerende avbildning fikse proteiner i 10 til 20 milliliter protein gel fikse løsning ved mild agitasjon av gelen i 15 minutter ved romtemperatur. Skyll deretter to ganger i 10 minutter med 10 milliliter dobbelt destillert vann og legg gelen i 10 milliliter kolloidal Kumasi-flekkløsning med skånsom risting i en time ved romtemperatur for å visualisere proteinbånd.For forbedret visualisering av proteinbånd, flekk gelen en eller to ganger i 20 milliliter dobbelt destillert vann i en time før du tar opp bilder med gelavbildningssystemet. En høy frekvens av transformasjon av Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta ble oppnådd med den positive kontrollen plasmid PS2. Ingen Eurocell Prototron transformanter ble oppnådd for den negative kontrollen.Omtrent 50 URA celleprototroph CDR1-mGFPHis transformant ble oppnådd etter inkubering av transformerte AD Delta Delta-celler på CSM minus URA-plater i tre dager. Petite transformant som ikke kan vokse på YPG agarplater ble eliminert. CDR1-mGHPHis prøver med varierende konsentrasjoner ble kvantifisert med in-gel fluorescens.MGFP-fluorescensintensitetene var lineære over hele konsentrasjonsområdet med minimal bakgrunnsfluorescens. Varierende celletetthet indikerte at brudd på 40 ODU av celler ga den høyeste kvaliteten på plasmamembraner med høyest CDR1 ATPase-aktivitet. Imidlertid økte utbyttet av plasmamembranene i forhold til økende celletetthet.Evnen til 31 vaskemidler med ulike egenskaper for å løse CDR1-mGHPHis fra rå plasmamembraner av AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis celler ble testet med SDS side. Beta og alfa DDM og Fos-choline 13 var de beste vaskemidler for å løse CDR1-mGHPHis. Fos-choline 13 forårsaker imidlertid delvis hydrolyse av CDR1-mGHPHis.Rå plasmamembranprotein solubilisert med 1% vaskemiddel ble separert ved hjelp av en superos seks økt 10 300 GL størrelse utelukkelse kolonne. Kromatogrammer av Maltosides og LMNG ekstraherte proteiner viste de fleste CDR1-mGHPHis unnvike som en pent formet gaussisk topp på 15,5 millimeter CDR1-mGHPHis solubilized med glukose som inneholder vaskemidler alludert som en aggregert eller bred aggregert topp. De høyere toppene for DDM indikerte at en stor del av DMN G solubilized CDR1-mGHPHis kan denatureres.I FSCC-kromatogrammer for zwitterionic Fos-cholines og to ikke-ioniske vaskemidler bare Digitonin og ga et lignende kromatogram til DDM. Fos-choline 13 ga en symmetrisk skarpformet topp, men det henviste med et betydelig lavere elutionvolum enn det for DDM. Den optimaliserte dobbeltkoden forbedrer også renseutbyttet og bidro til å bestemme lokalisering, menneskehandel og termisk stabilitet av membranproteiner.Den heteroologe uttrykksteknologien kan også brukes i høy gjennomstrømningsmedisinscreening, og detaljert karakterisering av mange andre membranproteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Kartlegging Molekylær Diffusion i plasmamembranen ved Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Småskala Nuclear Ekstrakter til Funksjonelle analyser av Gene-uttrykk Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Imaging Plasma Membran Deformasjoner Med pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Novel Produksjon Protokoll for Småskala Produksjon av probiotiske fermentert mat

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvepreparering for Mass Cytometry Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Fastsettelse av Plasma membranen partisjonering for perifert knyttet proteiner

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Karakterisering av MLKL-mediert Plasma membranen brudd i Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Eksempel forberedelse til masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyse av okulære Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Genomomfattende profilering av transkripsjonsfaktor-DNA-bindende interaksjoner i Candida albicans: En omfattende CUT&amp;RUN-metode og arbeidsflyt for dataanalyse

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...