Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Os autores reconhecem com gratidão o financiamento do Fundo Marsden da Nova Zelândia (Grant UOO1305), e uma subvenção de bloco da Faculdade de Medicina, Universidade Chulalongkorn, Bangkok, Tailândia (M. Niimi). Eles desejam agradecer à Universidade de Otago por fornecer a G. Madani uma bolsa de doutorado. Os autores também desejam expressar sua gratidão ao professor Stefan Raunser e seus colegas, Dr. Amir Apelbaum, e ao Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, por seu apoio e supervisão durante uma visita de 6 meses de G. Madani no Instituto Max Planck de Fisiologia Molecular (MPIMP), Dortmund, Alemanha. Os autores também agradecem ao Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD) por fornecer a G. Madani uma bolsa de pesquisa (57381332) para visitar o MPIMP.

1. Preparação de estoques frescos ou congelados de células ADΔ e ADΔΔ competentes
<ol><li>Inoculação de 25 mL de 2x YPCD [i.e., 2x YPD; 2% (p/v) extrato de levedura, 2% (w/v) peptone, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (mistura completa de suplementos)]35 médios com uma única colônia de levedura e incubam durante a noite (o/n) por 16 h a 30 °C com agitação a 200 revoluções por minuto (rpm).</li>
	<li>Inocular 225 mL de 2x YPCD médio com a cultura de 25 mL o/n e verificar a de...

Apesar dos recentes progressos na análise estrutural das proteínas de membrana, nenhuma estrutura 3D para Cdr1, ou qualquer outro transportador PDR, está atualmente disponível. Assim, o conhecimento da estrutura do Cdr1 e suas características bioquímicas é importante, pois isso não só fornecerá insights sobre o desenho racional de novas drogas para superar a resistência a medicamentos mediados pelo efflux, mas também no mecanismo de função de uma importante subfamília das proteínas ABC.
<p class="jove...

A extração de proteínas de membrana integral de seu ambiente lipídico nativo pode afetar drasticamente sua estrutura e função1,2,3,4. A complexa composição lipídica das membranas biológicas5 garante que interações proteína-lipídicas criticamente importantes possam ocorrer6. Os lipídios mantêm a integridade estrutural das proteínas da membrana, permitindo que funcionem corretamente em seu destino de compartimento de membrana7,8. Portanto, um primeiro passo crítico na purificação da proteína da membrana é a extração da proteína de seu ambiente nativo sem afetar sua estrutura e/ou função.
Existem muitos obstáculos para caracterizar a estrutura das proteínas da membrana, a maioria das quais estão relacionadas à sua natureza hidrofóbica, e às dificuldades de expressar proteínas de membrana devidamente dobradas e funcionais nas quantidades necessárias para cristalografia de raios-X ou microscopia crio-elétron (crio-EM)9,10,11,12. Existem três tipos de sistemas de expressão proteica de membrana: homólogo9,heterologos13,14,15, e sistemas de expressão in vitro 16,17. Os níveis de expressão muitas vezes baixos, ou os custos proibitivos, de muitos sistemas de expressão deixam apenas alguns hospedeiros como a opção preferida para produzir proteínas de membrana. Eles incluem o hospedeiro bacteriano, Escherichia coli,as leveduras S. cerevisiae e Pichia pastoris,e maiores eucariotes, como células de insetos Sf9 ou linhas de células mamíferas18. Todas as tecnologias de expressão de proteína de membrana têm vantagens e desvantagens; no entanto, s. cerevisiae é talvez o organismo modelo eucariótico mais bem estudado adequado para a produção de proteínas de membrana. É altamente versátil com aplicações em engenharia genética, descoberta de medicamentos, biologia sintética e expressão de proteínas de membrana eucariótica14,19,20,21.
Neste estudo, foi utilizada uma tecnologia patenteada de expressão de proteína de membrana S. cerevisiae 21, com S. cerevisiae ADΔ14 e ADΔΔ22 como os hosts preferidos (Figura 1A),para superexpressar e estudar a principal bomba C. albicans multidrug efflux Cdr1. Ambas as cepas de S. cerevisiae são derivados de AD1-8u- 23 que têm os genes ura3 (ADΔ) ou ambos os genes ura3 e his1 (ADΔΔ) excluídos para eliminar quaisquer falsos transformadores de uracil positivo ou prototrótroes de histidina surgidos através da integração indesejada no URA3 ou no loci genômico HIS1. A exclusão das 7 principais bombas de efflux multidroug23, indicada na Figura 1A, torna ADΔΔ requintadamente sensível à maioria dos xenobióticos. O fator de transcrição mutante de ganho de função Pdr1-3 causa a superexpressão constitutiva de proteínas de membrana heterologos, como o Cdr1 (octógonos vermelhos na Figura 1A) após a integração do de transformação heterologous-ORF(Figura 1A) no lócus PDR5 genômico (retângulo azul na Figura 1A)através de dois eventos de recombação homologous. A localização adequada da membrana plasmática de proteínas etiquetadas C-terminally mGFPHis podem ser confirmadas por microscopia confocal(Figura 1A),e a sua tag pode ser usada para purificação de afinidade de níquel da proteína marcada. A clonagem de alguns transportadores fúngicos do ABC (por exemplo, Candida krusei ABC1) em plasmídeos derivados do pABC3, no entanto, não foi possível porque eles não poderiam ser propagados em Escherichia coli devido à toxicidade celular. Isso levou ao desenvolvimento da clonagem de uma etapa das proteínas de membrana14,24 marcadas em seu N ou C-terminus com várias etiquetas de afinidade, epítope ou repórter diretamente em S. cerevisiae ADΔΔ(Figura 1C). S. cerevisiae As cepas ADΔ Δ que expressam demais vários mutantes CDR1 também podem ser criadas de forma eficiente, usando até cinco fragmentos de PCR individuais que se sobrepõem a 25 bp(Figura 1C). Empregando este protocolo, muitos ORFs de interesse podem ser clonados, expressos e caracterizados a baixo custo e com alta eficiência em um período de tempo muito curto. A eficiência de transformação reduz apenas ~2 vezes a cada fragmento adicional de PCR.
Se desejar, os níveis de expressão também podem ser facilmente manipulados pelo design primer para ajustar previsivelmente os níveis de expressão para qualquer lugar entre 0,1%-50% dos níveis de expressão geralmente altos e constitutivos25. O vetor de clonagem de derivativo otimizado, multifuncional, pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contém um site de decote protease HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), um protease que tem melhor desempenho a 4 °C do que o vírus da trava de tabaco (TEV)27. L é um linker de proteína de aminoácido (GSGGS), mGFP é um mutante monomédico (A206K)28,29 versão da variante de proteína de fluorescência verde-fluorescência aprimorada yEGFP330, e Seu é um linker de três aminoácidos (GGS) seguido pela tag de purificação de proteína de níquel-afinidade de seis histidinas (HHHHHHHHH).
Esta tecnologia de expressão tem sido usada com sucesso na descoberta de medicamentos e no estudo de proteínas de membrana. A primeira estrutura para um alvo fúngico de azole, S. cerevisiae Erg1131,foi resolvida usando essa tecnologia. Também possibilitou a caracterização detalhada de C. albicans Cdr132,33,34 e a criação de uma molécula Cdr1 deficiente de cisteína35 adequada para estudos de cisteína-transligação para verificar qualquer futura estrutura de alta resolução. Muitos outros transportadores abc de grandes patógenos fúngicos humanos (ou seja, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei, e o complexo de espécies Fusarium solani) também foram estudados em detalhes usando esta plataforma de expressão24,36,37,38,39. Isso permitiu a geração de um painel de cepas de S. cerevisiae superexpressando bombas efflux que tem sido usada em telas de alto rendimento para descobrir o novo substrato de bomba efflux fluorescente Nilo vermelho40 e específico41 e de amplo espectro14,33,42,43,44 inibidores da bomba efflux. O uso deste sistema também possibilitou a descoberta da clorgyline como o primeiro de seu tipo inibidor de bomba de efflux de amplo espectro de amplo espectro42.
A solubilização completa das proteínas da membrana e a criação de uma preparação homogênea de proteína-micelle de membrana homogênea desprovida de lipídios endógenos, requer altas concentrações de detergente45. Mas, infelizmente, isso também muitas vezes inativa a proteína da membrana5,8,45,46. As propriedades dos monômeros detergentes e sua agregação em solução são afetadas pelas propriedades físicas da cauda hidrofóbica, pelo comprimento e ramificação da cadeia de alquila, pela presença de um núcleo aromático ou cadeia lateral fluoroalquila, ou pelo número de unidades de polioxileno. Assim, a triagem de detergentes é um importante primeiro passo para determinar o detergente mais adequado para solubilização e purificação de proteínas de membrana.
C. albicans é um grande patógeno fúngico humano de indivíduos imunocomprometidos que podem causar infecções invasivas graves e fatais47, e pode se tornar resistente a drogas antifúngicasazole 48,49. Um dos principais mecanismos da resistência multidrogas c. albicans é a superexpressão do Cdr150, que é um carregador de ligação ATP tipo II (ABC)51 da subfamília ABCG localizada na membrana plasmática. Os transportadores de FUNG em tamanho real (consistindo em dois domínios de ligação nucleotídeos [NBDs] e dois domínios transmembranos [TMDs]) são mais conhecidos como transportadores de resistência a medicamentos pleiotrópicos (PDR) e são caracterizados por sua topologia de domínio invertida única [NBD-TMD]2. Os transportadores de PDR só são encontrados nas plantas52,53 e fungos54. Apesar de sua importância, não há estruturas para transportadores de PDR, embora as estruturas para transportadores humanos de médio porte ABCG tenham sido recentemente resolvidas, o que ajudou a criar o primeiro modelo provisório para o Cdr133. Nossas recentes evidências experimentais sugerem, no entanto, que este modelo é falho possivelmente porque os transportadores Fúngicos de PDR têm NBDs assimétricos característicos resultando muito possivelmente em um mecanismo de transporte único. Uma estrutura de alta resolução do Cdr1 é, portanto, necessária tanto para o desenho racional de novos inibidores da bomba efflux que podem ajudar a superar a resistência a medicamentos mediados pela Efflux, quanto para fornecer insights sobre o mecanismo de ação desta importante família de transportes ABC.
O objetivo deste estudo foi desenvolver protocolos confiáveis para a expressão, solubilização e purificação do Cdr1 no hospedeiro de expressão S. cerevisiae geneticamente modificado, com o objetivo final de obter uma estrutura de alta resolução para o Cdr1. Como parte desse processo, uma tag dupla mGFPHis(Figura 1B)foi projetada com um linker de 16 resíduos separando a tag do C-terminus do Cdr1, que melhorou a ligação do 6x anexado Sua etiqueta de afinidade com a resina de afinidade de níquel e permitiu o monitoramento dos níveis de expressão cdr1 em células vivas e durante todo o processo de purificação. Também foi desenvolvido um protocolo reprodutível para preparações de proteína de membrana plasmática de levedura de pequena escala contendo cerca de 10% de C. albicans Cdr1 (como estimado pela coloração de Coomassie após a SDS-PAGE), que poderia ser usado para a caracterização bioquímica do Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

A caracterização bioquímica e biofísica bem sucedida dos transportadores abc depende fortemente da escolha do sistema de expressão heteróloga. Nas últimas duas décadas, desenvolvemos uma plataforma de expressão de proteína de membrana de levedura que tem sido usada para estudar muitas proteínas importantes da membrana fúngica. A expressão host Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ é excluída em sete grandes transportadores endógenos ABC e contém o fator de transcrição Pdr1-3 com uma mutação de ganho de função que permite a superexpressão constitutiva de genes heterologos de proteína de membrana stably integrados como cópias únicas no lócus PDR5 genômico. A criação de vetores plasmídeos versáteis e a otimização de estratégias de clonagem de uma etapa permite a clonagem rápida e precisa, mutagênese e expressão de transportadores heterologos do ABC. Aqui, descrevemos o desenvolvimento e o uso de uma nova tag dupla mGFPHIs de protease-cleavable (ou seja, a levedura monomérica aprimida proteína fluorescente verde yEGFP3 fundida a uma etiqueta de purificação de afinidade de seis histidinas) que foi projetada para evitar possíveis interferências da tag com a proteína de interesse e aumentar a eficiência vinculante da Sua tag para resinas de afinidade de níquel. A fusão de mGFPHis à proteína de membrana ORF (quadro de leitura aberta) permite a fácil quantificação da proteína por meio da inspeção de géis de poliacrilamida e detecção de produtos de degradação que retêm a tag mGFPHis. Demonstramos como essa característica facilita o rastreamento de detergente para solubilização de proteínas de membrana. Um protocolo para o isolamento eficiente, rápido e confiável das preparações de membrana plasmática em pequena escala do C-terminal marcado Candida albicans multirug efflux transporter Cdr1 superexpresso em S. cerevisiae ADΔ Δ, é apresentado. Este protocolo de isolamento da membrana plasmática de pequena escala gera membranas plasmáticas de alta qualidade dentro de um único dia útil. As preparações da membrana plasmática podem ser usadas para determinar as atividades enzimáticas das variantes mutantes Cdr1 e Cdr1.

Uma alta frequência de transformação de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformadores/μg) foi alcançada com pYES2(Figura 2B). Como esperado, o controle no DNA (ou seja, apenas ddH2O) não deu transformadores, e 1 μg do cdr1linear - de transformaçãomGFPHis (Figura 1A) deu ~50 transformadores(Figura 2C) com o protocolo otimizado de transformação ADΔΔ. Os transformadores <em...

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Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Este artigo apresenta um protocolo de isolamento de membrana plasmática de pequena escala para a caracterização da proteína Cdr1 (cassete de ligação ATP) da Candida ABC (fita adesão a ATP), superexpressa em Saccharomyces cerevisiae. Uma mGFPC terminal de protease com um linker de 16 resíduos entre o Cdr1 e a tag foi projetada para facilitar a purificação e o detergente-triagem do Cdr1.

Preparação de membrana plasmática em pequena escala para a análise de cânbicas cânbicas cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

O protocolo de isolamento da membrana plasmática em pequena escala e mGFPHis double tag, fornecem um método econômico, rápido, confiável e fácil para caracterizar proteínas de membrana no organismo modelo eucariótico, Saccharomyces cerevisiae. A maior vantagem dessa tecnologia é a facilidade e velocidade com que os níveis de expressão da proteína da membrana, as atividades da ATP e o detergente são mais adequados para sua purificação podem ser determinados. Esta tecnologia é muito amigável.No entanto, um ponto importante a ser lembrado é a colheita de células como OD 600 de 2, o que garante baixa contaminação mitocondrial e as atividades mais altas possíveis de ATPase. Comece pré-culminando uma única colônia de leveduras em 10 mililitros de YPD médio a 30 graus Celsius por sete a oito horas a 200 rotações por minuto. Use 10 mililitros de pré cultura para inocular 40 mililitros de meio YPD fresco.Em seguida, incubar as células a 30 graus Celsius durante a noite a 200 rotações por minuto até que a densidade celular atinja um OD 600 de um a três. No dia seguinte, colhem 40 unidades de densidade óptica, ou ODU, de células faciais logarítmicas por centrifugação a 4.200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Re suspenda e lave as células com 40 mililitros de gelo frio estéril água dupla destilada.Repita a lavagem usando um mililitro de água gelada com centrifugação entre as etapas de lavagem. Suspenda a pelota em um mililitro de água estéril gelada e transfira a suspensão celular para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro pré-resfriado no gelo. Células de colheita a 3.300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.Aspire o supernatante e suspenda a pelota celular em 500 microliters de tampão homogeneizador recém-suplementado com um fluoreto de sulfa de metila de fenal de mililitro Neal, ou PMSF. Armazene a suspensão do celular a menos 80 graus Celsius até que use mais. Descongele as células no gelo por aproximadamente uma hora.Em seguida, adicione contas de sílica geladas de 0,5 milímetros de diâmetro aos 500 microliters da suspensão celular para atingir um volume total de um mililitro. Para quebrar as células, o vórtice suspende a suspensão celular em intensidade máxima de agitação por um minuto, durante seis ciclos, com um período de resfriamento de três minutos no gelo após cada ciclo. Após o vórtice, faça um fino orifício na parte inferior do tubo com uma lâmina de bisturi aquecida e colete a célula quebrada homogeneizar em outro tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro gelado com um giro de baixa velocidade por 10 segundos.Centrifugar a célula coletada homogeneizar a 5.156 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover detritos celulares. Transfira 450 microlitres de supernacidos em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e adicione um mililitro de tampão homogeneizador frio estocido com um PMSF fresco mililitro. Para colher membranas plasmáticas centrifuugar a suspensão celular a 17.968 vezes G por uma hora a quatro graus Celsius.Remova o supernatante e adicione 100 microliters de tampão homogeneizador recém-suplementado com um PMSF milimar. Em seguida, solte a pelota da membrana plasmática mexendo com a ponta de pipeta de 100 microliter e suspenda novamente a pelota repetindo tubos para cima e para baixo. Meça a concentração proteica da preparação da membrana plasmática com um kit de ensaio proteico compatível com tampões contendo o agente redutor e o detergente.Armazene as membranas plasmáticas a menos 80 graus Celsius, ou mantenha-as no gelo para uso imediato. Despeje de quatro a cinco mililitros de gel de separação no aparelho de gel montado até dois centímetros do topo. Coloque cuidadosamente de um a dois mililitros de 0,1% SDS por cima e deixe o gel de poli acrilamida definir por 60 minutos em temperatura ambiente.Após uma hora, remova a camada de 0,1% SDS do gel de separação polimerizado e enxágue o gel com água dupla destilada para remover traços de SDS. Despeje a mistura de gel de empilhamento no gel de separação. Coloque um pente no gel de empilhamento e remova quaisquer bolhas de ar ao redor do pente.Em seguida, deixe o gel de empilhamento definir por 60 minutos à temperatura ambiente. Retire o pente e enxágue as ranhuras de gel com água. Coloque o gel no tanque de gel e encha o tanque de gel até o topo com tampão de corrida.Misture de cinco a 10 microliters de amostras de membrana plasmática com volumes iguais de corante de carga de proteínas duas vezes e carregue imediatamente a mistura de amostras em ranhuras de gel individuais, submersas em tampão de corrida. Carregar marcadores de peso molecular de proteína na faixa de 10 a 245 Kilodalton em um slot separado para permitir a estimativa de tamanho de fragmentos de proteínas individuais. Realize a eletroforese de gel a 200 volts até que o corante azul de carga atinja a parte inferior do gel.Examine o gel para fluorescência GFP em gel com um sistema de imagem de gel. Seguindo as proteínas fluorescentes de fixação de imagem em 10 a 20 mililitros de solução de fixação de gel de proteína por agitação suave do gel por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as duas vezes por 10 minutos com 10 mililitros de água dupla destilada e coloque o gel em 10 mililitros de solução de mancha de Kumasi coloidal com agitação suave por uma hora à temperatura ambiente para visualizar bandas proteicas.Para melhor visualização de bandas proteicas, desperche o gel uma ou duas vezes em 20 mililitros de água dupla destilada por uma hora antes de gravar imagens com o sistema de imagem em gel. Uma alta frequência de transformação de Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta foi alcançada com o controle positivo plasmídeo PS2. Não foram obtidos transformadores Eurocell Prototron para o controle negativo.Cerca de 50 células URA prototrofo CDR1-mGFPHintfomucofoi obtido após incubação de células AD Delta Delta transformadas em placas CSM menos URA por três dias. Petite transformador que não pode crescer em placas de ágar YPG foram eliminados. CDR1-mGHPHis amostras com concentrações variadas foram quantificadas com fluorescência em gel.As intensidades de fluorescência mGFP foram lineares sobre toda a faixa de concentração com fluorescência mínima de fundo. Variando a densidade celular indicou que quebrar 40 ODU de células produziu a mais alta qualidade de membranas plasmáticas com a maior atividade DE ATPase CDR1. No entanto, o rendimento das membranas plasmáticas aumentou proporcionalmente ao aumento das densidades celulares.A capacidade de 31 detergentes com várias propriedades para solubilizar CDR1-mGHPHis de membranas de plasma bruto do Delta delta, células CDR1-mGHPHis foram testadas com a página SDS. Beta e alfa DDM E Fos-choline 13 foram os melhores detergentes para solubilizar CDR1-mGHPHis. No entanto, Fos-choline 13 causa hidrólise parcial de CDR1-mGHPHis.A proteína da membrana plasmática bruta solubilizada com 1%de detergente foi separada usando um superos seis aumentou 10 300 coluna de exclusão do tamanho de GL. Cromatógramas de Maltosides e proteínas extraídas de GNL mostraram a maioria dos CDR1-mGHPHis iludindo como um pico gaussiano bem moldado em 15,5 milímetros CDR1-mGHPHis solubilizado com glicose contendo detergentes aludidos como um pico agregado ou ampla. Os picos mais altos para DDM indicaram que uma grande parte do DMN G solubilizado CDR1-mGHPHis pode ser desnaturado.Nos cromatógramas FSCC para fos-colinas zwitterionic e dois detergentes não iônicos apenas Digitonin e deu um cromatógrafo semelhante ao DDM. Fos-choline 13 deu um pico simétrico em forma afiada, mas aludiu com um volume de elução significativamente menor do que o do DDM. A tag dupla otimizada também melhora o rendimento de purificação e ajudou a determinar a localização, o tráfico e a estabilidade térmica das proteínas de membrana.A tecnologia de expressão heteróloga também pode ser usada na triagem de medicamentos de alto rendimento, e na caracterização detalhada de muitas outras proteínas de membrana.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

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Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biologia

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

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Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

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Protocolo de Produção da novela para em pequena escala Fabricação de alimentos fermentados probióticos

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Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

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The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

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Perfil em todo o genoma das interações de vinculação fator de transcrição-DNA em albicanos candida: um método abrangente CUT&amp;RUN e fluxo de trabalho de análise de dados

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...