Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Авторы с благодарностью отмечают финансирование из Новозеландского фонда Марсдена (грант UOO1305) и блочный грант от медицинского факультета Университета Чулалонгкорн, Бангкок, Таиланд (М. Ниими). Они хотели бы поблагодарить Университет Отаго за предоставление Г. Мадани стипендии PhD. Авторы также хотели бы выразить свою благодарность профессору Штефану Раунсеру и его коллегам, доктору Амиру Апельбауму и доктору Дейванаягабарати Винаягаму, за их поддержку и руководство во время 6-месячного визита Г. Мадани в Институт молекулярной физиологии Макса Планка (MPIMP), Дортмунд, Германия. Авторы также благодарят Немецкую службу академических обменов (DAAD) за предоставление Г. Мадани исследовательского гранта (57381332) для посещения MPIMP.

1. Подготовка свежих или замороженных запасов трансформационных компетентных ADΔ и ADΔΔ клеток
<ol><li>Инокулировать 25 мл 2x YPCD [т.е. 2x YPD; 2% (мас./об.) дрожжевого экстракта, 2% (мас./об.) пептона, 4% (мас./об.) декстрозы), 0,079% (мас./об.) CSM (полная смесь добавок)]35 среды с одной дрожжевой колон?...

Несмотря на недавний прогресс в структурном анализе мембранных белков, в настоящее время нет 3D-структуры для Cdr1 или любого другого транспортера PDR. Таким образом, получение знаний о структуре Cdr1 и ее биохимических особенностях важно, поскольку это не только даст представление о рациона...

Извлечение интегральных мембранных белков из их родной липидной среды может резко повлиять на их структуру и функцию1,2,3,4. Комплексный липидный состав биологических мембран5 обеспечивает возможность критически важных белково-липидных взаимодействий6. Липиды поддерживают структурную целостность мембранных белков, что позволяет им правильно функционировать в своем мембранном отсеке назначения (назначениях)7,8. Поэтому критическим первым шагом в очистке мембранного белка является извлечение белка из его родной среды без влияния на его структуру и / или функцию.
Существует множество препятствий для характеристики структуры мембранных белков, большинство из которых связаны с их гидрофобной природой, а также трудностями экспрессии правильно свернутых и функциональных мембранных белков в количествах, необходимых для рентгеновской кристаллографии или криоэлектроновой микроскопии (крио-ЭМ)9,10,11,12. Существует три типа мембранных белковых экспрессии систем: гомологичные9,гетерологичные13,14,15и системы экспрессии in vitro 16,17. Часто низкие уровни экспрессии или непомерно низкие затраты многих систем экспрессии оставляют только несколько хозяев в качестве предпочтительного варианта для производства мембранных белков. Они включают бактериального хозяина, Escherichia coli,дрожжи S. cerevisiae и Pichia pastorisи высшие эукариоты, такие как клетки насекомых Sf9 или клеточные линии млекопитающих18. Все технологии экспрессии мембранных белков имеют свои преимущества и недостатки; однако S. cerevisiae является, пожалуй, наиболее изученным эукариотическим модельным организмом, пригодным для производства мембранного белка. Он очень универсален с приложениями в генной инженерии, открытии лекарств, синтетической биологии и экспрессии белков эукариотической мембраны14,19,20,21.
В этом исследовании была использована запатентованная технология экспрессии мембранного белка S. cerevisiae 21, с S. cerevisiae ADΔ14 и ADΔΔ22 в качестве предпочтительных хозяев(фиг.1A),для сверхэкспрессии и изучения основного мультилекарственного эффлюксного насоса Cr1. Оба штамма S. cerevisiae являются производными AD1-8u-23, которые имеют либо ura3 (ADΔ), либо оба гена ura3 и his1 (ADΔΔ), удаленные для устранения любых ложноположительных прототрофных трансформантов урацила или гистидина, возникающих в результате нежелательной интеграции в геномных локусах URA3 или HIS1. Удаление 7 основных мультилекарственных эффлюксных насосов23,указанных на фиг.1A, делает ADΔΔ чрезвычайно чувствительным к большинству ксенобиотиков. Мутантный транскрипционный фактор усиления функции Pdr1-3 вызывает конститутивную сверхэкспрессию гетерологичных мембранных белков, таких как Cdr1 (красные восьмиугольники на фиг.1A)после интеграции гетерологично-ORF-содержащей кассеты трансформации(рисунок 1A)в геномном локусе PDR5 (синий прямоугольник на фиг.1A)посредством двух гомологичных событий рекомбинации. Правильная локализация плазматической мембраны С-концевых mGFPHis помеченных белков может быть подтверждена конфокальной микроскопией(рисунок 1А),а метка His может быть использована для никель-аффинной очистки помеченного белка. Однако клонирование некоторых грибковых транспортеров ABC (например, Candida krusei ABC1)в плазмиды, полученные из pABC3, было невозможным, поскольку они не могли быть распространены в кишечной палочке из-за клеточной токсичности. Это побудило к разработке одноэтапного клонирования мембранных белков14,24, помеченных либо на их N-, либо на C-конце с различным сродством, эпитопом или репортерными метками непосредственно в S. cerevisiae ADΔΔ(рисунок 1C). S. cerevisiae Штаммы ADΔΔ, чрезмерно экспрессирующие различные мутанты CDR1, также могут быть эффективно созданы таким образом, используя до пяти отдельных фрагментов ПЦР, которые перекрываются на 25 bp(рисунок 1C). Используя этот протокол, многие интересующие ORF могут быть клонированы, выражены и охарактеризованы с низкой стоимостью и высокой эффективностью в течение очень короткого промежутка времени. Эффективность трансформации снижается всего в ~2 раза с каждым дополнительным фрагментом ПЦР. 
При желании уровнями выражений также можно легко манипулировать с помощью праймерного дизайна, чтобы предсказуемо настроить уровни выражений до 0,1%-50% от обычно высоких, конститутивных уровней выражения25. Оптимизированный, многофункциональный вектор клонированияpABC3 14, pABC3-XLmGFPHis26 (рисунок 1B)содержит участок расщепления протеазы HRV-3C (X; ЛЕВЛЬФК| GP), протеаза, которая работает лучше при 4 ° C, чем часто используемая протеаза вируса травля табака (TEV)27. L представляет собой линкер с пятью аминокислотами (GSGGS), mGFP представляет собой мономерный мутант (A206K)28,29 версию дрожжевого усиленного зеленофлуоресцентного варианта белка yEGFP330,а His представляет собой трехаломиновый линкер (GGS), за которым следует шестигистидинная (HHHHHH) никель-аффинная белковая очистка метка.
Эта технология экспрессии была успешно использована в открытии лекарств и изучении мембранных белков. Первая структура грибкового азолового препарата-мишени, S. cerevisiae Erg1131,была решена с использованием этой технологии. Это также позволило детально охарактеризовать C. albicans Cdr132, 33,34и создать молекулу Cdr1с дефицитом цистеина35, подходящую для исследований сшивания цистеина для проверки любой будущей структуры с высоким разрешением. Многие другие abc-транспортеры из основных грибковых патогенов человека (например, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei и видовой комплекс Fusarium solani) также были подробно изучены с использованием этой платформы экспрессии24,36,37,38,39. Это позволило создать панель штаммов S. cerevisiae, чрезмерно экспрессирующих эфлюксные насосы, которые были использованы в высокопроизводительных экранах, чтобы обнаружить новую флуоресцентную подложку эфлюксного насоса Nile red40 и 41 и широкого спектра действия ингибиторов эфлюксного насоса14,33,43,44. Использование этой системы также позволило обнаружить клоргилин в качестве первого в своем роде грибкового ингибитора мультилекарственного эфлюксного насоса широкого спектра действия42.
Полная солюбилизация мембранных белков и создание однородного мембранного белково-мицеллевого препарата, лишенного эндогенных липидов, требует высоких концентраций детергентов45. Но, к сожалению, это также часто инактивирует мембранный белок5,8,45,46. На свойства моющих мономеров и их агрегацию в растворе влияют физические свойства гидрофобного хвоста, длина и ветвление алкильной цепи, наличие ароматического ядра или фторалкильной боковой цепи или количество полиоксиэтиленовых единиц. Таким образом, скрининг моющих средств является важным первым шагом для определения наиболее подходящего моющего средства для солюбилизации и очистки мембранного белка.
C. albicans является основным грибковым патогеном человека лиц с ослабленным иммунитетом, который может вызывать серьезные, опасные для жизни инвазивные инфекции47,и он может стать устойчивым к азоловым противогрибковым препаратам48,49. Одним из основных механизмов мультилекарственности C. albicans является сверхэкспрессия Cdr150,который является ПЕРЕНОСЧИКОМ51 подсемейства ABCG типа II, расположенным в плазматической мембране. Полноразмерные грибковые транспортеры ABCG (состоящие из двух нуклеотидсвязывающих доменов [NBD] и двух трансмембранных доменов [TMD]) более известны как переносчики плейотропной лекарственной устойчивости (PDR) и характеризуются их уникальной инвертированной доменной топологией [NBD-TMD]2. Транспортеры PDR встречаются только в растениях52,53 и грибах54. Несмотря на их важность, нет никаких конструкций для транспортеров PDR, хотя недавно были решены конструкции для транспортеров ABCG половинного размера, что помогло создать первую предварительную модель для Cdr133. Однако наши недавние экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эта модель является ошибочной, возможно, потому, что грибковые транспортеры PDR имеют характерные асимметричные NBD, что, вполне возможно, приводит к уникальному транспортному механизму. Таким образом, структура Cdr1 с высоким разрешением необходима как для рационального проектирования новых ингибиторов эфлюксного насоса, которые могут помочь преодолеть опосредованную из потоком лекарственную устойчивость, так и для понимания механизма действия этого важного семейства транспортеров ABC.
Целью данного исследования была разработка надежных протоколов экспрессии, солюбилизации и очистки Cdr1 в генетически модифицированном хозяине экспрессии S. cerevisiae с конечной целью получения структуры высокого разрешения для Cdr1. В рамках этого процесса была разработана протеазно-расщепляемая двойная метка mGFPHis(рисунок 1B)с 16-остаточной линкером, отделяющей метку от C-конца Cdr1, что улучшило связывание прикрепленной 6x его метки сродства с никелем-аффинной смолой и позволило контролировать уровни экспрессии Cdr1 в живых клетках и во время всего процесса очистки. Также был разработан воспроизводимый протокол для мелкомасштабных дрожжевых препаратов белка плазматической мембраны, содержащих около 10% C. albicans Cdr1 (по оценкам окрашивания Кумасси после SDS-PAGE), который может быть использован для биохимической характеристики Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

Успешная биохимическая и биофизическая характеристика АВС-транспортеров в значительной степени зависит от выбора гетерологии системы экспрессии. За последние два десятилетия мы разработали платформу экспрессии белка дрожжевой мембраны, которая использовалась для изучения многих важных белков грибковых мембран. Экспрессия хозяина Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ удалена в семи основных эндогенных переносчиках ABC и содержит транскрипционный фактор Pdr1-3 с мутацией усиления функции, которая позволяет конститутивную сверхэкспрессию генов гетерологийного мембранного белка, стабильно интегрированных в виде одиночных копий в геномном локусе PDR5. Создание универсальных плазмидных векторов и оптимизация одноэтапных стратегий клонирования позволяет быстро и точно клонировать, мутагенез и экспрессию гетерологийных ABC-транспортеров. Здесь мы описываем разработку и использование новой протеазно-расщепляемой двойной метки mGFPHis (т.е. мономерного дрожжевого усиленного зеленого флуоресцентного белка yEGFP3, сплавленного с шестигистидиновой меткой очистки с аффинностью), которая была разработана, чтобы избежать возможного вмешательства метки в интересующий белок и повысить эффективность связывания метки His с никель-аффинными смолами. Слияние mGFPHis с мембранным белком ORF (открытая рамка считывания) позволяет легко количественно оценить белок путем проверки полиакриламидных гелей и обнаружения продуктов деградации, сохраняющих метку mGFPHis. Мы демонстрируем, как эта функция облегчает скрининг моющих средств для солюбилизации мембранного белка. Представлен протокол эффективной, быстрой и надежной изоляции мелкомасштабных плазматических мембранных препаратов C-терминально помеченного мультилекарственного транспортера излияния Candida albicans Cdr1, переэкспрессированного в S. cerevisiae ADΔΔ. Этот маломасштабный протокол изоляции плазматических мембран генерирует высококачественные плазматические мембраны в течение одного рабочего дня. Препараты плазматической мембраны могут быть использованы для определения ферментной активности мутантных вариантов Cdr1 и Cdr1.

Высокая частота превращения S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 трансформантов/мкг) была достигнута с помощью pYES2(рисунок 2B). Как и ожидалось, управление без ДНК (т.е.толькоddH 2 O) не давало трансформаторов, а 1 мкг линейной кассеты преобразования CDR1-mGFPHis (?...

Watch this Scientific Journal Video about Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis at JoVE.com

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

В данной статье представлен маломасштабный протокол изоляции плазматической мембраны для характеристики белка Candida albicans ABC (АТФ-связывающая кассета) Cdr1, сверхэкспрессированного в Saccharomyces cerevisiae. Расщепленная протеаза C-концевая двойная метка mGFPHis с 16-остатчным линкером между Cdr1 и меткой была разработана для облегчения очистки и моющего скрининга Cdr1.

Маломасштабная плазматическая мембранная подготовка для анализа Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Протокол изоляции плазматической мембраны малого масштаба и двойная метка mGFPS обеспечивают экономичный, быстрый, надежный и простой метод характеристики мембранных белков в эукариотическом модельном организме Saccharomyces cerevisiae. Самым большим преимуществом этой технологии является легкость и скорость, с которой можно определить уровни экспрессии мембранного белка, активность АТФ и моющее средство, наиболее подходящее для их очистки. Эта технология очень удобна для пользователя.Тем не менее, одним из важных моментов, который следует помнить, является сбор клеток в виде OD 600 из 2, что обеспечивает низкое митохондриальное загрязнение и максимально возможную активность АТФазы. Начните с предварительного культивирования одной колонии дрожжей в 10 миллилитрах среды YPD при 30 градусах Цельсия в течение семи-восьми часов при 200 оборотах в минуту. Используйте 10 миллилитров предварительной культуры для прививки 40 миллилитров свежей среды YPD.Затем инкубируют клетки при 30 градусах Цельсия в течение ночи со скоростью 200 оборотов в минуту, пока плотность клеток не достигнет OD 600 от одного до трех. На следующий день собирают 40 единиц оптической плотности, или ODU, логарифмических лицевых клеток путем центрифугирования со скоростью 4, 200 раз G в пять минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендировать и промыть клетки 40 миллилитрами ледяной холодной стерильной двойной дистиллированной воды.Повторите промывку с использованием одного миллилитра ледяной холодной воды с центробежизацией между этапами промывки. Повторно суспендировать гранулу в одном миллилитрах ледяной холодной стерильной воды и переложить клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, предварительно охлажденный на льду. Собирайте клетки в 3 300 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.Аспирировать надосадочный и повторно суспендировать клеточную гранулу в 500 микролитрах гомогенизирующего буфера, только что дополненного одним миллимолярным феналом метилсульфамидного фторида Нила, или PMSF. Храните клеточную суспензию при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Разморозить клетки на льду примерно на один час.Затем добавьте ледяные холодные шарики кремнезема диаметром 0,5 миллиметра к 500 микролитрам клеточной суспензии, чтобы достичь общего объема в один миллилитр. Чтобы сломать клетки, вихрь клеточной суспензии с максимальной интенсивностью встряхивания в течение одной минуты, в течение шести циклов, с трехминутным периодом охлаждения на льду после каждого цикла. После вихря сделайте тонкое отверстие в нижней части трубки с нагретым лезвием скальпеля и соберите разбитую ячейку гомогената в другую ледяную холодную 1,5-миллилитровую микроцентрифугу с низкой скоростью вращения в течение 10 секунд.Центрифугировать собранный гомогенат клеток в 5, 156 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для удаления клеточного мусора. Переложите 450 микролитров супернатанта в ледяную холодную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и добавьте один миллилитр гомогенизирующего буфера ледяного холода, дополненного одним миллимолярным свежим PMSF. Для сбора плазматических мембран центрифугируют клеточную суспензию в 17,968 раз G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.Удалите супернатант и добавьте 100 микролитров гомогенизирующего буфера, только что дополненного одним миллимоляром PMSF. Затем ослабьте гранулу плазматической мембраны, перемешав с помощью 100-микролитрового наконечника пипетки, и повторно приостановите гранулу путем повторного пипетирования вверх и вниз. Измерьте концентрацию белка препарата плазматической мембраны с помощью набора для анализа белка, совместимого с буферами, содержащими восстановительный агент и моющее средство.Храните плазматические мембраны при температуре минус 80 градусов по Цельсию или храните их на льду для немедленного использования. Налейте четыре-пять миллилитров разделительного геля в собранный гель-аппарат на высоте до двух сантиметров от верха. Аккуратно наложите сверху один-два миллилитра 0,1% SDS и дайте полиакриламидного геля застыть в течение 60 минут при комнатной температуре.Через час удалите слой 0,1% SDS из полимеризованного разделительного геля и промойте гель двойной дистиллированной водой, чтобы удалить следы SDS. Налейте смесь геля для укладки на разделительные гели. Поместите расческу в гель для укладки и удалите пузырьки воздуха вокруг гребня.Затем дайте укладывать гель в течение 60 минут при комнатной температуре. Снимите расческу, а затем промойте гелевые пазы водой. Поместите гель в гель-резервуар и заполните гель-резервуар сверху бегущим буфером.Смешайте от пяти до 10 микролитров образцов плазматической мембраны с равными объемами, в два раза превышающим загрузку белка красителя, и немедленно загрузите смесь образцов в отдельные гелевые щели, погруженные в работающий буфер. Загрузите маркеры молекулярной массы белка в диапазоне от 10 до 245 килодальтонов в отдельный слот, чтобы можно было оценить размер отдельных фрагментов белка. Выполняют гель-электрофорез на 200 вольт до тех пор, пока синий нагрузочный краситель не достигнет дна геля.Изучите гель на флуоресценцию GFP с помощью гелевой системы визуализации. После флуоресцентной визуализации фиксируют белки в 10-20 миллилитрах раствора для фиксации белкового геля путем мягкого перемешивания геля в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем дважды промыть в течение 10 минут 10 миллилитрами двойной дистиллированной воды и поместить гель в 10 миллилитров коллоидного раствора для окрашивания Кумаси с нежным встряхиванием в течение одного часа при комнатной температуре для визуализации белковых полос.Для улучшения визуализации белковых полос окрасить гель один или два раза в 20 миллилитрах двойной дистиллированной воды в течение одного часа перед записью изображений с помощью системы визуализации геля. Высокая частота трансформации Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta была достигнута с положительной управляют плазмидой PS2. Прототронные трансформанты Eurocell для отрицательного контроля получены не было.Около 50 прототрофных cdR1-mGFPHis трансформантов URA клеток были получены после инкубации трансформированных клеток AD Delta Delta на пластинах CSM минус URA в течение трех дней. Миниатюрный трансформант, который не может расти на агаровых пластинах YPG, был устранен. Образцы CDR1-mGHPHis с различными концентрациями количественно оценивали с помощью флуоресценции в гегле.Интенсивность флуоресценции mGFP была линейной во всем диапазоне концентраций с минимальной фоновой флуоресценцией. Изменение плотности клеток показало, что разрушение 40 ODU клеток дало самое высокое качество плазматических мембран с самой высокой активностью CDR1 ATPase. Однако выход плазматических мембран увеличивался пропорционально увеличению плотности клеток.Способность 31 моющего средства с различными свойствами солюбилизировать CDR1-mGHPHis из сырых плазматических мембран клеток AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis была проверена с помощью страницы SDS. Бета и альфа DDM и Fos-холин 13 были лучшими моющими средствами для солюбилизации CDR1-mGHPHis. Однако Фос-холин 13 вызывает частичный гидролиз CDR1-mGHPHis.Сырой белок плазматической мембраны, солюбилизированный 1% моющим средством, отделяли с помощью суперос-шестерки увеличенной на 10 300 GL колонки исключения размера. Хроматограммы мальтозидов и LMNG-экстрагированных белков показали, что большинство CDR1-mGHPХи ускользают от пика Гаусса красивой формы при 15,5 миллиметрах CDR1-mGHPHis, солюбилизированные глюкозосодержащими моющими средствами, называемыми агрегированным или широким агрегированным пиком. Более высокие пики для DDM показали, что большая часть солюбилизированного DMN G CDR1-mGHPHis может быть денатурирована.В FSCC хроматограммах для цвиттерионических Fos-холинов и двух неионных детергентов только Digitonin и давали аналогичную хроматограмму DDM. Фос-холин 13 давал симметричный пик острой формы, но он упоминался со значительно меньшим объемом элюдения, чем у DDM. Оптимизированная двойная метка также улучшает выход очистки и помогает определить локализацию, торговлю и термическую стабильность мембранных белков.Технология гетерологийной экспрессии также может быть использована при высокопроизводительном скрининге лекарств и детальной характеристике многих других мембранных белков.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Малая ядерная Экстракты для функционального анализов экспрессии генов Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Изображений с плазменным Мембрана Деформации С pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Novel Production Protocol for Small-scale Manufacture of Probiotic Fermented Foods

Новый протокол Продукция для мелкосерийного производства пробиотических ферментированных продуктов

A novel dried bacterial consortium of Lactobacillus rhamnosus yoba 2012 and Streptococcus thermophilus C106 is cultured in 1 L of milk. This fresh starter ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Подготовка проб для анализа Масс-цитометрии

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Определение плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Характеристика MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Пробоподготовки для анализа на основе масс спектрометрии Proteomics глазной микрососудов

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Геномное профилирование транскрипционно-ДНК-связывающих взаимодействий в Candida albicans: комплексный метод CUT&amp;RUN и рабочий процесс анализа данных

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...