Name: small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00
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Los autores agradecen la financiación del Fondo Marsden de Nueva Zelanda (Subvención UOO1305), y una subvención en bloque de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia (M. Niimi). Desean agradecer a la Universidad de Otago por proporcionar a G. Madani una beca de doctorado. Los autores también desean expresar su gratitud al profesor Stefan Raunser y sus colegas, el Dr. Amir Apelbaum y el Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, por su apoyo y supervisión durante una visita de 6 meses de G. Madani al Instituto Max Planck de Fisiología Molecular (MPIMP), Dortmund, Alemania. Los autores también agradecen al Servicio Alemán de Intercambio Académico (DAAD) por proporcionar a G. Madani una beca de investigación (57381332) para visitar el MPIMP.

1. Preparación de existencias frescas o congeladas de células ADΔ y ADΔΔ competentes para la transformación
<ol><li>Inocular 25 ml de 2x YPCD [es decir, 2x YPD; 2% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de peptona, 4% (p/v) dextrosa), 0,079 % (p/v) CSM (mezcla completa de suplemento)]35 medio con una sola colonia de levadura e incubar durante la noche (o/n) durante 16 h a 30 °C con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm).</li>
	<li>Inocular 225 mL de 2x medio YPCD con el cultivo d...

A pesar del progreso reciente en el análisis estructural de proteínas de membrana, actualmente no se dispone de una estructura 3D para Cdr1, o cualquier otro transportador PDR. Por lo tanto, obtener conocimiento de la estructura de Cdr1 y sus características bioquímicas es importante, ya que esto no solo proporcionará información sobre el diseño racional de nuevos medicamentos para superar la resistencia a los medicamentos mediada por el eflujo, sino también sobre el mecanismo de función de una importante subfam...

La extracción de proteínas de membrana integral de su entorno lipídico nativo puede afectar dramáticamente su estructura y función1,2,3,4. La compleja composición lipídica de las membranas biológicas5 asegura que puedan ocurrir interacciones proteína-lípido de importancia crítica6. Los lípidos mantienen la integridad estructural de las proteínas de membrana, lo que les permite funcionar correctamente en su(s) destino(s) compartimental(es) de membrana7,8. Por lo tanto, un primer paso crítico en la purificación de proteínas de membrana es la extracción de la proteína de su entorno nativo sin afectar su estructura y / o función.
Existen muchos obstáculos para caracterizar la estructura de las proteínas de membrana, la mayoría de los cuales están relacionados con su naturaleza hidrofóbica, y las dificultades de expresar proteínas de membrana correctamente plegadas y funcionales en las cantidades requeridas para la cristalografía de rayos X o la microscopía crio-electrónica (crio-EM)9,10,11,12. Existen tres tipos de sistemas de expresión de proteínas de membrana:homólogos 9,heterólogos13,14,15y sistemas de expresión in vitro 16,17. Los niveles de expresión a menudo bajos, o los costos prohibitivos, de muchos sistemas de expresión dejan solo unos pocos huéspedes como la opción preferida para producir proteínas de membrana. Incluyen el huésped bacteriano, Escherichia coli,las levaduras S. cerevisiae y Pichia pastoris,y eucariotas superiores como las células de insectos Sf9 o las líneas celulares de mamíferos18. Todas las tecnologías de expresión de proteínas de membrana tienen ventajas y desventajas; sin embargo, S. cerevisiae es quizás el organismo modelo eucariota mejor estudiado adecuado para la producción de proteínas de membrana. Es altamente versátil con aplicaciones en ingeniería genética, descubrimiento de fármacos, biología sintética y la expresión de proteínas de membrana eucariota14,19,20,21.
En este estudio, se utilizó una tecnología patentada de expresión de proteínas de membrana S. cerevisiae 21, con S. cerevisiae ADΔ14 y ADΔΔ22 como los huéspedes preferidos(Figura 1A),para sobreexpresar y estudiar la principal bomba de eflujo multifármaco de C. albicans Cdr1. Ambas cepas de S. cerevisiae son derivados de AD1-8u-23 que tienen los genes ura3 (ADΔ) o ura3 e his1 (ADΔΔ) eliminados para eliminar cualquier falso positivo de uracilo o prototrofo de histidina que surja a través de la integración no deseada en los loci genómicos URA3 o HIS1. La eliminación de las 7 principales bombas de eflujo multifármaco23,indicadas en la Figura 1A, hace que ADΔΔ sea exquisitamente sensible a la mayoría de los xenobióticos. El factor de transcripción mutante de ganancia de función Pdr1-3 causa la sobreexpresión constitutiva de proteínas de membrana heterólogas como Cdr1 (octógonos rojos en la Figura 1A)después de la integración del casete de transformación heterólogo-ORF -contiene (Figura 1A) en el locus genómico PDR5 (rectángulo azul en la Figura 1A) a través de dos eventos de recombinación homólogos. La localización adecuada de la membrana plasmática de las proteínas marcadas con C-terminal mGFPHis se puede confirmar mediante microscopía confocal(Figura 1A),y la etiqueta His se puede utilizar para la purificación de afinidad de níquel de la proteína marcada. Sin embargo, la clonación de algunos transportadores de ABC fúngicos (por ejemplo, Candida krusei ABC1)en plásmidos derivados de pABC3 no fue posible porque no pudieron propagarse en Escherichia coli debido a la toxicidad celular. Esto provocó el desarrollo de la clonación de un solo paso de proteínas de membrana14,24 etiquetadas en su terminal N o C con varias etiquetas de afinidad, epítopo o reportero directamente en S. cerevisiae ADΔΔ(Figura 1C). S. cerevisiae Las cepas ADΔΔ que sobreexpresan varios mutantes CDR1 también se pueden crear de manera eficiente mediante el uso de hasta cinco fragmentos individuales de PCR que se superponen en 25 pb(Figura 1C). Empleando este protocolo, muchos ORF de interés pueden ser clonados, expresados y caracterizados a bajo costo y con alta eficiencia en un lapso de tiempo muy corto. La eficiencia de transformación se reduce solo ~ 2 veces con cada fragmento de PCR adicional. 
Si se desea, los niveles de expresión también pueden manipularse fácilmente mediante el diseño de imprimación para ajustar de manera predecible los niveles de expresión a cualquier lugar entre el 0,1% y el 50% de los niveles de expresión constitutiva generalmente altos25. El vector de clonación derivado pABC314 optimizado, multifuncional, pABC3-XLmGFPHis26 (Figura 1B) contiene un sitio de escisión de la proteasa HRV-3C (X; LEVLFQ| GP), una proteasa que funciona mejor a 4 °C que la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) de uso frecuente27. L es un enlazador de cinco aminoácidos (GSGGS), mGFP es un mutante monomérico (A206K)28,29 versión de la variante de proteína de fluorescencia verde mejorada por levadura yEGFP330,y el suyo es un enlazador de tres aminoácidos (GGS) seguido de la etiqueta de purificación de proteína de afinidad de níquel de seis histidinas (HHHHHH).
Esta tecnología de expresión se ha utilizado con éxito en el descubrimiento de fármacos y el estudio de proteínas de membrana. La primera estructura para un fármaco azol fúngico diana, S. cerevisiae Erg1131, se resolvió utilizando esta tecnología. También permitió la caracterización detallada de C. albicans Cdr132 , 33,34y la creación de una molécula de Cdr1 deficiente en cisteína35 adecuada para estudios de reticulación de cisteína para verificar cualquier estructura futura de alta resolución. Muchos otros transportadores ABC de los principales patógenos fúngicos humanos (es decir, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei y el complejo de especies Fusarium solani) también se han estudiado en detalle utilizando esta plataforma de expresión24,36,37,38,39. Esto ha permitido la generación de un panel de cepas de S. cerevisiae que sobreexpresan bombas de eflujo que se ha utilizado en pantallas de alto rendimiento para descubrir el nuevo sustrato de bomba de eflujo fluorescente Rojo del Nilorojo 40 y específico41 y de amplio espectro14,33,42,43,44 inhibidores de la bomba de eflujo. El uso de este sistema también permitió el descubrimiento de la clorgirina como el primer inhibidor de la bomba de eflujo multifármaco fúngico de amplio espectro de su tipo42.
La solubilización completa de las proteínas de membrana y la creación de una preparación homogénea de proteína-micela de membrana desprovista de lípidos endógenos, requiere altas concentraciones de detergente45. Pero desafortunadamente, esto también a menudo inactiva la proteína de membrana5,8,45,46. Las propiedades de los monómeros detergentes y su agregación en solución se ven afectadas por las propiedades físicas de la cola hidrofóbica, la longitud y ramificación de la cadena alquilo, la presencia de un núcleo aromático o cadena lateral de fluoroalquilo, o el número de unidades de polioxietileno. Por lo tanto, el cribado de detergente es un primer paso importante para determinar el detergente más adecuado para la solubilización y purificación de proteínas de membrana.
C. albicans es un importante patógeno fúngico humano de individuos inmunocomprometidos que puede causar infecciones invasivas graves y potencialmente mortales47, y puede volverse resistente a los medicamentos antimicóticos azoles48,49. Uno de los principales mecanismos de la resistencia a múltiples medicamentos de C. albicans es la sobreexpresión de Cdr150,que es untransportador de casete de unión a ATP (ABC) tipo II de la subfamilia ABCG ubicado en la membrana plasmática. Los transportadores ABCG fúngicos de tamaño completo (que consisten en dos dominios de unión a nucleótidos [NBD] y dos dominios transmembrana [TMD]) se conocen más comúnmente como transportadores de resistencia a medicamentos pleiotrópicos (PDR) y se caracterizan por su topología única de dominio invertido [NBD-TMD]2. Los transportadores PDR solo se encuentran en las plantas52,53 y hongos54. A pesar de su importancia, no hay estructuras para los transportadores PDR, aunque recientemente se han resuelto estructuras para transportadores ABCG humanos de tamaño medio, lo que ayudó a crear el primer modelo tentativo para Cdr133. Nuestra evidencia experimental reciente sugiere, sin embargo, que este modelo es defectuoso posiblemente porque los transportadores de PDR de hongos tienen NBD asimétricos característicos que resultan muy posiblemente en un mecanismo de transporte único. Por lo tanto, se requiere una estructura de alta resolución de Cdr1 tanto para el diseño racional de nuevos inhibidores de la bomba de eflujo que puedan ayudar a superar la resistencia a los medicamentos mediados por el eflujo, como para proporcionar información sobre el mecanismo de acción de esta importante familia de transportadores ABC.
El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos fiables para la expresión, solubilización y purificación de Cdr1 en el huésped de expresión de S. cerevisiae modificado genéticamente, con el objetivo final de obtener una estructura de alta resolución para Cdr1. Como parte de este proceso, se diseñó una doble etiqueta mGFPHis escindible con proteasa(Figura 1B)con un enlazador de 16 residuos que separa la etiqueta del extremo C de Cdr1, lo que mejoró la unión de la etiqueta de afinidad 6x His adjunta a la resina de afinidad de níquel y permitió el monitoreo de los niveles de expresión de Cdr1 en células vivas y durante todo el proceso de purificación. También se desarrolló un protocolo reproducible para preparaciones de proteínas de membrana plasmática de levadura a pequeña escala que contienen aproximadamente un 10% de C. albicans Cdr1 (según lo estimado por la tinción de Coomassie después de SDS-PAGE), que podría usarse para la caracterización bioquímica de Cdr1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Didecylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310S</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311S</td>
			<td>OGNG (MNG-OG)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG322S</td>
			<td>DMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl &#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Glycon Biochemicals GmbH</td>
			<td>D99019-C</td>
			<td>PCC-&#945;-M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>&#160;009002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13106-76-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP disodium salt</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A-6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>SERVA Electrophoresis GmbH</td>
			<td>34725-61-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPSO</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C317S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM minus uracil</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>DCS0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-butyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C324S</td>
			<td>CYMAL-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-1-heptyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C327S</td>
			<td>CYMAL-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl-methyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C321S</td>
			<td>CYMAL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11024-24-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10197785103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>78205</td>
			<td>A blend of exonuclease and phosphatase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003172510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>TOYOBO Co</td>
			<td>KFX-201</td>
			<td>Use for reliable colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithium acetate (LiAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>546-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexa-hydrate</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>145224-94-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>H110S</td>
			<td>HEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decanoyl-N-methyl-glucamide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>M320S</td>
			<td>MEGA-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F304S</td>
			<td>Fos-choline-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322S</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ312S</td>
			<td>Anzergent 3-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360S</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#945;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310HA</td>
			<td>&#945;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310S</td>
			<td>&#946;-DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N330S</td>
			<td>NM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ318S</td>
			<td>Anzergent 3-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AZ308S</td>
			<td>Anzergent 3-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F300S</td>
			<td>Fos-choline-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td>OG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F312S</td>
			<td>Fos-choline-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tetradecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T315S</td>
			<td>TDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-phosphocholine</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F310S</td>
			<td>Fos-choline-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Tridecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>T323S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Undecyl-&#946;-D-maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>U300S</td>
			<td>UM (UDM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>TRITON X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>3049-73-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion&#160;Hot Start Flex DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0535S</td>
			<td>High-fidelity DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene glycol (PEG 3350)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylenesorbitan monooleate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>TWEEN 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000122</td>
			<td>RC DC Protein Assay Kit II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB116028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-ascorbate BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350S</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>008013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>CYN0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Equipment (type)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160; (Eppendorf 5804)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Beckman Ultra)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Sorvall RC6)</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging (GelDoc EZ Imager)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection)</td>
			<td>BioTek Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR thermal cycler (C1000 Touch)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply (PowerPac)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator (Multitron)</td>
			<td>Infors HT, Bottmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GE17-5172-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro)</td>
			<td colspan="2">Amersham BioSciences UK Ltd</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

small-scale plasma membrane preparation for the analysis of candida albicans cdr1-mgfphis

El éxito de la caracterización bioquímica y biofísica de los transportadores ABC depende en gran medida de la elección del sistema de expresión heteróloga. En las últimas dos décadas, hemos desarrollado una plataforma de expresión de proteínas de membrana de levadura que se ha utilizado para estudiar muchas proteínas importantes de membrana fúngica. El huésped de expresión Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ se elimina en siete transportadores ABC endógenos principales y contiene el factor de transcripción Pdr1-3 con una mutación de ganancia de función que permite la sobreexpresión constitutiva de genes de proteínas de membrana heterólogas integradas de manera estable como copias individuales en el locus genómico PDR5. La creación de vectores plásmidos versátiles y la optimización de estrategias de clonación en un solo paso permiten la clonación, mutagénesis y expresión rápidas y precisas de transportadores ABC heterólogos. Aquí, describimos el desarrollo y el uso de una nueva etiqueta doble mGFPHis escindible con proteasa (es decir, la proteína fluorescente verde mejorada con levadura monomérica yEGFP3 fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad de seis histidinas) que fue diseñada para evitar la posible interferencia de la etiqueta con la proteína de interés y para aumentar la eficiencia de unión de la etiqueta His a las resinas de afinidad de níquel. La fusión de mGFPHis a la proteína de membrana ORF (marco de lectura abierto) permite una fácil cuantificación de la proteína mediante la inspección de geles de poliacrilamida y la detección de productos de degradación conservando la etiqueta mGFPHis. Demostramos cómo esta característica facilita el cribado con detergente para la solubilización de proteínas de membrana. Se presenta un protocolo para el aislamiento eficiente, rápido y confiable de las preparaciones de membrana plasmática a pequeña escala del transportador de eflujo multifármaco Cdr1 marcado con C-terminalmente marcado como Candida albicans Cdr1 sobreexpresado en S. cerevisiae ADΔΔ. Este protocolo de aislamiento de membranas plasmáticas a pequeña escala genera membranas plasmáticas de alta calidad en un solo día laborable. Las preparaciones de membrana plasmática se pueden utilizar para determinar las actividades enzimáticas de las variantes mutantes Cdr1 y Cdr1.

Se logró una alta frecuencia de transformación de S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x10 4 transformadores/μg) con pYES2(Figura 2B). Como era de esperar, el control sin ADN (es decir, ddH2O solamente) no dio transformadores, y 1 μg del casete de transformación lineal CDR1-mGFPHis (Figura 1A)dio ~ 50 transformadores(Figura 2C)con el protocolo de transformación ADΔΔ optimizado. Los transf...

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Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Este artículo presenta un protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala para la caracterización de la proteína Cdr1 cdr1 de Candida albicans ABC (casete de unión a ATP), sobreexpresada en Saccharomyces cerevisiae. Se diseñó una doble etiqueta mGFPHis C-terminal escindible con una etiqueta doble de 16 residuos entre Cdr1 y la etiqueta para facilitar la purificación y la detección de detergente de Cdr1.

Preparación de membrana plasmática a pequeña escala para el análisis de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

El protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala y la doble etiqueta mGFPHis proporcionan un método económico, rápido, confiable y fácil para caracterizar proteínas de membrana en el organismo modelo eucariota, Saccharomyces cerevisiae. La mayor ventaja de esta tecnología es la facilidad y velocidad con la que se pueden determinar los niveles de expresión de proteínas de membrana, las actividades del ATP y el detergente más adecuado para su purificación. Esta tecnología es muy fácil de usar.Sin embargo, un punto importante a recordar es cosechar células como OD 600 de 2, lo que garantiza una baja contaminación mitocondrial y las mayores actividades posibles de ATPasa. Comience por precultivar una sola colonia de levadura en 10 mililitros de medio YPD a 30 grados Celsius durante siete a ocho horas a 200 rotaciones por minuto. Utilice 10 mililitros de pre cultivo para inocular 40 mililitros de medio YPD fresco.Luego incubar las células a 30 grados Centígrados durante la noche a 200 rotaciones por minuto hasta que la densidad celular alcance un OD 600 de uno a tres. Al día siguiente, cosecha 40 unidades de densidad óptica, u ODU, de células logarítmicas de la cara mediante centrifugación a 4, 200 veces G por cinco minutos a cuatro grados Celsius. Vuelva a suspender y lavar las celdas con 40 mililitros de agua doble destilada estéril helada.Repita el lavado con un mililitro de agua helada con centrifugación entre los pasos de lavado. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de agua estéril helada y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado sobre hielo. Cosecha las células a 3.300 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de tampón homogeneizador recién suplementado con un milimolar fenal metil sulfa Neal fluoruro, o PMSF. Guarde la suspensión celular a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Descongelar las células en hielo durante aproximadamente una hora.Luego agregue perlas de sílice heladas de 0,5 milímetros de diámetro a los 500 microlitros de la suspensión celular para alcanzar un volumen total de un mililitro. Para romper las células, vórtice la suspensión celular a la máxima intensidad de agitación durante un minuto, durante seis ciclos, con un período de enfriamiento de tres minutos en hielo después de cada ciclo. Después del vórtice, haga un agujero delgado en la parte inferior del tubo con una cuchilla de bisturí calentada y recoja la célula rota homogeneizar en otro tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros helado con un giro de baja velocidad durante 10 segundos.Centrifugar la célula recolectada homogeneizar a 5, 156 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para eliminar los desechos celulares. Transfiera 450 microlitros de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga helada de 1,5 mililitros y agregue un mililitro de tampón homogeneizador helado complementado con un pmSF fresco milimolar. Para cosechar las membranas plasmáticas, centrifute la suspensión celular a 17, 968 veces G durante una hora a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón homogeneizador recién complementado con un PMSF milimolar. Luego afloje el pellet de membrana plasmática revolviendo con la punta de pipeta de 100 microlitros y vuelva a suspender el pellet repitiendo el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Mida la concentración de proteínas de la preparación de la membrana plasmática con un kit de ensayo de proteínas que sea compatible con tampones que contengan el agente reductor y el detergente.Guarde las membranas plasmáticas a menos 80 grados centígrados o manténgalas en hielo para su uso inmediato. Vierta de cuatro a cinco mililitros de gel separador en el aparato de gel ensamblado hasta dos centímetros de la parte superior. Coloque cuidadosamente de uno a dos mililitros de 0.1% SDS en la parte superior y permita que el gel de poli acrilamida se ajuste durante 60 minutos a temperatura ambiente.Después de una hora, retire la capa de SDS al 0,1% del gel separador polimerizado y enjuague el gel con agua destilada doble para eliminar los rastros de SDS. Vierta la mezcla de gel de apilamiento sobre el gel de separación. Coloque un peine en el gel de apilamiento y retire las burbujas de aire de alrededor del peine.Luego deje que el gel de apilamiento se ajuste durante 60 minutos a temperatura ambiente. Retire el peine y luego enjuague las ranuras de gel con agua. Coloque el gel en el tanque de gel y llene el tanque de gel hasta la parte superior con un amortiguador de funcionamiento.Mezcle de cinco a 10 microlitros de muestras de membrana plasmática con volúmenes iguales de dos veces el colorante de carga de proteínas e inmediatamente cargue la mezcla de muestra en ranuras de gel individuales, sumergidas en un tampón en funcionamiento. Cargue los marcadores de peso molecular de la proteína en el rango de 10 a 245 Kilodalton en una ranura separada para permitir la estimación del tamaño de fragmentos de proteínas individuales. Realice la electroforesis en gel a 200 voltios hasta que el tinte de carga azul llegue al fondo del gel.Examine el gel para la fluorescencia GFP en gel con un sistema de imágenes en gel. Después de las imágenes fluorescentes, fije las proteínas en 10 a 20 mililitros de solución fijadora de gel de proteína mediante agitación suave del gel durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego enjuague dos veces durante 10 minutos con 10 mililitros de agua destilada doble y coloque el gel en 10 mililitros de solución de tinción coloidal de Kumasi con agitación suave durante una hora a temperatura ambiente para visualizar las bandas de proteínas.Para una mejor visualización de las bandas de proteínas, desmante el gel una o dos veces en 20 mililitros de agua destilada doble durante una hora antes de grabar imágenes con el sistema de imágenes en gel. Se logró una alta frecuencia de transformación de Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta con el plásmido de control positivo PS2. No se obtuvieron transformadores Eurocell Prototron para el control negativo.Se obtuvieron alrededor de 50 células URA prototrofas CDR1-mGFPHis transformantes después de incubar células transformadas AD Delta Delta en placas CSM menos URA durante tres días. Se eliminó el pequeño transformador que no puede crecer en las placas de agar YPG. Las muestras de CDR1-mGHPHis con concentraciones variables se cuantificaron con fluorescencia en gel.Las intensidades de fluorescencia mGFP fueron lineales en todo el rango de concentración con una fluorescencia de fondo mínima. Variar la densidad celular indicó que la ruptura de 40 ODU de células produjo la más alta calidad de membranas plasmáticas con la mayor actividad de CDR1 ATPasa. Sin embargo, el rendimiento de las membranas plasmáticas aumentó en proporción al aumento de las densidades celulares.La capacidad de 31 detergentes con diversas propiedades para solubilizar CDR1-mGHPHis a partir de membranas plasmáticas crudas de células AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis se probó con la página SDS. Beta y alfa DDM y Fos-colina 13 fueron los mejores detergentes para solubilizar CDR1-mGHPHis. Sin embargo, Fos-colina 13 causar hidrólisis parcial de CDR1-mGHPHis.La proteína de membrana plasmática cruda solubilizada con detergente al 1% se separó utilizando una columna de exclusión de tamaño superos seis aumentado de 10 300 GL. Los cromatogramas de maltósidos y proteínas extraídas de LMNG mostraron que la mayoría de los CDR1-mGHPHi eludían como un pico gaussiano de buena forma a 15,5 milímetros CDR1-mGHPHis solubilizados con detergentes que contenían glucosa aludidos como un pico agregado o agregado amplio. Los picos más altos para DDM indicaron que una gran parte de DMN G solubilizada CDR1-mGHPHis puede ser desnaturalizada.En los cromatogramas FSCC para fos-colinas zwitteriónicas y dos detergentes no iónicos sólo Digitonin y dio un cromatograma similar a DDM. Fos-colina 13 dio un pico simétrico de forma afilada, pero aludió con un volumen de elución significativamente más bajo que el de DDM. La doble etiqueta optimizada también mejoró el rendimiento de purificación y ayudó a determinar la localización, el tráfico y la estabilidad térmica de las proteínas de membrana.La tecnología de expresión heteróloga también se puede utilizar en la detección de fármacos de alto rendimiento y en la caracterización detallada de muchas otras proteínas de membrana.

Research

JoVE Journal

Biology

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Investigación

Biología

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Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

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Perfil de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en Candida albicans: un método cut&amp;RUN completo y un flujo de trabajo de análisis de datos

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